BD BBL TM CHROMagar TM CPE

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1 GEBRAUCHSANWEISUNG GEBRAUCHSFERTIGE PLATTENMEDIEN BD BBL TM CHROMagar TM CPE PA Rev.: Januar 2017 VERWENDUNGSZWECK BD BBL CHROMagar CPE ist ein selektives chromogenes Screening-Medium für den Nachweis von Carbapenemase-produzierenden Enterobacteriaceae (CPE). Geeignete Proben sind Rektal- und Perianalabstriche und verschiedene andere klinische Proben (siehe Probenarten). Zusätzlich ermöglicht das Medium die Identifizierung von E. coli ohne weitere Bestätigungstests und den Nachweis der Klebsiella-Enterobacter-Citrobacter-Serratia- und Proteus-Morganella-Providencia-Organismusgruppen. Für die in diesem Medium erhaltenen Isolate muss durch zusätzliche Tests bestätigt werden, dass sie Carbapenemase-Produzenten sind. GRUNDLAGEN UND ERLÄUTERUNG DES VERFAHRENS Carbapenem-Resistenz in gramnegativen Bakterien ist ein zunehmendes Problem bei nosokomialen Infektionen. Die Resistenz kann verschiedene Ursachen haben, die häufigste ist jedoch die weltweite Dispersion Carbapenemasen-produzierender Bakterien, die in der Lage sind, sowohl Carbapeneme als auch andere Beta-Lactamantibiotika zu hydrolysieren. Gene, die Carbapenemasen kodieren, befinden sich in der Regel auf Plasmiden, die sogar auf andere Spezies übertragen werden können. Das diagnostische Verfahren ist komplex, daher ist es wichtig, den Nachweis dieser Carbapenem-resistenten Bakterien zu verkürzen und zu vereinfachen. 1-3 BBL CHROMagar CPE basiert auf BBL CHROMagar Orientation (BBL CHROMagar- Orientierung), das ursprünglich von A. Rambach, CHROMagar, Paris, Frankreich, entwickelt wurde. BD hat im Rahmen eines Lizenzabkommens die Rezeptur optimiert und dabei geistiges Eigentum genutzt, das aus der Produktion des gebrauchsfertigen Plattenmediums BBL CHROMagar Orientation stammt. Speziell ausgewählte Peptone liefern die Nährstoffe in BBL CHROMagar Orientation Medium (BBL CHROMagar Orientierungsmedium). Die Chromogenmischung besteht aus künstlichen Substraten (Chromogenen), welche beim Abbau durch spezifische mikrobielle Enzyme verschiedenfarbige Verbindungen freisetzen, und so die direkte Differenzierung von bestimmten Spezies oder den Nachweis von bestimmten Gruppen von Organismen mit einem Minimum an Bestätigungstests sicherstellen. Durch die Entwicklung verschiedener Farben ermöglicht das chromogene Medium in BBL CHROMagar CPE den einfachen Nachweis von Mischkulturen Gramnegativer Bakterien, die Identifizierung von E. coli (rosa bis hellviolett) ohne weitere Bestätigungstests, den Nachweis der Klebsiella- Enterobacter-Citrobacter-Serratia (blau bis blaugrün) sowie Proteus-Morganella-Providencia (farblos bis gelbbraun und gelbbraun bis zu blassblauen Kolonien umgeben von braunen Höfen) und anderen Gattungen (erscheinen in ihrer natürlichen Farbe). BBL CHROMagar CPE enthält ein Carbapenem in einer geeigneten Konzentration, um den Nachweis der Resistenz zu ermöglichen, zusammen mit anderen selektiven Stoffen zur Hemmung der begleitenden Flora in der Probe. Wenn gramnegative Bakterien wie Enterobacteriaceae und Nicht-Fermenter gegen die enthaltenen antimikrobiellen Substanzen resistent sind, produzieren sie Wachstum auf dem Medium. Der konvetionelle phänotypische Nachweis von Carbapenemase-produzierenden Pathogenen erfordert die Isolierung des Stamms in Reinkultur auf nicht selektiven Medien gefolgt von mehreren Empfindlichkeitstests zur Ermittlung des Resistenztypen. Dieser Vorgang ist zeitaufwendig und teuer. Die Probe wird unter Verwendung von BBL CHROMagar CPE auf dem Medium ausgestrichen. Nach einer Inkubation über Nacht (18 bis 24 Stunden) zeigt das Wachstum eines Isolats auf PA Seite 1 von 7

2 dem Medium sehr eindeutig das Vorliegen von Enterobacteriaceae, die resistent gegen Carbapeneme sind. Es ist eine Bestätigung durch Empfindlichkeitstests, molekulare oder phänotyische Methoden erforderlich. Im Vergleich zu nicht selektiver Isolation, gefolgt von Empfindlichkeitstests, reduziert die Verwendung dieses Produkts die Arbeitsbelastung und beschleunigt die Zeit für den Nachweis von CPE. REAGENZIEN BBL CHROMagar CPE Zusammensetzung* pro 1 Liter destilliertem Wasser Chromopepton 16,1 g Chromogenmischung 1,3 Selektive Agenzien 0,23 Agar 15,0 ph 6,8 ± 0,2 *Nach Bedarf auf die Leistungskriterien abgestimmt und/oder ergänzt. SICHERHEITSHINWEISE Nur zum Gebrauch durch Fachpersonal. Platten bei Anzeichen von mikrobieller Kontamination, Verfärbung, Austrocknung, Rissbildung oder bei sonstigen Anzeichen einer Qualitätsverschlechterung nicht verwenden. Hinweise zu Verfahren unter Einhaltung aseptischer Arbeitsweise, Biogefährdung und Entsorgung des gebrauchten Produkts sind den ALLGEMEINEN GEBRAUCHSANLEITUNGEN zu entnehmen. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Nach Erhalt Platten bis unmittelbar vor dem Gebrauch im Dunkeln in der Originalverpackung bei 2 8 C lagern. Einfrieren und Überhitzen vermeiden. Die Platten können bis zum Verfallsdatum (siehe Kennzeichnung auf der Verpackung) inokuliert und entsprechend den empfohlenen Inkubationszeiten inkubiert werden. Platten aus bereits geöffneten 10er Packungen können bei Lagerung bei 2 8 C in einem sauberen, dunklen Bereich bis zu einer Woche verwendet werden. Vor und während der Inkubation vor Lichteinwirkung schützen, da Licht die Chromogene zerstören könnte. QUALITÄTSSICHERUNG DURCH DEN ANWENDER Repräsentative Proben mit den nachfolgend aufgeführten Stämmen inokulieren (detaillierte Informationen siehe Probenarten und Testverfahren). Platten h bei C bevorzugt in umgedrehter Position aerob inkubieren. Stämme Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705 (KPC-Produzent) Klebsiella pneumoniae NCTC (NDM-1-Produzent) Escherichia coli NCTC (IMP-Produzent) Klebsiella pneumoniae ATCC Enterococcus faecalis ATCC Staphylococcus aureus ATCC Candida albicans ATCC Nicht inokuliert Wachstum Wachstum mäßig bis ausgezeichnet; blaue bis blau-grüne Kolonien Wachstum mäßig bis ausgezeichnet; blaue bis blau-grüne Kolonien Wachstum mäßig bis sehr gut; rosa bis hellviolette Kolonien Farblos bis hell bernsteinfarben, transparent VORGEHENSWEISE Mitgeliefertes Arbeitsmaterial BBL CHROMagar CPE (90 mm Stacker-Doppelplatten). Mikrobiologisch kontrolliert. PA Seite 2 von 7

3 Nicht mitgeliefertes, jedoch benötigtes Arbeitsmaterial Zusätzliche Kulturmedien, Reagenzien und Laborgeräte. Probenarten Dieses Produkt wird hauptsächlich zum Nachweis der Kolonisierung durch Carbapenemaseproduzierende Stämme zur Unterstützung bei der Prävention und Kontrolle von CPE- Infektionen im Gesundheitsbereich, insbesondere auf Intensivstationen, verwendet. Es wird hauptsächlich mit Rektal- und Perianalabstrichen verwendet, kann jedoch auch mit Proben von anderen Körperstellen verwendet werden, die im Verdacht stehen, Carbapenemaseproduzierende Enterobacteriaceae zu enthalten. Es wird die Verwendung speziell für die Entnahme von mikrobiologischen klinischen Proben zugelassener Transportbehälter empfohlen. Halten Sie sich an die Anweisungen des Herstellers dieser Transportbehälter. 4,5 Es kann auch verwendet werden, um potenzielle CPE-Stämme von anderen Medien zu subkultivieren. Eine direkte Inokulation mit Kolonien wird nicht empfohlen. Zur Vermeidung einer zu starken Inokulation sollten die Kolonien zunächst in Kochsalzlösung suspendiert (siehe Testverfahren) und eine Impföse auf dem Medium ausgestrichen werden. Testverfahren BBL CHROMagar CPE muss direkt ohne Voranreicherung vom Abstrichtupfer oder von einer isolierten, in Kochsalzlösung suspendierten Kolonie inokuliert werden, um eine McFarland- Trübung von ca. 0,5 zu erreichen. Eine direkte Inokulation aus isolierten Kolonien wird nicht empfohlen, da der hohe Inokulumspiegel in seltenen Fällen falsche positive Ergebnisse liefern kann. Die Probe mit einem Tupfer oder einer Impföse auf das BBL CHROMagar CPE-Medium inokulieren und mit einer Impföse zur Isolierung ausstreichen. Die folgende Vorgehensweise zur Inokulation muss strikt eingehalten werden, um isolierte Kolonien mit ihrem typischen Erscheinungsbild zu erhalten. Unzureichende Inokulation oder Inokulation der gesamten Fläche des Mediums ausschließlich mit Tupfern (ohne Verwendung von Impfösen zur Isolierungsausstreichung) kann zu falschen Ergebnissen führen oder die Platte unleserlich machen. Immer nur eine Probe pro Platte inokulieren. Verfahren zur Inokulation und Inkubation: 1. Den Abstrichtupfer auf einen kleinen Bereich des BBL CHROMagar CPE-Mediums tupfen: Nicht übermäßig inokulieren! Den Abstrichtupfer vom Medium entfernen und den Abstrichtupfer wieder in das Probenröhrchen zurückstecken. 2. Das Ausstreichen auf der Platte mit Impfösen abschließen. Zur Isolierung ausstreichen! Zunächst den ersten Ausstrichbereich abschließen und dann den zweiten und dritten Bereich des Mediums ausstreichen. 3. Bei 35 bis 37 C für 18 bis 24 Stunden bevorzugt in umgedrehter Position (Medium-Seite nach oben) aerob inkubieren. Nicht länger und nicht in einer mit Kohlendioxid angereicherten Atmosphäre inkubieren. Während der Inkubation vor Lichteinwirkung schützen, da Licht die Chromogene zerstören könnte. Sobald sich die Farben der Kolonien entwickelt haben, ist Lichteinwirkung erlaubt. 4. Platten ablesen, wie unter Ergebnisse und Interpretation beschrieben. Abhängig von Typ und Zweck der Probe müssen andere Medien ebenfalls inokuliert werden, um einen vollständigen Nachweis aller enthaltenen Pathogene zu erbringen. Solche Medien enthalten mindestens eine nicht selektive Blutagarplatte. Ergebnisse und Interpretation Nach der Inkubation zeigen die Proben mit Isolaten, die gegen die in dem Medium enthaltenen Inhibitoren resistent sind, ein Wachstum. Die Platte sollte in den Bereichen mit korrekt verdünntem Inokulum isolierte Kolonien aufweisen. Es müssen geeignete Empfindlichkeitsprüfungen, molekulare oder phänotypische Verfahren ausgeführt werden, um das Vorhandensein von CPE-Isolaten zu bestätigen. PA Seite 3 von 7

4 Wenn auf dem Medium kein Wachstum vorhanden ist, bedeutet dies, dass die Probe keine Stämme mit Resistenz gegen die antimikrobiellen Substanzen enthält, die im Medium vorhanden sind. Es ist zu beachten, dass die Verfärbung des Mediums ohne sichtbare Kolonien (was auftreten kann, wenn das Medium übermäßig mit Stuhlproben oder extrem hohen Bakterienbesiedlungen inokuliert wurden) als negatives Ergebnis betrachtet wird (siehe auch Verfahrensbeschränkungen). Differenzierung und/oder Identifizierung der Isolate nach Farbe und Erscheinungsbild der Kolonie. Rosafarbene bis pinkfarbene (hellviolette) Kolonien: Escherichia coli; ein optionaler Indol- Test unter Verwendung von BD BBL DMACA Indole Reagent Droppers (DMACA- Tropfpipetten für Indol-Reagenz) (Best.-Nr ) kann auf Filterpapier durchgeführt werden, um E. coli (indol-positiv) zu bestätigen. Das Indol-Reagenz nicht auf die Oberfläche des Mediums auftragen! Hinweis: Bestimmte Citrobacter freundii-stämme produzieren violette bis lilafarbene Kolonien auf BBL CHROMagar CPE. Für solche Stämme wird eine biochemische Identifizierung empfohlen. Blaue bis blaugrüne Kolonien, die von einer rosafarbenen bis hellvioletten Zone umgeben sein können, aber nicht müssen: Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter oder andere. Zur weiteren Identifizierung sind zusätzliche Tests erforderlich. Für weitere Einzelheiten ist die Gebrauchsanweisung für BBL CHROMagar Orientation zu beachten (siehe: Farblose bis gelbbraune und gelbbraune bis blassblaue Kolonien mit bräunlichen Höfen, die in das Medium hineinreichen: Proteus-, Morganella-, Providencia-Stämme. Zur vollständigen Identifizierung sind zusätzliche Tests erforderlich. Für weitere Einzelheiten ist die Gebrauchsanweisung für BBL CHROMagar Orientation zu beachten (siehe: In seltenen Fällen produziert Pseudomonas aeruginosa diffusible braungefärbte Pigmente, die Proteus imitieren. Zur Differenzierung kann ein Oxidasetest durchgeführt werden (siehe unten). Farblose Kolonien: Oxidasetest durchführen: Ist dieser Test positiv, und es wird der typische fruchtige Geruch und/oder die grünliche, bläuliche oder bräunliche Pigmentierung (aufgrund des Organismus-eigenen Pigments) wahrgenommen Pseudomonas aeruginosa. Für diesen Test wird die Verwendung von BD Oxidase Reagent Droppers (BD Tropfpipetten für Oxidase-Reagenz) (Best.-Nr ) empfohlen. Den Oxidasetest auf Filterpapier durchführen, wie in der Gebrauchsanweisung für diesen Test beschrieben, jedoch nicht auf den Kolonien auf der Platte. Es wird eine Bestätigung durch zusätzliche Tests empfohlen. Zur Ermittlung des exakten Resistenzmusters sollten alle Isolate von P. aeruginosa von diesem Medium mit zugelassenen Methoden auf Empfindlichkeit getestet werden. Wenn die Oxidase negativ oder zweideutig ist, vollständige biochemische ID durchführen. Farblose Oxidase-negative Kolonien können Nonfermenter wie Acinetobacter oder Enterobacteriaceae enthalten, die keine der vorhandenen Chromogene metabolisieren, wie zum Beispiel Salmonella. Mischkulturen auf der BBL CHROMagar CPE-Platte: Sie können meist anhand der verschiedenen Farben einfach erkannt und voneinander unterschieden werden. So zeigt eine Mischkultur von Klebsiella und E. coli blaue Kolonien (Klebsiella) sowie rosa bis hellviolette Kolonien (E. coli). Platten auf das Vorhandensein verschiedener Kolonietypen und -farben untersuchen. Wenn mehr als zwei verschiedene Kolonietypen oder -farben auf der Platte vorhanden sind, wird die Anlage von Subkulturen auf BBL CHROMagar CPE empfohlen. PA Seite 4 von 7

5 LEISTUNGSMERKMALE UND VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN BBL CHROMagar CPE ist ein selektives chromogenes Screening-Medium zur direkten Identifizierung und Differenzierung von Carbapenemase-produzierenden Enterobacteriaceae. Das Medium ermöglicht die direkte biochemische Identifizierung von resistenten E. coli sowie die Differenzierung anderer Enterobacteriaceae nach Koloniefarbe. Grampositive Bakterien und Hefen werden normalerweise gehemmt. 6 Für die in diesem Medium erhaltenen Isolate müssen zur Bestätigung der Carbapenemase- Produktion zusätzliche Tests durchgeführt werden. Nachweis der Resistenz Stämme der folgenden Resistenztypen wurden auf BBL CHROMagar CPE nachgewiesen: Tabelle 1: Auf BD BBL CHROMagar CPE getestete Stämme und nachgewiesene Resistenztypen 6 : Stamm Carbapenemase- Klasse (Ambler-Klasse) Carbapenemase Acinetobacter baumanii NDM-1, NDM-2 VIM IMP-1 SIM-1 OXA-23, OXA-24, OXA-40, OXA-51, OXA-58, OXA-64, OXA-72, OXA-91, OXA-97, OXA-143 Acinetobacter sp. VIM-4 Acinetobacter junii IMP-1 Citrobacter freundii Klasse A KPC-2, KPC-3 NDM-4 IMP-4 OXA-48, OXA-181 Citrobacter koseri OXA-48 Klebsiella pneumoniae Klasse A KPC, KPC-1, KPC-2, KPC-3 NDM, NDM-1 VIM, VIM-1, VIM-4, VIM-19 IMP-1, IMP-4, IMP-8 OXA-48, OXA-162, OXA-163, OXA-181 Klebsiella oxytoca Klasse A KPC-2, KPC-3 VIM, VIM-4 Escherichia coli Klasse A KPC, KPC-2, KPC-3, KPC-4, KPC-5 NDM, NDM-1, NDM-4 VIM, VIM-4, VIM-19 IMP, IMP-1, IMP-8 OXA-48 Enterobacter asburiae Klasse A IMI-2 Enterobacter cloacae Klasse A KPC, KPC-2, KPC-3, KPC-4 NDM, NDM-1, NDM-4 VIM-4 IMP-8 OXA-48, OXA-163 PA Seite 5 von 7

6 Enterobacter sp. NDM Proteus mirabilis NDM-1 Providencia rettgeri NDM, NDM-1 Providencia stuartii NDM-1 OXA-48, OXA-181 Pseudomonas aeruginosa Klasse A KPC-2, KPC-5 VIM-1, VIM-2, VIM-4, VIM-13 IMP-7 Salmonella spp. IMP-4 Serratia marcescens Klasse A KPC, KPC-2 Verfahrensbeschränkungen Immer nur eine Probe pro Platte inokulieren! SME-1, SME-2 IMP-1 OXA-48 Während die biochemische Identifizierung der Spezies oder Gruppenkonzentration (basierend auf den chromogenischen Reaktionen des Mediums) endgültig ist, muss die Resistenz mit genehmigten Empfindlichkeits-Testmethoden bestätigt werden. Die Identifizierung blauer, blaugrüner und farbloser Isolate auf der Spezies-Ebene muss mithilfe biochemischer Tests durchgeführt werden. Bestimmte grampositive Bakterien können gegen die Inhibitoren resistent sein und Wachstum auf dem Medium zeigen. Carbapenem-resistente gramnegative Stäbchen, die nicht zur Familie der Enterobacteriaceae gehören (z.b. Acinetobacter spp. and Pseudomonas spp.), können auf dem Medium (in ihrer natürlichen Farbe erscheinend) wachsen. Isolate mit farblosen Kolonien beim Screening für Carbapenem-resistente Organismen auf diesem Medium sollten nicht ignoriert werden. Oxidasetest für diese Isolate durchführen. Wenn dieser Test negativ ausfällt, eine vollständige biochemische Identifizierung des Isolats durchführen. Zur weiteren Differenzierung siehe VORGEHENSWEISE Ergebnisse und Interpretation. Auch wenn ein Inhibitor für Produzenten von AmpC zu dem Medium hinzugefügt wurde, zeigt ein bestimmter Prozentsatz solcher Stämme ein Wachstum. Aus diesem Grund wird BBL CHROMagar CPE für das Screening und nicht zur endgültigen Identifizierung von Carbapenemase-Produzenten empfohlen. Es sind spezifische Empfindlichkeitstests oder molekulare Verfahren zu Ermittlung des exakten Resistenztyps erforderlich, der von den Isolaten gezeigt wird. Da die Isolierung von CPE-Stämmen von der Anzahl der Organismen in der Probe abhängt, sind zuverlässige Ergebnisse nur dann möglich, wenn die Entnahme, Handhabung und Aufbewahrung der Proben (siehe VERFAHREN Probenarten) sachgemäß durchgeführt werden. Eine hohe Bakterienbesiedlung und/oder bestimmte Proben können zu einer nichtspezifischen Färbung des primären Ausstrichbereichs des Mediums führen. Dies kann zu einer hellvioletten, purpurnen, grünen oder blauen Färbung bzw. zu einem leichten Schleier auf dem Medium führen, jedoch ohne eindeutige Kolonien. Dies ist als negativ zu interpretieren. Nicht kürzer als 18 Stunden inkubieren, da dies zu kleinen Kolonien und / oder schwacher Verfärbung der Kolonien führen kann; die ideale Inkubationszeit beträgt 18 bis 24 Stunden. PA Seite 6 von 7

7 Die Inkubationszeit sollte nicht länger als 28 Stunden sein; bei Mischkulturen kann eine längere Inkubationszeit zu verschmelzenden Kolonien führen, die unter Umständen schwer zu erkennen und zu reinigen sind. Vor der erstmaligen Verwendung von BBL CHROMagar CPE wird empfohlen, sich das typische Erscheinungsbild der Kolonien mit Hilfe von definierten Stämmen (z. B. den unter QUALITÄTSSICHERUNG DURCH DEN ANWENDER erwähnten Stämmen) einzuprägen. LITERATUR 1. Akova, M., Daikos, G.L., Tzouvelekis, L. and Y. Carmeli. Interventional strategies and current clinical experience with carbapenemase-producing Gram-negative bacteria. Clinical Microbiology and Infection : Thomson, K.S. Extended-Spectrum-β-lactamase, AmpC, and Carbapenemase Issues. Journal of Clinical Microbiology : Nordmann, P., Dortet, L. and L. Poiret. Carbapenem resistance in Enterobacteriaceae: here is the storm! Trends in Molecular Medicine : Linscott, A.J Specimen collection and transport. In L.S. Gracia, and H.D.Isenberg, (eds.), Clinical microbiology procedures handbook, 2 nd ed. ASM, Washington DC. 5. Miller, J.M., K. Krisher, and H.T. Holmes General principles of specimen collection and handling. In P.R. Murray, E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.L. Landry and M.A. Pfaller (eds.), Manual of clinical microbiology. 9 th ed., ASM, Washington DC. 6. Unterlagen liegen vor. Becton Dickinson GmbH. VERPACKUNG/LIEFERBARE PRODUKTE BD BBL CHROMagar CPE Best.- Nr. Beschreibung REF Gebrauchsfertige Plattenmedien, 20 Platten WEITERE INFORMATIONEN Weitere Informationen erhalten Sie bei Ihrer örtlichen BD-Vertretung. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse Heidelberg/Deutschland Tel.: Fax: [email protected] ATCC ist eine Marke der American Type Culture Collection. CHROMagar ist eine Marke von Dr. A. Rambach. BBL, BD, das BD-Logo, Difco und Stacker sind Marken von Becton, Dickinson and Company Becton, Dickinson and Company PA Seite 7 von 7