BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA)

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1 BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA) I Rev. 10 Januar 2015 MASSNAHMEN ZUR QUALITÄTSKONTROLLE EINFÜHRUNG Anaerober CDC-Agar mit 5 % Schafblut und Phenylethylalkohol (PEA) ist ein angereichertes Kulturmedium zur selektiven Isolierung obligat anaerober Bakterien aus Mischkulturen. II LEISTUNGSPRÜFUNG 1. Über Nacht alle anaerobischen Agarplatten bei Raumtemperatur in einem anaeroben BD GasPak EZ-System reduzieren. 2. Vorbereitung der Inokulate a. Die obligat anaeroben Testkulturen vorbereiten. Hierzu einen Abstrich des Wachstums einer 2 bis 5 Tage alten, anaeroben CDC-Agarplatte mit 5 % Schafblut in ein Röhrchen mit 5 ml reduziertem, angereicherten Thioglykolat-Medium geben, das Vitamin K 1 und Hämin enthält. Gut mischen und auf eine Trübheit einstellen, die dem McFarland-Standard 0,5 entspricht. HINWEIS: Ein schneller Umgang mit den Kulturen ist erforderlich, um zu vermeiden, dass diese längere Zeit dem Sauerstoff ausgesetzt sind. Der Sauerstoffkontakt sollte 20 min nicht übersteigen. b. 18 bis 24 h alte Bouillonkulturen des fakultativ anaeroben Organismus nehmen und im Verhältnis 10-1 verdünnen. 3. Inokulation der Platten a. Mit einem volumetrischen Pipettor oder einer vergleichbaren Methode 0,05 ml eines geeigneten Inokulums auf die Plattenmedienproben übertragen und zur Isolierung ausstreichen. Für Proteus mirabilis eine Verdünnung der Bouillonkultur im Verhältnis 10-3 als Inokulum verwenden. b. Zusätzlich Trypticase-Soja-Agarplatten mit 5 % Schafblut (TSA II) als Kontrollen für alle Organismen und anaerobe CDC-Agarplatten mit 5 % Schafblut als Kontrollen für die obligaten Anaerobier verwenden. c. Die TSA II-Plattenkontrollen aerob bei 35 ± 2 C und alle anderen Platten anaerob (BBL anaerobes BD GasPak EZ-System) bei 35 ± 2 C inkubieren. 4. Alle inokulierten Platten nach 48 bis 72 h auf Wachstum, Koloniegröße, Pigmentierung und Hämolysereaktionen überprüfen. Den Porphyromonas-Stamm unter UV-Licht (365 nm) auf Fluoreszenz überprüfen. 5. Zu erwartende Ergebnisse *Bacteroides fragilis ATCC *Clostridium perfringens ATCC *Peptostreptococcus anaerobius ATCC Porphyromonas levii ATCC Escherichia coli ATCC *Proteus mirabilis ATCC Wachstum Wachstum, Beta-Hämolyse Mäßiges bis starkes Wachstum nach 72 h. Die Kolonien sind gebrochen weiß bis gelbbraun, erhaben und kreisförmig am gesamten Rand. Mäßiges bis starkes Wachstum nach 72 h. Die Kolonien sind gebrochen weiß bis gelbbraun, vollständig kreisförmig, konvex und blickdicht. Unter UV-Licht hellrosa bis orange bis ziegelrot fluoreszierend.** Anzeichen von starkem Wachstum; die Koloniegröße ist im Vergleich zur nichtselektiven Kontrolle reduziert. Die Kolonien sind grau, schwach konvex, feucht, halb blickdicht mit einer glänzenden Oberfläche. Anzeichen von starkem Wachstum; das Ausschwärmen ist im Vergleich zur nichtselektiven Kontrolle gehemmt. Die Kolonien sind hellgrau, kreisförmig, durchscheinend bis blickdicht. * Empfohlener Stamm des Mikroorganismus zur Qualitätssicherung durch den Anwender. ** Die Fluoreszenz ist nur bei jungen Kolonien zu sehen. Pigment entwickelt sich langsam und kann die Fluoreszenz verdecken. 1

2 III ZUSÄTZLICHE QUALITÄTSKONTROLLE 1. Die Agarplatten, wie unter Haltbarkeit des Produkts beschrieben, begutachten. 2. Die repräsentativen Agarplatten auf sichtbare Beschädigungen prüfen, durch die ihre Verwendung beeinträchtigt werden könnte. 3. Den ph-wert mit dem Potentiometer bei Raumtemperatur darauf überprüfen, ob ein Bereich von 7,5 ± 0,2 eingehalten wird 4. Die Festigkeit der Agarplatten während der Inokulation beachten. 5. Unbeimpfte repräsentative Agarplatten 72 h bei 35 ± 2 C inkubieren und auf mikrobielle Kontamination untersuchen. PRODUKTINFORMATIONEN IV VERWENDUNGSZWECK Anaerober CDC-Agar mit 5 % Schafblut und Phenylethylalcohol dient zur selektiven Isolierung hochselektiver und langsam wachsender, obligat anaerober Bakterien aus einer Vielzahl klinischer und nichtklinischer Materialien. V ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG Die Isolierung obligat anaerober Bakterien aus klinischen und nichtklinischen Materialien erfordert die Verwendung selektiver, nichtselektiver und angereicherter Medien. 1 Die Wahl der einzusetzenden Medien ist abhängig vom Probentyp und den Ergebnissen der direkten mikroskopischen Betrachtung. Nichtselektive Medien werden zur Isolierung von Organismen in geringer Zahl verwendet sowie zum Nachweis der Anzahl und des Typs von Organismen in der Probe. Selektive Medien werden eingesetzt, um die Gewinnung des gewünschten Organismus aus den Mischpopulationen zu vereinfachen. Anaerober CDC-Agar mit 5 % Schafblut und Phenylethylalkohol wurde von Dowell et al. des Centers for Disease Control and Prevention als angereichertes, selektives Medium zur Isolierung und Kultivierung von obligaten anaeroben Bakterien aus klinischen Materialien entwickelt, die schnell wachsende, fakultativ anaerobe Bakterien, wie beispielsweise Proteus und andere Mitglieder der Familie der Enterobacteriaceae, enthalten. 2 Für das Medium wird BBL Trypticase-Soja-Agar, angereichert mit zusätzlichem Agar, Hefeextrakt, Vitamin K 1, Hämin, Cystin, 5 % Schafblut und Phenylethylalkohol, verwendet. VI VERFAHRENSGRUNDLAGEN Anaerober CDC-Agar mit 5 % Schafblut und Phenylethylalkohol ist ein sehr nährstoffreiches Medium, da es Peptone, Hefeextrakt, Hämin, Vitamin K 1 und Schafblut enthält. Die Peptone liefern stickstoffhaltige Wachstumsfaktoren, Kohlenstoff, Schwefel und andere Spurenelemente. Hefeextrakt ist eine wichtige Quelle für B-Vitamine. Natriumchlorid wahrt das osmotische Gleichgewicht. Schafblutbestandteile, Hämin, Cystin und Vitamin K 1 liefern die von bestimmten obligaten Anaerobiern benötigten Wachstumsfaktoren. 3-7 Die Selektivität wird erreicht durch die Zugabe von Phenylethylalkohol, der das Wachstum fakultativ anaerober, gramnegativer Bakterien reduziert ohne dabei das Wachstum obligat anaerober Bakterien zu hemmen. 8 VII REAGENZIEN CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol Ungefähre Zusammensetzung* pro L destilliertem Wasser Pankreatisch abgebautes Casein... 15,0 g Papainisch abgebautes Sojamehl... 5,0 g Natriumchlorid... 5,0 g Agar... 20,0 g Hefeextrakt... 5,0 g Hämin... 0,005 g Vitamin K ,01 g L-Cystin... 0,4 g Phenylethylalkohol... 2,5 g Defibriniertes Schafblut... 5 % *Nach Bedarf abgestimmt und/oder ergänzt auf die geforderten Testkriterien. 2

3 Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen In-vitro-Diagnostikum. Wenn übermäßige Feuchtigkeit vorhanden ist, das Unterteil umdrehen, versetzt auf den Deckel legen und in der Luft trocknen lassen, um zu verhindern, dass während der Inkubation eine Abdichtung zwischen dem Deckel und dem Unterteil entsteht. Klinische Proben können pathogene Mikroorganismen, wie z.b. Hepatitis-Viren und HIV, enthalten. Beim Umgang mit allen mit Blut oder anderen Körperflüssigkeiten kontaminierten Artikeln sind die Allgemeinen Vorsichtsmaßnahmen 9-12 sowie die einschlägigen Institutionsrichtlinien zu beachten. Gebrauchsfertige Agarplatten, Probenbehälter und sonstige kontaminierte Materialien nach der Verwendung im Autoklaven sterilisieren und erst dann entsorgen. Bei Verwendung von BBL GasPak-Gläsern mit Umschlägen zur Gaserzeugung, ausschließlich Umschläge der Marke GasPak verwenden. Aufbewahrung Platten nach Erhalt im Dunkeln bei 2 8 C lagern. Einfrieren und Überhitzen vermeiden. Erst unmittelbar vor Gebrauch öffnen. Vor Lichteinwirkung schützen. Gebrauchsfertige Agarplatten, die bis zur Verwendung in der Originalverpackung bei 2 8 C aufbewahrt wurden, können bis zum Verfallsdatum inokuliert und für die empfohlene Inkubationsdauer inkubiert werden. Medium vor der Inokulation Raumtemperatur annehmen lassen. Haltbarkeit des Produkts Agarplatten bei Anzeichen von mikrobieller Kontamination, Verfärbung, Austrocknung oder sonstigen Anzeichen von Produktverfall nicht verwenden. VIII PROBENENTNAHME UND -HANDHABUNG Zur Probenentnahme wurden eine Vielzahl von Abstrichtupfern und Behältern entwickelt. Die Probenentnahme sollte vor der Behandlung mit Antibiotika erfolgen. Für einen umgehenden Transport zum Labor ist zu sorgen. Mehrere Aufbewahrungsmedien oder Transportsysteme, wie beispielsweise die Probenentnahme- und Transportprodukte von BBL, werden für die Verlängerung der Lebensdauer von Mikroorganismen empfohlen, wenn eine signifikante Verzögerung zwischen Entnahme und endgültiger Kultivierung zu erwarten ist. Einzelheiten zur Probenentnahme und -handhabung sind der einschlägigen Fachliteratur zu entnehmen. 13,14 Dem Labor müssen ausreichend klinische Daten zur Verfügung stehen, sodass der Mikrobiologe die am besten geeigneten Medien und Verfahren auswählen kann. IX VERFAHREN Mitgeliefertes Arbeitsmaterial CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol Benötigtes, jedoch nicht mitgeliefertes Arbeitsmaterial Zusätzliche Kulturmedien, Reagenzien, Qualitätskontrollorganismen und Laborgeräte nach Bedarf. Testverfahren Antiseptische Vorsichtmaßnahmen beachten. Die Agarfläche sollte glatt und feucht sein, jedoch ohne überschüssige Feuchtigkeit. Die Probe nach dem Eintreffen im Labor schnellstmöglich ausstreichen. Kontakt mit der Luft auf ein Mindestmaß reduzieren. Bei Flüssigproben sollten die Medien mit 1 Probentropfen inokuliert werden. Gewebeproben sollten vor der Inokulation zerkleinert und dann in eine sterile Bouillon, wie beispielsweise BBL Angereichertes Thioglykolat-Medium, gemahlen werden. Die Inokulation wird dann wie bei Flüssigproben durchgeführt. Die Abstrichproben können auf das erste Quadrat der Agarmedien ausgerollt und dann zur Inokulation von Flüssigmedien verwendet werden. Alternativ kann der Abstrich auch in eine geringe Menge reduzierter Bouillon gerieben und die Bouillon dann zur Inokulation der Medien wie mit Flüssigproben verwendet werden. Dieses Medium sollte unmittelbar vor der Inokulation reduziert werden. Hierzu das Medium 18 bis 24 h anaeroben Bedingungen aussetzen. 3 Ein wirksamer und einfacher Weg, eine geeignete anaerobe Atmosphäre zu schaffen, ist die Verwendung des anaeroben BD GasPak EZ-Systems. Agarmedien sollten mit der Ausstrichplattenmethode inokuliert werden, um Reinkulturen von Proben zu erhalten, die Mischflora enthalten. 3

4 Eine Anreicherungsbouillon, wie beispielsweise das BBL Angereicherte Thioglykolat-Medium, sollte zur selben Zeit wie die primären Isolierungsplatten inokuliert werden. Unmittelbar in einer anaeroben Atmosphäre inkubieren oder vorübergehend (jedoch nicht länger als 3 h), bis genug Platten gesammelt sind, in ein Glas geben, das mit sauerstofffreiem Gas (mit sauerstofffreien Gasen) gespült wurde. 15 Die Inkubation sollte wenigstens 48 h bei 35 ± 2 C, vorzugsweise 5 bis 7 Tage lang, erfolgen. Ungeachtet des verwendeten anaeroben Systems ist es wichtig, einen Indikator für die Anaerobiose einzusetzen, wie z. B. den anaeroben GasPak-Indikator. Qualitätssicherung durch den Anwender Siehe Qualitätskontrollverfahren. Es sind die geltenden gesetzlichen und behördlichen und in den Akkreditierungsbedingungen festgelegten Vorschriften zur Qualitätskontrolle sowie die laborinternen Standardvorgaben zur Qualitätskontrolle zu beachten. Benutzer sollten die relevanten CLSI-Dokumente und CLIA- Vorschriften über geeignete Testverfahren zur Qualitätskontrolle einsehen. X ERGEBNISSE Nach der Inkubation werden die meisten Platten einen Bereich konfluenten Wachstums zeigen. Da es sich bei dem Ausstrichverfahren eigentlich um eine Verdünnungsmethode handelt, wird sich eine geringere Anzahl von Mikroorganismen auf den ausgestrichenen Bereichen ablagern. Folglich sollten einer oder mehrere dieser Bereiche isolierte Kolonien der in der Probe enthaltenen Organismen aufweisen. Außerdem kann das Wachstum jedes Organismus auf der Basis des Wachstums in jedem der ausgestrichenen Bereiche semiquantitativ bestimmt werden. Die Kolonien mit einem Dissektionsmikroskop und einer UV-Langwellenlampe untersuchen (Kolonien der pigmentierenden Porphyromonas-Prevotella-Spezies sollten unter UV-Licht orange bis ziegelrot fluoreszieren). Die Fluoreszenz ist vor der Pigmentierung sichtbar. Um das Sauerstoffverhältnis jedes in den anaeroben Festmedien vorhandenen Kolonietyps zu bestimmen, folgende Medien inokulieren: Eine anaerobe Blutagarplatte anaerob inkubieren. 2. Eine aerobe Blutagarplatte (oder Schokoladenagarplatte) in einer aeroben, mit Kohlendioxid angereicherten Atmosphäre inkubieren. Der Schokoladenagar wird vor allem zur Unterscheidung nutriziös hochselektiver Hämophilius-Spezies und anderer Bakterien, die auf anaerobem und anaerob inkubiertem Blutagar wachsen sowie auf Schokoladenagar unter erhöhter Dioxidspannung, die jedoch kein Wachstum auf Blutagar in Gegenwart von Kohlendioxid oder an der Luft zeigen. 3. Eine aerobe Blutagarplatte anaerob und ohne Zusatz von Kohlendioxid inkubieren. 4. Röhrchen mit angereichertem Thioglykolat-Medium und/oder Kochfleisch-Medium sowie ein Röhrchen mit Peptonhefeextrakt-Glukosebouillon. Alle Kulturen mindestens 24 h und bis zu 7 Tagen bei 35 ± 2 C inkubieren. Das Sauerstoffverhältnis entweder als obligat anaerob oder als nicht anaerob (aerotolerant anaerob, mikroaerophil oder fakultativ anaerob) dokumentieren. 16 Organismen, die auf den aeroben Subkulturplatten kein Wachstum aufweisen, können in Bezug auf ihre Sauerstoffanforderungen als obligat anaerob eingestuft werden. Kolonien des/der Typs/Typen, der/die sich als obligat anaerob erweisen, können unter Verwendung der entsprechenden Bouillonkulturen weiter untersucht werden. Detaillierte Informationen, einschließlich der Nachweisverfahren, sind der einschlägigen Fachliteratur zu entnehmen. 6,7,17-21 XI VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN Mit der primären Platte können einige Diagnosetests durchgeführt werden. Für biochemische Tests und andere Nachweisverfahren wird jedoch die Verwendung einer Reinkultur empfohlen. Detaillierte Informationen und empfohlene Verfahren sind der einschlägigen Fachliteratur zu entnehmen Ein einzelnes Medium reicht selten zum Nachweis aller potenziell signifikanten Organismen in einer Probe aus. Es ist zu beachten, dass das Wachstum von Organismen, die auf das im selektiven Medium verwendete Antibiotikum generell empfindlich reagieren, je nach Konzentration des Antibiotikums, den Charakteristika des mikrobiellen Stamms und der Anzahl der Organismen im Inokulum ganz oder teilweise gehemmt werden kann. Das Wachstum von generell gegen das Antibiotikum resistenten Organismen wird in der Regel nicht gehemmt. Daher sollten auf selektiven Medien kultivierte Proben 4

5 mit auf nichtselektiven Medien kultivierten Proben verglichen werden, um zusätzliche Informationen zu erhalten und die Gewinnung potenzieller Pathogene sicherzustellen. XII LEISTUNGSMERKMALE Vor der Freigabe werden alle Chargen von anaerobem CDC-Agar mit 5 % Schafblut und Phenylethylalkohol (PEA) auf ihre Leistungsmerkmale getestet. Repräsentative Proben der Charge werden mit 0,1 ml der folgenden ausgestrichenen Kulturen inokuliert: Bacteroides fragilis (ATCC 25285), Clostridium perfringens (ATCC 13124), Peptostreptococcus anaerobius (ATCC 27337), Porphyromonas levii (ATCC 29147), Escherichia coli (ATCC 25922) und Proteus mirabilis (ATCC 12453). Die Inokula für B. fragilis, C. perfringens, P. anaerobius und P. levii werden aus Kolonien präpariert, die auf anaerobem CDC-Agar mit 5 % Schafblut kultiviert und in vorreduziertem und angereicherten Thioglykolat-Medium auf den McFarland-Standard von 0,5 eingestellt wurden. Das Inokulum für E. coli wird aus einer Bouillonkultur gewonnen und im Verhältnis 10-1 verdünnt. Das Inokulum für P. mirabilis wird aus einer Bouillonkultur gewonnen und im Verhältnis 10-4 verdünnt. Nach der Inokulation werden die Platten in einem vollständigen GasPak-System bei 35 ± 2 C inkubiert. Die Platten werden nach einer Inkubation von 48 h untersucht. Alle anaeroben Organismen zeigen leichtes bis starkes Wachstum mit der typischen Koloniemorphologie und den typischen hämolytischen Reaktionen, wohingegen E. coli und P. mirabilis Anzeichen von starkem Wachstum zeigen. Im Vergleich zu einer nichtselektiven Kontrolle, sind die Kolonien von E. coli kleiner und das Ausschwärmen ist bei P. mirabilis gehemmt. Bei Betrachtung unter UV-Licht (365 nm) zeigt P. levii eine hellrosa bis hellorange bis ziegelrote Fluoreszenz. XIII LIEFERBARE PRODUKTE Best.- Nr. Beschreibung BD BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA), Packung mit 20 Platten XIV LITERATUR 1. Dowell, V.R., Jr Wound and abscess specimens, p In A. Balows (ed.), Clinical microbiology. How to start and when to stop. Charles C. Thomas, Springfield, Ill. 2. Dowell, V.R., Jr., G.L. Lombard, F.S. Thompson, and A.Y. Armfield Media for isolation, characterization, and identification of obligately anaerobic bacteria. CDC laboratory manual. Center for Disease Control, Atlanta. 3. Dowell, V.R., Jr., and T.M. Hawkins Laboratory methods in anaerobic bacteriology. CDC laboratory manual. HHS Publication No. (CDC) Centers for Disease Control, Atlanta. 4. Gibbons, R.J., and J.B. MacDonald Hemin and vitamin K compounds as required factors for the cultivation of certain strains of Bacteroides melaninogenicus. J. Bacteriol. 80: Wilkins, T.D., S.L. Chalgren, F. Jimenez-Ulate, C.R. Drake, Jr., and J.L. Johnson Inhibition of Bacteroides fragilis on blood agar plates and reversal of inhibition by added hemin. J. Clin. Microbiol. 3: Isenberg, H.D. (ed.) 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6 18. Engelkirk, P.G., J. Duben-Engelkirk, and V.R. Dowell, Jr Principles and practice of clinical anaerobic bacteriology. Star Publishing Co., Belmont, Calif. 19. Summanen, P., E.J. Baron, D.M. Citron, C.A. Strong, H.M. Wexler, and S.M. Finegold Wadsworth anaerobic bacteriology manual, 5th ed. Star Publishing Co., Belmont, Calif. 20. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley, and S.T. Williams (ed.) Bergey's ManualTM of determinative bacteriology, 9th ed. Williams & Wilkins, Baltimore. 21. Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken (ed.) Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 22. Koneman, E.W., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger, and W.C. Winn, Jr Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, 5th ed. J.B. Lippincott Company, Philadelphia. 23. MacFaddin, J.F Biochemical tests for identification of medical bacteria, 3rd ed. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore. 24. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld Bailey & Scott's diagnostic microbiology, 11th ed. Mosby, Inc., St. Louis. Technische informatie en ondersteuning van BD Diagnostics: buiten de Verenigde Staten kunt u contact opnemen met de BD-vertegenwoordiger in uw regio of naar gaan. Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, MD USA Benex Limited Pottery Road, Dun Laoghaire Co. Dublin, Ireland ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company BD 6