Der Experimentator: Immunologie

Transkript

1

2

3 Der Experimentator: Immunologie

4 In der Reihe DER EXPERIMENTATOR sind bereits erschienen Hermey et al.: Neurowissenschaften (ISBN ) Luttmann et al.: Immunologie (ISBN ) Müller/Röder: Microarrays (ISBN ) Rehm/Letzel: Proteinbiochemie/Proteomics (ISBN ) Schmitz: Zellkultur (ISBN )

5 Werner Luttmann Kai Bratke Michael Küpper Daniel Myrtek Der Experimentator: Immunologie 4., vollständig überarbeitete und korrigierte Auflage

6 Werner Luttmann Friesoythe Kai Bratke Rostock Michael Küpper Rostock Daniel Myrtek Freiburg ISBN DOI / ISBN (ebook) Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Springer Spektrum Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014 Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung des Verlags. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Bearbeitungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichenund Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Planung und Lektorat: Kaja Rosenbaum, Bettina Saglio Einbandentwurf: deblik, Berlin Einbandabbildung:»Innenrin«, Öl auf Leinwand, 80x100 cm, Mai 2011, Prof. Dr. Diethard Gemsa, Im Köhlersgrund 10, Marburg. Website: Gedruckt auf säurefreiem und chlorfrei gebleichtem Papier Springer Spektrum ist eine Marke von Springer DE. Springer DE ist Teil der Fachverlagsgruppe Springer Science+Business Media

7 V Vorwort 4. Auflage Nun nach vier Jahren ist es wieder soweit: Die dritte Auflage des Immuno-Experimentators ist fast vergriffen, so dass wir gefordert waren, das Nachfolgewerk zu gebären. Getreu unserem Bestreben nach einem»wirklich«praktikablen Immunologiewerk haben wir die vierte Auflage nicht nur dazu genutzt, den unvermeidbaren Rechtschreibfehler-Teufel auszutreiben, sondern die Qualität als immunologisches Nachschlagewerk weiter zu verbessern. Um der schnelllebigen wissenschaftlichen Welt Rechnung zu tragen, wurden die Methodenkapitel um Antikörper-Arrays und Tissue-Microarrays erweitert. Weiterhin haben wir einen Überblick über den therapeutischen Einsatz von Immunzellen, mit Fokus auf Dendritische Zellen, implementiert. Selbstverständlich wurden auch die CD-Nomenklatur sowie die Cytokin- und Chemokintabelle auf den aktuellen Stand gebracht. Die Autoren

8 VII Vorwort Nach zwei erfolgreichen Ausgaben vom»experimentator«war es an der Zeit, die Lücke zur»immunologie«zu schließen. Aus dieser Wissenschaft wurde ein schon lange nicht mehr wegzudenkendes»tool«geboren: der Antikörper. Zusammen mit seinem jeweils spezifischen Antigen spielt er im vorliegenden Werk die Hauptrolle. Entstanden ist: Der Experimentator: Immunologie; in neuem Design, weil neue Konzern- Mutter (Elsevier). Der ursprüngliche Auftrag des Experimentators, Methodik untypisch feucht, statt konventionell trocken zu vermitteln ist hingegen der gleiche geblieben. Begonnen mit dem proteinbiochemischen Rehm und fortgeführt mit dem molekularbiologischen Mülhardt deckt der nun vorliegende»immuno-experimentator«einen weiteren großen Bereich der Biologie ab. Dem erprobten und offensichtlich erfolgreichen Experimentator-Konzept folgend, wurden hier möglichst viele bereits etabliertere wie auch neuere Methoden berücksichtigt sowie deren Vorteile, Nachteile und erfahrungsgemäß nützliche Tipps genannt. Die Autoren

9 IX Inhaltsverzeichnis 1 Antikörper Des Antikörpers Eigenheiten Molekülstruktur von Antikörpern Die Antigen-Antikörper-Bindung Herstellung von Antikörpern Das Antigen Die Wahl der Spezies Antigenapplikation Polyklonale Antikörper Monoklonale Antikörper Rekombinante Antikörper Reinigung von Antikörpern »Quick and dirty«präzipitationsmethoden Affinitätschromatographie Klassische Methoden der Proteinreinigung Aufreinigung von IgY aus Eigelb Aufreinigung rekombinanter Antikörper Wichtige analytische Techniken Chemische Kopplung und Markierung von Antikörpern Chemische Kopplung von Antikörpern an feste Phasen Kopplung von Markerenzymen an Antikörper Kopplung von Fluorochromen an Antikörper Kopplung von Biotin Markierung mit Gold Markierung mit radioaktiven Isotopen Antikörper-Mikroarray Weiterführende Literatur Zellseparation Trennung nach Zellgröße und Zelldichte Zentrifugationstechniken Differenzialzentrifugation Dichtegradienten-Zentrifugation Separationsmedien Gegenstromzentrifugation Trennung nach zellspezifischen Oberflächenmolekülen Adhäsion an Kunststoffoberflächen Adhäsion an Nylonwatte Erythrocyten-Rosettierung Immunmagnetische Separation Lysierende Antikörper Weiterführende Literatur Durchflusscytometrie Wie funktioniert das eigentlich? Fluoreszenzen

10 X Inhaltsverzeichnis 3.3 Probenvorbereitung Zellmarkierung Inbetriebnahme des Durchflusscytometers Kompensation und Messung Kompensation Messung Auswertung Histogramm-Plot Dot-Plot Dichteplot Konturplot Isometrische Darstellung Modelle und Ausstattungen Autosampler Zellsorter Vergleichbarkeit durchflusscytometrischer Daten Weiterführende Literatur Quantitative Immunoassays Assaykonzepte Der kompetitive Assay Der Sandwich-Assay Welches Assaykonzept für welche Anwendung? Radioimmunoassay (RIA) Historisches Praktisches Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Coaten, Blocken, Waschen Enzyme und Substrate ELISA in der Praxis ELISPOT-Assay Anwendung und Vergleich mit anderen Methoden Prinzip und Praxis Partikel-Immunoassay (PIA) Prinzip der Mini-Kugeln Trapping-Assay Multiplex-Assay Vergleich mit anderen Immunoassays Verstärkersysteme Erhöhung der Markerdichte Multi-Enzym-Kaskaden Immuno-PCR Weiterführende Literatur Western-Blot Probenvorbereitung Auftrennung eines Proteingemisches mittels Gelelektrophorese Die diskontinuierliche SDS-PAGE Native Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung

11 Inhaltsverzeichnis XI 5.3 Transfer der Proteine auf eine Membran (Blot) Wet-Blot Semi-Dry-Blot Fehlerquellen Proteindetektion Blocking Antikörpermarkierung Visualisierung »Stripping«und»Re-probing«von Western-Blot-Membranen Fehlerquellen und Kontrollen Dot- und Slot-Blot Weiterführende Literatur in situ-immunlokalisation Untersuchung von Zellsuspensionen Zellsuspensionen Cytospins Zellausstriche Einbettung von Zellen Variationen und Details zur Behandlung von Zellsuspensionen Untersuchung von Geweben Vorbereitung Fixierung Paraffin-Einbettung Schneiden Nachbehandlung Immundetektion Eindeckung Immunelektronenmikroskopische Untersuchung von Geweben Fixierung Einbettung Mikrotomie Immundetektion Tissue Microarrays Weiterführende Literatur Immunpräzipitation Die Klassiker Eindimensionale Immundiffusion Zweidimensionale Immundiffusion nach Ouchterlony Radiale Immundiffusion nach Mancini Immunelektrophoresen Limitierung und aktuelle Bedeutung Immunpräzipitation»heute« Die Präzipitationsmatrix Reduktion unspezifisch präzipitierender Proteine Analyse der Immunpräzipitate Weiterführende Literatur

12 XII Inhaltsverzeichnis 8 Die Zelle: leben, fressen, sterben Zellviabilitätsbestimmung Farbstoff-Exklusion Tetrazoliumsalz-Reduktion ATP-Assay Zellproliferation DNA-Markierung mit [ 3 H]Thymidin DNA-Markierung mit 5-Brom-2 -desoxyuridin (BrdU) Durchflusscytometrische Bestimmung der Zellproliferation Phagocytose-Assays Die Testpartikel Futter für die Phagocyten Methoden der Partikelvisualisierung Zellvermittelte Cytotoxizität Chrom[ 51 Cr]-release-Assay Lactat-Dehydrogenase(LDH)-release-Assay Durchflusscytometrischer Cytotoxizitätsnachweis Apoptose-Assays Färbungen des Zellkerns DNA-Leiter Nucleosomen-Quantifizierungs-ELISA TUNEL-Technik Annexin V Messung von Caspase-Aktivität Sonstiges Weiterführende Literatur Immunologie in der klinischen Anwendung Blutgruppenbestimmung HLA-Typisierung Lymphocytotoxizitätstest Lymphoblastentransformation Immunzellen in der Therapie Dendritische Zellen Weiterführende Literatur Ein kurzer Ausflug in die ungeliebte Welt der Statistik Deskriptive Statistik Lokationsmaße Streuungsmaße Korrelationsmaße Prüfstatistik Skalen und ihre Daten Skizze des Ablaufs einer wissenschaftlichen Untersuchung Die Wahl eines geeigneten Signifikanztests Weiterführende Literatur

13 Inhaltsverzeichnis XIII 11 Naturwissenschaft vs. Übernatürliches CD-Antigene, Cytokine, Chemokine Glossar Index

14 XV Exkurse Exkurs 1 Handhabung und Lagerung von Antikörpern Exkurs 2 Wie gewährleiste ich ein langes Leben meiner wertvollen Chromatographiesäulen? Exkurs 3 U/min oder g wie hätten Sie s denn gern? Exkurs 4 Antikoagulanzien Exkurs 5 Zellzahl-Bestimmung Exkurs 6 Thrombocyten-Isolation Exkurs 7 Vorbehandlung von Gewebe zur Zellseparation Exkurs 8 Zellsiebe Exkurs 9 Zelllinien Exkurs 10 Saponine Exkurs 11 Bestimmung der Nachweisgrenze Exkurs 12 Homogene Enzymimmunoassays Exkurs 13 Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese Exkurs 14 Nephelometrie

15 XVII Abkürzungen ABC Avidin-Biotin-Komplex AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol AET 2-Aminoethylisothiouroniumbromid AMCA Aminomethylcumarinacetat AP Alkalische Phosphatase APAAP Alkalische Phosphatase anti-alkalische Phosphatase APC Antigen-präsentierende Zelle BAL Bronchoalveoläre Lavage BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat BrdU Brom-2 -desoxyuridin-5 -monophosphat BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) CBMC cord blood mononuclear cells (Nabelschnur-Blut) CN 4-Chlor-1-Naphtol DAB 3,3-Diaminobenzidin DAPI 4 6-Diamidino-2-phenylindol DTT Dithiothreitol ECM extrazelluläre Matrix EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FACS Fluorescence activated cell sorter FCS fetal calf serum FITC Fluoresceinisothiocyanat FSC forward scatter HLA human leucocyte antigen HRP horseradish peroxidase i.d. intradermal IEM Immunelektronenmikroskopie ILM Immunlichtmikroskopie i.p. intraperitoneal i.v. intravenös LSAB Labelled Streptavidin-Biotin mak monoklonaler Antikörper ME Mercaptoethanol MNC mononuclear cells NBT Nitro(blau)tetrazoliumchlorid PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese pak polyklonaler Antikörper PAP Peroxidase anti-peroxidase PBL uneinheitliche Nutzung: peripheral blood lymphocytes peripheral blood leucocytes PBMC peripheral blood mononuclear cells PBS phosphate buffered saline PEG Polyethylenglycol PHA Phytohämagglutinin PLP Periodat-Lysin-Paraformaldehyd PMNC polymorphkernige und polynukleäre Granulocyten