Biophysikalisches Seminar

Transkript

1 Biophysikalisches Seminar Naturwissenschaftliche Fakultät III Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Datum: 12.1./ Thema: Die Bedeutung von Chaperonen und Verfasser: Claudia Seidl

2 Chaperone Die Situation in der Zelle Bakterium molecular crowding

3 Chaperone Chaperon - Definiton Ein Chaperon (aus dem französischem für Anstandsdame) bezeichnet in der Biochemie ein Protein, das unreife Proteine vor schädlichem Kontakt bewahrt und ihnen so hilft sich korrekt zu falten

4 Chaperone Charakterisierung Kein Teil des nativen Proteins Nicht-kovalente Bindung an sich faltende Proteine Gehen unverändert aus Reaktion hervor Manche Chaperone benötigen zur Erfüllung ihrer Aufgabe Energie (ATP) ATPasen Chaperonkomplexe

5 Chaperone Aufgaben Stabilisierung und Vermittlung der Faltung von Proteinen in Folge von De novo Proteinbiosynthese Transit durch Membranen Stress induzierter Denaturierung der Oligomerisierung Von Interaktionen mit bestimmten Zellkompartimenten des intrazellulären Transports des proteolytischen Abbaus

6 Chaperone Klassifizierung Erstmals in E.coli Mutanten entdeckt Expression der Chaperone steigt bei Hitzestress stark an Hitzeschockproteine (Hsp) Einteilung in verschiedene Klassen, je nach Molekulargewicht und Sequenzhomologien

7 Chaperone Chaperon Familie Eukarya Bakteria Archaea small Hsp Hsp12-Hsp42, α-christallin IbpA, IbpB Hsp16.5 Hsp10 (Gruppe I Chaperonin Kofaktor) Hsp10 GroES GroES (nur Methanosarcinales) GimC Höhere Eukaryonten: Prefoldin Hefe: Gim1-6 - GimC (in den meisten Archaea) Trigger Faktor Trigger Faktor - - GrpE höhere Eukaryonten: GrpE Hefe: Mge1 GrpE GrpE Hsp40 Höhere Eukaryonten: Hsp40 Hefe: Ydj1, Mdj1, Sec63 DnaJ DnaJ Hsp60 (Chaperonine) Gruppe I: Hsp60 (Mitochondrien, Chloroplasten) Gruppe II: TriC/CCT (Zytosol) Gruppe I: GroEL Gruppe I: GroEL (nur Methanosarcinales) Gruppe II: Thermosom Hsp70 Höhere Eukaryonten: Hsp72, Hsp73, mthsp70, BiP Hefe: Ssa1-4, Ssb1-2 mtssc1 DnaK, Hsc66, Hsc62 DnaK Hsp90 Höhere Eukaryonten: Hsp90-α (Zytosol, induzierbar) Hsp-β (Zytosol, konstitutiv) Hsp75 (mitochondrial) Gp96 (ER) Hefe: Hsp82 (Zytosol) HtpG Nicht bekannt Hsp100 Hefe: Hsp104 Clps Nicht bekannt Tabelle 1: Übersicht über die Chaperonfamilien (nach Daniel Klunker, München 2003)

8 Chaperone Small Hsp (shsp)/α-kristallin Beinhalten alle konservierte C-terminale Region (=αkristalline Domäne) Ausbildung riesiger dynamischer Komplexe Abbildung 1: Darstellung der Kristallstrukur eines shsps (nach Mogk et al.,2001) wirken ATP-unabhängig Mechanismus weitgehend unbekannt

9 Chaperone Hsp40 Heterogene Gruppe stellen Cofaktoren für Hsp70-Chaperone dar Regulation der ATPase-Aktivität Aufbau Abbildung 2: Typischer Aufbau eines Hsp40 (nach Beispiele DnaJ (E.coli)

10 Chaperone Hsp60 (=Chaperonine) Assemblieren zu oligomeren Doppelringen von kda ATP-abhängige Reaktionen Einteilung in zwei Gruppen bezüglich ihres Vorkommens Gruppe GroEL in Prokaryoten Hsp60 in den Chloroplasten und Mitochondrien eukaryotischer Zellen Gruppe I II TriC bzw. CCT im eukaryotischen Cytosol Thermosom der Archaeen

11 Chaperone Gruppe I Jede Untereinheit (UE)aus 3 Domänen: apikal Intermediär Äquatorial 14 UE zusammengesetzt ergibt 2 rotationssymmetrische Ringe aus je 7 UE Beispiele: GroEL RBP Hsp60 in Mitochondrien und Chloroplasten der Eukaryoten Abbildung 3: Allgemeine Struktur der Chaperonine; rot:equatorial, grün: intermediär, gelb: apikal (nach Ditzel et al. 1998)

12 Chaperone Der GroEL/GroES - Zyklus Abbildung 4: GroE-Reaktionszyklus (nach Sparrer et al, 1997)

13 Chaperone Gruppe II Jede UE aus 3 Domänen: apikal Intermediär Äquatorial Benötigen keinen GroES ähnlichen Faktor helikaler Deckel schließt den Ring Beispiele: Eukaryonten: TriC (Doppelring aus 2 x 8UE Archaeen: Thermosom Abbildung 5: helikales Segment der apikalen Domäne; links oben: Übereinanderlagerung des helikalen Segmentes mit einer GroEL-UE(nach Klumpp et al. 1997)

14 Chaperone Hsp70 Aufbau N-terminale ATPase-Domäne (45kDa) C-terminale Substratbindedomäne (25kDa) Vertreter Eukaryoten: Hsp72: stressinduzierte Form im Cytosol Hsp73: konstitutiv exprimierte Form im Cytosol BiP: Hsp70 des ER Prokaryoten: DnaK aus E.coli Abbildung 6: Strukturmodell des Hsp70 DnaK aus E.coli (nach Dirk Brehmer, Freiburg 2001)

15 Chaperone Substrat wird nicht eingeschlossen, sondern durch kurzes hydrophobes Stück gebunden Bindung und Dissoziation des Substrats wird durch ATPHydrolyse geregelt DnaK-ATP: besitzt niedrige Affinität DnaK-ADP: hohe Affinität Co-Chaperone DnaJ: bindet Sustrat und übergibt es an Dank GrpE: Nukleotidaustauscher Abbildung 7:schematische Darstellung des DnaK-Zyklus (nach Mogk et al.)

16 Chaperone Hsp90 Häufigstes Chaperon (1-2% der löslichen Zellproteine) An den meisten zellulären Prozessen, u.a. durch Interaktion mit und über Cofaktoren beteiligt Substrate: Steroidhormonrezeptoren Transkriptionsfaktoren Kinasen Tumorsuppressorproteine Interaktion mit Ubiquitinierungsmaschine über das Cochaperon Chip Aufbau Homodimer N-Terminus: ATPase-Domäne Abbildung 8: N-terminale Domäne des humanen Hsp90 mit Mg2+-ADP (PDB-Code: 1BYQ)

17 Proteinbiosynthese Abbildung 9: Übersicht über die Synthese von Proteinen (Bild aus

18 Sortierung Proteine Mit Signalsequenz Nucleus,ER, Mitochondrien, Plastiden, Peroxisomen Ohne Signalsequenz Cytosol

19 Proteintransport in der Zelle Transportmöglichkeiten zwischen den verschieden Kompartimenten - über die Kernpore - transmembran - über Vesikel Abbildung 10: Roadmap des Proteintransports (Bruce,Alberts,The Cell)

20 Die Kernpore Abbildung 11: schematische Darstellung der Kernpore (Bruce,Alberts,The Cell) Transport in gefaltetem Zustand FG-repeats erleichtern Transport Gerichteter Transport durch die GTPase Ran

21 Proteintransport durch die Kernpore Abbildung 12: schematische Darstellung des Ran-GTPase-Systems (Bruce,Alberts,The Cell) Ran-GTP/ RanGDPGradient treibt Transport an Ran-GDP vermittelt die Bindung des Proteins an den importrezeptor und wird in den Nucleus geschleust Ran-GTP fördert Bindung des Zielproteins an den Export-Rezeptor

22 Transmembraner Proteintransport 1. Translokation in die Mitochondrien Abbildung 13: Bauplan eines Mitochondriums (Bild aus

23 Translokatoren Abbildung 14: Proteintranslokatoren in den mitochondrialen Memranen (aus Bruce Alberts, The Cell)

24 Proteinbiosynthese Bleibt durch cytosolische Chaperone (Hsp70) im ungefalteten Zustand Rezeptoren am TOM-Komplex erkennen Signalsequenz des Proteins Protein wird entfaltet Translokation durch beide Membranen Peptidase spaltet Signalseuqenz ab Abbildung 15: Proteinimport in die Mitochondrien (aus Bruce Alberts, The Cell)

25 Wiederholte Zyklen der ATP-Hydrolyse durch mitochondriale Hsp70 vervollständigen den Importprozess Abbildung 16: Vervollständigung des Imports durch ATP-Hydrolyse (aus Bruce Alberts, The Cell)

26 Abbildung 17:Proteinimport in die Zwischenräume und in die innere Membran der Mitochondrien (aus Bruce Alberts, The Cell)

27 Der sekretorische Weg Abbildung 18: Rauhes endoplasmatisches Reticulum und Golgi-Apparat (auskoolman,röhm:taschenatlas der Biochemie)

28 2. Transport ins ER Abbildung 19: Drei Wege der Translokation (aus Bruce Alberts, The Cell)

29 Glykosilierung Oligosaccharyltransferase (spezielles Membranprotein) Übertragung eines VorläuferOligosaccharids von dem Lipidmolekül Dolichol zum NTerminus eines Asparagins Abbildung 20: Polypeptid mit Oligosaccharid (aus Bruce Alberts, The Cell)

30 Proteinfaltung im ER a) Calnexin und Calreticulin (Chaperone) Binden an die vorher angehefteten Oligosaccharide Zurückhalten im ER Benötigen für ihre Aktivität Ca2+-Ionen Vermitteln beide die Bindung weiterer Chaperone an Cysteine, die noch keine Disulfidbrücken ausgebildet haben

31 Abbildung 21:Rolle der Glykosilierung bei der Proteinfaltung im ER (aus Bruce Alberts, The Cell)

32 Retrotranslokation Mechanismus (nicht vollständig geklärt) Export des fehlgefalteten Proteins N-Glycanase im Cytosol entfernt die Zucker Protein wird ubiquitiniert Proteasom baut Protein ab Abbildung 22: Dislokation fehlgefalteter Proteine (aus Bruce Alberts, The Cell)

33 b) Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) Chaperon ähnliche Funktion bei hohen Konzentrationen ( verhindert Aggregate) besitzt zwei katalytische Zentren (N- und C-terminal) katalysiert Reduktion und Oxidation der Sulfidgruppen der Cysteine Abbildung 23: Strukturmodell der PDI (aus

34 c) Peptidyl-Prolyl-Isomerase (PPI) Katalysiert die cis-trans-isomerisierung von X-Prolin-Bindungen Isomerisierung dieser Bindung kann für Proteinfaltung geschwindigkeitsbestimmend sein Einteilung in drei Familien (nach Dirk Brehmer, Freiburg 2001) Cyclophiline FK506-Bindeproteine Parvuline Abbildung 24: cis-trans-isomerisierung von X-ProlinBindungen (nach Dirk Brehmer,Freibur i.br. 2001

35 Danke

36 Quellenverzeichnis (1)Dissertation Chaperon-vermittelte Proteinfaltung in Archaea von Daniel Klunker, TU München 2003 (2)Dissertation Aufklärung des molekularen Mechanismus des Nukleotidaustausches bei Hsp70-Chaperonen von Dirk Brehmer, AlbertLudwigs-Universität Freiburg i.br (3) (4) (5)Helmut Sparrer, Kerstin Rutkat, and Johannes Buchner: Catalysis of protein folding by symmetric chaperone complexes ; PNAS 1997, Vol.94 (6)Anthony L. Fink: Chaperone-Mediated Protein Folding; Physilogical Reviews 1999, Vol.79 (7)Alberts,Johnson: Molecular Biology of the Cell;4th edition, Garland science 2002 (8)Jans Koolmann, Klaus Heinrich Röhm: Taschenatlas der Biochemie, 2.Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart1998 (9)Mogk et al.: Molekulare Chaperone und ihr biotechnologisches Potential, Biologie in unserer Zeit, 31.Jahrgang 2001