Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8)

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1 Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8) 1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment 2. Proteindynamik 3. Strukturelle Evolution

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3 A. Protein-Renaturierung Denaturierung in 8M Harnstoff Dialyse und stehenlassen an Luft 100% aktives Enzym keine zufällige Renaturierung Wahrscheinlichkeit für korrekte Faltung bei Gleichwertigkeit aller SH: 1/7 x 1/5 x 1/3 x 1/1 = 1/105 native Konformation thermodynamisch günstig sein. Reduktive Denaturierung und oxidative Renaturierung der RNAse A

4 Enzymatische Renaturierung von Disulfid-Brücken Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) kontinuierliches Öffnen der S-S Brücken. Thermodynamisch günstigste Proteinkonformation bestimmt die bevorzugten S-S Brücken.

5 Posttranslationell modifizierte Proteine können sich einer spontanen Renaturierung widersetzen Primärstruktur von Proinsulin Insulin wird aus einer AS-Kette gebildet, dem Proinsulin. Spezifische proteolytische Reaktion führt zur Abspaltung eines internen Peptides (C chain) zwei kettiges Insulin kann nicht mehr spontan ursprüngliche Konformation einnehmen und andere S-S Brücken ausbilden

6 Proteinfaltung wird hauptsächlich durch innere Reste gesteuert Modifikation von AS an Proteinoberfläche verändern die native Konformation kaum Mutationen von Oberflächenresten verändern native Konformationkaum AS an Oberfläche evolutionär weniger stark konserviert als innere Reste (hydrophobe Reste) Denaturierende Agenzien interagieren mit hydrophoben inneren Resten Die Proteinfaltung ist ein von hydrophoben Kräften getriebener Prozess

7 B. Faltungsabläufe Es werden nicht alle möglichen Konformationen ausprobiert (bräuchte Mia von Jahren) Faltung mehrstufiger, kooperativer Prozess. 1. zufällige Bildung kurzer Abschnitte von Sekundärstrukturen (α Helices, β Faltblätter) Nuclei für weitere Faltung 2. Nuclei wachsen in kooperativer Weise. Helices und Faltblätter gruppieren sich. 3. in Multidomänenprot. kommen Domänen zusammen. Molten Globule Hydrophobe Seitenketten sind noch dem Lsm ausgesetzt. 4. Kompaktere Tertiärstruktur bildet sich aus kleine konformationelle Anpassungen. 5. Untereineheiten kommen zusammen 6. konformationlelle Anpassungen führen zu nativer Konformation. Hypothethscher Faltungsablauf einer dimeren Proteins.

8 BPTI faltet sich in geordneter Abfolge in seine native Konformation BPTI = Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor Inaktiviert Trypsin im Pankreas, welcher Trypsin sezerniert. Dadurch wird dieser vor Selbstzerstörung geschützt. 3 Disulfid-Brücken Natives BPTI

9 BPTI wählt eine begrenzte Anzahl Faltungswege 30% 70 %

10 C. Faltungs Hilfsproteine Hilfsproteine die Faltung von Proteinen erleichtern während sie synthetisiert werden = Beschleunigung der Faltung 1. Protein Disulfid Isomerasen (PDI) 2. Peptidyl prolyl cis-trans isomerasen 3. Chaperone PDI (siehe vorher) beschleunigt korrekte S-S Brückenbildung durch shuffling von Disulfidbrücken. Ähnliches Enzym in Bacterien = DsbA Protein mit Ähnlichkeit zu thioredoxin. Schwefel Atom 90 gedreht negativ geladene Gruppen positiv geladene Gruppen exponiertes Schwefelatom Molekulare Oberfläche und Ladungsverteilung

11 Peptidyl prolyl cis-trans isomerasen (PPI) In globulären Proteinen Xaa-Pro Peptid Bindungen in trans Konformation, aber 10% in cis Konformation. Cis Konformation wird durch PPI (auch Rotamase genannt) begünstigt 2 Familien von PPI s (Immunophiline): cyclophiline FK506 binding protein (FKBP) Diese Proteine haben auch immunsupressive Eigenschaften, die jedoch nichts mit ihren enzymatischen Aktivitäten als Rotamasen zu tun haben.

12 Molekulare Chaperons verhindern falsche Faltung und Agregation von Proteinen Hydrophobe Regionen haben Tendenz zu agregieren. Solche Agregate können siche in einem Peptidstrang selber bilden oder zwischen Peptidsträngen. Molekulare Chaperone verhindern eine solche ungünstigen Assoziationen und kehren sie um. Chaperone binden an hydrophobe Regionen die Lösungsmittel exponiert sind und verhindern so ungewollte Agregationen. Der genaue Mechanismus ist unbekannt jedoch haben viele Chaperone ATPase Aktivität. ATP hydrolyse scheint die Energie für die Funktion der Chaperone zu liefern. Peptid wird in gestreckter Konformation gehalten Verankerung des C-Terms an Chaperon Boomerang Gestalt von PapD E. coli PapD ein molekulares Chaperon das die korrekte Faltung von Pili fördert.

13 Verschiedene Klassen von Chaperons 1. Heat shock protein 70 (Hsp70) so benannt da Synthese dieser Proteine erhöht bei angehobener Temperatur. Sie kehren Denaturierung und Agregation in Prokaryoten als auch in Eukaryoten um. 2. Chaperonine (Hsp60, Hsp10) Multisubunit, käfigähnliche Moleküle Erhöhen nicht die Rate der Proteinfaltung sondern erhöhen die Ausbeute an richtig gefalteten Proteinen 3. Nucleoplasmine steuern in vivo die Zusammensetzung von der Nucleosomen Hsp60 Molekül von Rhodobacter spheroides ist aus 14 identischen Untereinheiten.

14 hydrophobische Bindungsstellen Reaktionszyklus der E. coli chaperonine GroEL (Hsp60) und GroES (Hsp10) ATP-abhängige Freisetzung von ungefalteten Proteinen von den Bindungstellen im GroEL chaperon.

15 Nucleoplasmine Nucleosomen werden durch Nucleoplasmine aus den Histoneinheiten zusammengefügt. An Nucleosomen ist die DNA aufgewickelt und stellt eine sehr kompakte Form der Verpackung dar.

16 C. Vorhersage der Proteinstruktur Primärstruktur bestimmt Faltung. Theoretisch Berechungen möglich um Struktur zu bestimmen, praktisch aber kaum durchführbar Empirische Methoden 1. Chou-Fasman-Schema Frequenz f = Frequenz mit der ein bestimmter Rest in einer α-helix auftritt f = n n n = Anzahl AS eines Typs in α-helix n = Gesamtzahl der AS dieses Typs im Protein Tendenz P einer bestimmten AS in einer α-helix aufzutreten P = f f f = Durchschnittswert von f für alle 20 AS P > 1 heisst AS mit grösserer als durchschnittlicher Wahrscheinlichkeit in α-helix Tendenz P einer bestimmten AS in einem β-faltblatt aufzutreten analog definiert.

17 Empirische Regeln zu Chou-Fasman-Schema: 1. Vier Helix bildende Reste in sechs aufeinanderfolgenden Resten dienen als Helixnucleus. Helixsegment pflanzt sich in beide Richtungen fort bis der durchschnittliche Wert von P < 1 ist. Ein Pro-Rest nur am N-Term einer Helix. 2. Drei β Faltblatt bildenden Reste in fünf aufeinanderfolgenden Resten starten ein β Faltblatt. Pflanzt sich in beide Richtungen fort bis P < Wenn α und β bildende Sequenzen überlappen gilt Überlappungsregion als helical wenn P > P α-helix P > P β Faltblatt Zuverlässigkeit ist bis zu 80 % 2. Regel von Rose Umkehrschleifen sind durch ein Hydrophobizitäts-Minimum entlang der Polypeptidkette charakterisiert. Dies gilt nur wenn die Region nicht gleichzeitig ein helicaler Abschnitt darstellt.

18 Vorhersage von α-helices, β Faltblatt Strukturen und β Schleifen

19 Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8) 1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment 2. Proteindynamik 3. Strukturelle Evolution

20 2. Proteindynamik - Röntgenstruktur liefert zeitlich gemittelte Schnappschüsse der Proetinstruktur - Proteine sind aber flexibel fluktuierende Moleküle, deren strukturelle Mobilität eine funktionelle Signifikanz hat. 3 Arten von Atmungsbewegungen : 1. atomare Fluktuationen: vibrationen von individuellen Bindungen pm 2. kollektive Bewegungen: Gruppen von kovalent verknüpften Atomen bewegen sich pm 3. induzierte Konformationsveränderungen: Atomgruppen und ganze Untereinheiten können können sich nach Stimulus (z.b. O2 an Hämoglobin) bewegen pm

21 O2 Molekül Häm Gruppe Darstellung der atmenden Bewegungen im Myoglobin, die das Austreten eines gebundenen O2 Moleküls zulassen

22 Proteine haben mobile Strukturen His-Rest Häm Seitenketten H-Brücken Mehrere Schnappschüsse von Myoglobin überlagert α Helix

23 Faltung, Dynamik und strukturelle Evolution der Proteine (Voet Kapitel 8) 1. Proteinfaltung: Theorie und Experiment 2. Proteindynamik 3. Strukturelle Evolution

24 3. Strukturelle Evolution Hydrophobe Kräfte sehr wichtig für Faltung. Innere AS können nur konservativ substituiert werden damit Struktur erhalten bleibt. Konservierung der Proteinstruktur wichtig, nicht Aminosäuresequenz. A. Struktur des Cytochroms c Häm Nische wichtig. AS die Häm fixieren sind evolutionär konserviert strukturell wichtige AS Häm

25 Primärstruktur verschiedener Cytochrome c Aminosäuresequenz nicht sehr konserviert. Strukturelemete aber sehr. Kritische Aminosäuren sind konwerviert

26 Dreidimensionale Struktur von Cytochromen c Struktur ist sehr konserviert im Gegensatz zur Primärstruktur

27 B. Gen-Duplikation strukturell ähnliche Domänen von Rhodanase In Multidomän Proteinen können Domänen ähnlich sein. Konvergente Evolution ist unwahrscheinlich, Gen-Duplikation und dievergente Evolution eher wahrscheinlich Redox- Enzyme (Dehydrogenasen) aus 2 verschiednen Domänen: Coenzym bindende Domäne und Substrat bindende Domäne Funktion aus 2 Einheiten Genetische Kombination neue Funktion