Theorie der Proteinfaltung

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1 Theorie der Proteinfaltung Strukturelle Bioinformatik WS15/16 Dr. Stefan Simm,

2 Proteinfaltung EINLEITUNG

3 Proteinfaltung physikalischer Prozeß, mit dem ein Polypeptid aus einem random coil Zustand in seine charakteristische und funktionale 3D-Struktur faltet

4 Proteinfaltung physikalischer Prozeß mit dem ein Polypeptid aus einem random coil Zustand in seine charakteristische und funktionale 3D-Struktur faltet Aminosäuren interagieren miteinander, um eine geordnete Tertiärstruktur auszubilden native state die Tertiärstruktur ist von der Aminosäuresequenz abhängig (Anfinsens Dogma)

5 Anfinsens Dogma auch bekannt als thermodynamische Hypothese bei kleinen, globulären Proteinen wird die Tertiärstruktur ausschließlich von der Aminosäuresequenz bestimmt unter den Bedingungen (Temperatur, Zusammensetzung des Lösungsmittels, usw.), die eine Faltung ermöglichen, ist die native Struktur ein einzigartiges, stabiles und kinetisch zugängliches Minimum der freien Energie

6 Levinthals Paradox würde ein Protein falten, indem es sequentiell alle möglichen Konformationen durchläuft, würde es astronomisch lange dauern, auch wenn jede Konformation sehr schnell, d.h. im Nanobzw. Pikosekundenbereich eingenommen würde Möglichkeiten für ein 150aa Protein Atome im sichtbaren Universum

7 Levinthals Paradox da Proteinfaltung sehr viel schneller erfolgt, ist die Suche im Konformationsraum nicht zufällig ein Protein faltet in einer Serie von metastabilen, intermediären Zuständen

8 Proteinfaltung gefaltete Proteine besitzen einen hydrophoben Kern Minimierung der Anzahl hydrophober Seitenketten, die zum Wasser exponiert sind, ist eine wichtige Triebkraft des Prozesses der Proteinfaltung hydrophobic collapse Stabilisierung des Kerns durch dichte Packung von Seitenketten

9 Proteinfaltung intramolekulare H-Brücken tragen ebenfalls zur Stabilisierung der Struktur bei Stärke einer H-Brücke abhängig von ihrer Umgebung Proteinkern > Proteinoberfläche

10 Proteinfaltung in vivo beginnt Proteinfaltung während der Translation an Ribosomen d.h. während der N-terminale Abschnitt schon faltet, wird der C-terminale Abschnitt noch synthetisiert Chaperone verhindern Aggregation von Proteinen von bestimmten Proteinen benötigt, um in ihre funktionale Struktur zu falten

11 GroE Chaperone Substrat GroES GroEL

12 Proteinfaltung Translation am Ribosom ist langsam (Siller et al. 2010): Prokaryoten: aa/sec Eukaryoten: 3-8 aa/sec Wie schnell falten α-helices? einige 100 ns (<1µs) β-hairpins? wenige µs Proteine? wenige µs bis ms Eaton et al. Acc. Chem. Res. 1998, 31, 745

13 Helixformation im Exit Tunnel des Ribosoms trna Exit Tunnel magnified view Bhushan et al. 2010

14 Theoretische Betrachtungen der Proteinfaltung Methoden: experimentelle theoretische computergestützte einfachstes Problem: Wie faltet ein globuläres Protein mit einer einzigen Domäne? D.h. wie navigiert es durch die rauhe Landschaft der freien Energie auf dem Weg zu seiner nativen Struktur? Thirumalai et al. 2010

15 Theoretische Betrachtungen der Proteinfaltung Faltungsmechanismen vielfach mittels einer Approximation auf zwei Zustände beschrieben nur gefaltete und ungefaltete Zustände als signifikant häufig eingenommen betrachtet aber: Proteine sind verzweigte Polymere von endlicher Länge native Struktur nur marginal stabilisiert durch eine Anzahl von relativ schwachen Interaktionen Thirumalai et al. 2010

16 Theoretische Betrachtungen der Proteinfaltung ungefalteter und sogar der gefaltete Zustand sollten mikroskopisch betrachtet daher als ein Ensemble von Strukturen angesehen werden unter Faltungsbedingungen sind die Fluktuationen im nativen Zustand geringer als im ungefalteten Zustand Thirumalai et al. 2010

17 Ensemble von Strukturen Proteinfaltung ist keine unimolekulare Reaktion U F (unfolded/folded) Proteinfaltung ist ein Prozeß der gegenseitigen Umwandlung von Konformationen im Denatured State Ensemble (DSE) in das Ensemble von Strukturen im Native Basin of Attraction (NBA) Faltungslandschaft eines Proteins Thirumalai et al. 2010

18 Ensemble von Strukturen Proteinfaltung mittels Verteilungsfunktionen beschreibbar folgendes wird benötigt, um die Selbstorganisation von Proteinen zu erfassen: passende Werkzeuge aus der statistischen Mechanik Konzepte der Polymerphysik RNA-Faltung kann ebenfalls auf diese Weise betrachtet werden Thirumalai et al. 2010

19 Gyrationsradius in der Polymerphysik beschreibt er die Abmessungen einer Polymerkette da ein Ensemble von Strukturen vorliegt, ist der R g der Mittelwert des Ensembles (ensemble average) R R 1 2 g 1 2 g N N ( r r ) k mean k = 1 N = Sequenzlänge r k = Position von Residue k r mean = Schwerpunkt aller Residuen N N ( r r ) k mean k =

20 Gyrationsradius stark denaturierende Bedingungen Proteine liegen entfaltet als random coil vor wenn dem so ist, dann muß basierend auf der Flory Theorie - der Gyrationsradius (R g ) im d ν ungefalteten Zustand mit Rg ad N skalieren a d = charakteristische Kuhn Länge d = denatured state N = Anzahl Aminosäuren im Protein ν = 0,6 gilt für Homopolymere in guten Lösungsmitteln Thirumalai et al. 2010

21 Gyrationsradius gefaltete Proteine sind maximal kompakt daher skaliert der native state mit 1 mit ν = und n=native state 3 R G Gyrationsradius ρ Anteil nativer Kontakte Farbverlauf zeigt die Änderung der freien Energie grün=energetisch am ungünstigsten blauer Bereich=native state R n g a n ν N Thirumalai et al Brooks et al. (1998)

22 Spingläser und Frustration Ausgangspunkt ist das Random Energy Model (REM) aus Theorie der Spingläser Spingläser sind ungeordnete, verdünnte Anordnungen magnetischer Atome in diamagnetischen Matrizen benachbarte Atome koppeln entweder ferro- oder antiferromagnetisch ferromagnetisch bevorzugt gleich orientierte Spins, antiferromagnetisch hingegen entgegensetzte Spins sobald eine Kopplung zwischen zwei Spins etabliert ist, behält sie ihren Wert bei beim Abkühlen einer Spinglasprobe richten sich die Spins so aus, dass insgesamt eine Anordnung mit minimaler Energie entsteht Ferromagnetismus Antiferromagnetismus Weikl 2009

23 Spingläser und Frustration Konflikte: System mit ungerader Zahl antiferromagnetischer Wechselwirkungen zwei Spins können sich energetisch günstig einstellen dritter kann nur zu jeweils einem der beiden benachbarten energetisch günstig stehen? Antiferromagnetisch wechselwirkende Spins in dreieckiger Anordnung siehe auch

24 Spingläser und Frustration? unmöglich, alle lokalen Wechselwirkungen simultan zu optimieren Frustration Frustration führt im gesamten Spinsystem zu einer Quasi-Entartung des Grundzustandes viele Konfigurationen mit ähnlicher Energie durch Abkühlung eingefrorener Mikrozustand hängt von Vorgeschichte ab jeder Abkühlzyklus führt zu anderer Spinkonfiguration außerdem existiert ein Glasübergang: Anzahl thermisch zugänglicher Konfigurationen sinkt mit der Temperatur dramatisch ab Spinsystem friert unterhalb der Glastemperatur in einer zufälligen Konfiguration ein Weikl 2009

25 Spingläser und Frustration? Tendenz der Spins im Spinglas, sich in Bezug auf die Nachbarspins optimal ausrichten zu wollen, entspricht dem Bestreben der Aminosäuren im Protein, sich im kompakten, gefalteten Zustand energetisch optimal zu ihren Nachbarn anzuordnen weiterführende Literatur: Binder, Kurt, and A. Peter Young. "Spin glasses: Experimental facts, theoretical concepts, and open questions." Reviews of Modern physics 58.4 (1986): 801. Weikl 2009

26 folding landscape Visualisierung des Faltungsprozesses als ein Navigieren in einer großen Faltungslandschaft Dynamik von Heteropolymeren zufälliger Sequenz zeigt, daß ihre Energielandschaft viel zu rauh ist, um sie in typischen Faltungszeiten (Millisekunden) zu erkunden energetische Frustration Thirumalai et al. 2010

27 folding landscape deshalb muß die Energielandschaft vieler evolvierter Proteine glatt oder trichterförmig sein minimale Frustration d.h. der Gradient hin zum NBA is groß genug, daß die Proteine nicht lange in CBAs verharren im Laufe des Faltungsprozesses CBA = competing basin of attraction DSE = denatured state ensemble NBA = native basin of attraction Thirumalai et al. 2010

28 folding landscape deshalb muß die Energielandschaft vieler evolvierter Proteine glatt oder trichterförmig sein minimale Frustration d.h. der Gradient hin zum NBA is groß genug, daß die Proteine nicht lange in CBAs verharren im Laufe des Faltungsprozesses CBA = competing basin of attraction DSE = denatured state ensemble NBA = native basin of attraction Thirumalai et al. 2010

29 Protein Folding Funnel Brooks et al. (1998)

30 Protein Folding Funnel Molten Globule States: kompakte, denaturierte Zustände mit Sekundärstruktur, die dem native state ähnelt, in einem Fold, der mehr oder weniger dem native state ähnelt; ihnen fehlt aber die Stabilität in ihren tertiären Interaktionen (Dobson 2004) Brooks et al. (1998)

31 Protein Folding Funnel Transition Region: Ensemble von teilweise gefalteten Konformationen mit gleicher Faltungsbzw. Entfaltungswahrscheinlichkeit (Weikl 2009) Glass Transition: erfolgt bei einer Temperatur, bei der es zu wenige Zustände gibt, so daß das System in einigen wenigen, diskreten Zuständen einfriert (Weikl 2009) Brooks et al. (1998)

32 Glass Transition Entropie S ist definiert als S(E) = k B log [Ω o P(E)] Ω o Anzahl der Konformationszustände eines Polymers P(E) Wahrscheinlichkeit für Energie E wird das System abgekühlt, so sinkt die Energie dem System geht die Entropie aus, wenn die durchschnittliche Energie unter einen kritischen Wert E E o fällt, so daß S(E o ) = 0 Onuchic et al. 1997

33 diese Entropiekrise tritt bei der Glass-Transitionstemperatur T G auf, mit T 1 G = Glass Transition 2k S / E B o 2 und S o = k B log Ω o unter T G zeigt die Kinetik des Systems glassähnliches Verhalten, das von der Historie des Systems abhängt über T G verhält sich das System wie eine viskose Flüssigkeit Onuchic et al. 1997

34 Chaperone und Proteinfaltung Hartl et al. 2011

35 Chaperone und Proteinfaltung UPS = ubiquitin-proteasome system Zahlen = Anzahl beteiligter Proteine Hartl et al. 2011

36 Multiple Folding Nuclei (MFN) Model effiziente Faltung von Proteinen erfolgt nach einem NC Mechanismus mit einem ratenlimitierenden Schritt, der einhergeht mit der Ausbildung eines der folding nuclei Ausbildung des folding nucleus und der collapse der Kette erfolgen nahezu gleichzeitig NC Mechanismus durchschnittliche Größe des wahrscheinlichsten nucleus N * R für globuläre Proteine mit einer einzigen Domäne beträgt etwa Residuen (Chen et al. 2008, J Phys Chem B) Thirumalai et al. 2010

37 Three Stage Multipathway Mechanism Phase I Phase II Phase III Ф = Teil der ursprünglichen Population an Molekülen MECS = minimum energy compact structures Thirumalai et al Thirumalai 1995

38 Three Stage Multipathway Mechanism Ф = Teil der ursprünglichen Population an Molekülen Phase I Phase II Phase III Phase I: unspezifischer Kollaps hydrophobic collapse im Gegensatz zu Homopolymeren nicht völlig zufällig Konformationen in dieser Phase hängen von mehrere Faktoren ab wie z.b. Wahrscheinlichkeit von Loopbildung, interne Bewegungen, die von Transitionen dihedraler Winkel dominiert werden usw. in Proteinen somit in dieser Phase schon mehr Spezifität, die für Homopolymere nicht erwartet wird MECS = minimum energy compact structures Thirumalai et al Thirumalai 1995

39 Three Stage Multipathway Mechanism Ф = Teil der ursprünglichen Population an Molekülen Phase I Phase II Phase III Phase II: Kinetic Ordering MECS = minimum energy compact structures ein Teil von dem native state ähnelnden Kontakten wird ausgebildet Bewegung von Segmenten hoch kooperativ zum Ende dieser Phase findet das Molekül ein CBA bzw. NBA Strukturen mit vielen Kontakten, die dem native state ähneln, sich aber signifikant von diesem unterscheiden Thirumalai et al. 2010, Thirumalai 1995

40 Three Stage Multipathway Mechanism Ф = Teil der ursprünglichen Population an Molekülen Phase I Phase II Phase III Phase III: Alles oder Nichts: Transitionen aktiviert, die von einer der vielen Strukturen minimaler Energie, die dem native state ähneln, hin zum native state führen die wenigen falschen Kontakte werden aufgebrochen und native Kontakte hergestellt MECS = minimum energy compact structures Thirumalai et al Thirumalai 1995

41 Transition-Path Theory beschreibt die Wahrscheinlichkeitsverteilung von A (ungefaltet) zu B(gefaltet) Segmenten einer hypothetischen, unendlich langen Trajektorie Noé F et al. PNAS 2009;106:

42 Illustration of transition-path theory on a model potential Noé F et al. PNAS 2009;106:

43 PinWW domain folding flux Noé F et al. PNAS 2009;106:

44 PinWW domain folding flux Noé F et al. PNAS 2009;106:

45 Faltung/Insertion von helikalen Membranproteinen Ribosom mit nascierender Polypeptidkette dockt an Sec Komplex an getrieben durch die Translation wird das nascierende Protein transloziert wenn bei der Translokation eine transmembrane α-helix im Sec-Komplex liegt, öffnet sich der Sec-Komplex lateral und entläßt die Helix in die Membran Frauenfeld et al. 2011

46 Faltung/Insertion von transmembranen β-barrel Proteinen Huysmans G H M et al. PNAS 2010;107: PagP (PDB ID code 1THQ)

47 BAM complex of proteobacteria (BamA/B/C/D/E)

48 BamA crystal structure Haemophilus ducreyi Neisseria gonorrhoeae d

49 lateral opening observed in silico

50 lateral opening observed in silico

51 Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit!