Signalsequenzen binden an Transportproteine (Rezeptoren) dadurch wird Weg des Proteintransports in der Zelle festgelegt

Transkript

1 Signalsequenzen binden an Transportproteine (Rezeptoren) dadurch wird Weg des Proteintransports in der Zelle festgelegt - + ausgedehnter hydrophober Bereich Proteinimport in Zellkern: PPKKKRL Proteinimport in ER: MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLLTKCEVFQ Retention im ER: KDQL Proteinimport in Mitochondrien: MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL Proteinimport in Peroxisomen: SKL

2 Import in Zellkern findet über Kernporen statt im Gefrierbruch sichtbare Verbindungskanäle zwischen ZellkernCytoplasma

3 Schematische Darstellung Kernpore

4 Import Kernproteine

5 Kernpore: aus ca. 100 verschiedenen Proteinen bestehende komplizierte Struktur annuläre luminale säulenförmige ringförmige Untereinheit Cytosol Nucleus

6 ER, Ribosomen und Proteinlokalisation in der lebenden Zelle Freie Ribosomen cytosolische Proteine Hämoglobin Polyribosomen Proteinlokalisation in Zelle Glycoproteine Membranproteine sekretorische Proteine rauhes ER Anordnung als freie oder am ER gebundene Ribosomen hängt von Anwesenheit von Signalsequenzen in translatierter mrna ab

7 Zellkern und Endoplasmatisches Reticulum (ER)

8 Lenkung cytosolischer bzw. sekretorischer Proteine

9 Proteinlokalisation in Endoplasmatisches Reticulum (ER)

10 Lokalisation in ER-Lumen: sekretorische und Membranproteine Glycoproteine, Lipoproteine

11 Proteolytische Prozessierung Transmembranprotein

12 Verankerung eines Transmembrananteils in Membran stop start

13 Signalsequenzen eukaryotischer sekretorischer Proteine basisch basisch hydrophob

14 Kovalente Modifizierung im ER

15 Proteinmport in Mitochondrien

16 Chaperone: Protein-Entfaltung vor Import in Mitochondrien und Chaperon (Hsp70)-vermittelte Faltung

17 Protein-Qualitätskontrolle beim Austritt aus ER: Chaperone Chaperone - verhindern Aggregation - entfalten fasch gefaltete Proteine - helfen Proteine zu entfalten, welche durch biologische Membranen zu transportieren sind

18 Dyctiosom

19 Vesikelabschnürung aus Golgi-Zisternen Transportvesikel raues ER Sekretvesikel

20 Proteinmodifizierung zu Lipoproteinen (lp) glattes ER (ger) und Golgi anschl. Exocytose in Sekretvesikeln (sv)

21 Golgi-Apparat als Verschiebebahnof und Endfertigung der Zelle

22 Liganden- bzw. Antikörper-gekoppelte Fluoreszenzmarker

23 Signalamplifikation mittels Sekundärantikörper

24 ER -> Golgi -> Zellmembran ER-> Golgi-> Endosom -> Lysosom

25 Nach kurzfristigem Angebot radioaktiv markierter Aminosäure (pulse-chase)

26 Enzymhistochemie: Lichtmikroskop Enzymcytochemie: Elektronenmikroskop

27 Fraktionierung Zellorganellen in Ultrazentrifuge Direkte Beobachtung der Fraktionen im Transmissions-EM Enzymbestimmungen (Markerenzyme für Organellen) in situ Lokalisierung des Enzyms Identifizierung organspezifischer Proteine mit spezifisch bindenden Liganden oder Antikörpern (Fluoreszenz-, Goldpartikel-) leichte und schwere Lysosomen mit Detergens bzw. kolloidalen Gold

28 Zellfraktionierung und Enzymlokalisation

29 Leitenzyme der Zellorganellen Zellmembran: Na+/K+ ATPase Zellkern: DNA- bzw. RNA-Polymerase Cytosol: Enzyme der Glycolyse ser: Hydroxylierungsenzyme rer: ribosomale Proteine Golgi: Galactosyl-Transferase Lysosomen: saure Phosphatase Peroxisomen: Katalase Mitochondrien: Cytochrom c-oxidase

30 Exocytose (Trans-Golgi-Netzwerk) Endocytose (Endosom, Lysosom) Transcytose apikal basolateral wie werden Proteine an richtigen Ort in der Zelle dirigiert? bezüglich Verbreitung in Gewebe kommt es auf Art der Zell-Zell-Verbindung an

31 Wie können sogar Proteine ohne Signalsequenz an richtigen Ort in Zelle gelangen? Gerichteter Vesikeltransport von Donator- zu Acceptororganelle organellspezifische GProteine auch als Auslöser für Membranfusion

32 merokrine (Exocytose) apokrine (Brustdrüse) holokrine (Talgdrüse) Sekretion

33 Exocytose: konstitutiv bzw. getriggert

34 Immunogold-Lokalisierung Sialinsäure-Transferase im Golgi-Apparat

35 Konstitutive und getriggerte (regulierte) Sekretion

36 Exocytose sekretorischer Vesikel hochkonzentriertes, sofort freisetzbares Insulin (stimuliert Glucoseaufnahme)

37 Mastzelle vor (li) und nach (re) Triggerung und Freisetzung von Histamin

38 Trennung Motoneuron (nz) von Muskelzelle (mz) durch synaptischen Spalt (ss) praesynaptische (prm) postsynaptische (pom) sec. Membran neural Neurotransmitter-Vesikel min. hormonell

39 Koppelung Endocytose/Exocytose Entkoppelung von Ligand- und Rezeptorkreislauf Stachelgrübchen Stachelvesikel

40 Clathrin-vermittelte Endocytose Phagocytose als Spezialfall der Endocytose

41 Rezeptorvermittelte Endocytose von Cargomolekülen

42 Clathrin-coated pits an Zellmembran ->Clathrin-coated vesicles in Zytoplasma ->Vesikelbildung mit H+ Pumpe -> frühes Endosom -> Lysosom Goldpartikel Compartment of Uncoupling Receptor-Ligand

43 Endocytose Flüssigkeit (Pinocytose) Partikel, größeres Molekül (rezeptorvermittelt) Phagocytose Bakterien, Parasiten

44 Phagocytose Erythrocyt durch Makrophagen

45 Phagocytose von Bakterien durch Makrophagen

46 Phagocytose Bakterium durch Leukocyten

47 Lysosomen: Orte hydrolytischen Abbaus in Zellen

48 Enzymcytochemische Lokalisierung saurer Phosphatase in Lysosomen Aktivität Saure Phosphatase in (nicht allen s. *) Lysosomen aber auch in Vesikel des Golgi-Bereichs

49 Mannose-6-P: Lokalisierungssignal für Lysosomen

50 Lysosomen aufgrund räumlicher Nähe zum Golgi als primäre Lysosomen? jedoch direkter Nachweis: wer fusionierte in welcher Reihenfolge mit wem? ist problematisch

51 Nachweis: wo und wie genau jedoch nicht immer unproblematisch primäres Lysosom: Transportvesikel von Trans-Golgi sekundäres Lysosom: Mit Auto- oder HeteroPhagosomen fusioniertes primäres Lysosom tertiäres Lysosom: Autophagosome und heterophagosome Partikel bzw. Abbauprodukte davon enthaltend (Konfluenz)

52 Heterophagie Konfluenz Autophagie

53 Autophagie (Abbau Mitochondrium) a: teilw. Von ER-Cisterne umschlossenes Mitochondrium b: von einfach- bzw. Doppelmembran umschlossenes Mitochondrium c: als ehem. Mitochondrium nur noch vage zu erkennen bzw. zu erahnen

54 Beweis: Konfluenz Autophagie mit Heterophagie Endosom mit Mitochondrium, gleichzeitig Goldpartikel von Endocytose enthaltend Aufgrund saurer Phosphatase-Aktivität als Pb3(PO4)2 : Identifizierung als Lysosom

55 Pflanzliche Vakuole als Riesenlysosom

56 Hypervariabilität Zellorganellen