Werner Luttmann, Kai Bratke, Michael Küpper, Daniel Myrtek. Immunologie. Spektrum k_/ l AKADEMISCHE» VERLAG ELSEVIER SPEKTRUM AKADEMISCHER VERLAG

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1 Werner Luttmann, Kai Bratke, Michael Küpper, Daniel Myrtek Immunologie ELSEVIER SPEKTRUM AKADEMISCHER VERLAG Spektrum k_/ l AKADEMISCHE» VERLAG

2 Inhaltsverzeichnis Vorwort Exkurse....^ XII Abkürzungen 1 Antikörper Des Antikörpers Eigenheiten Molekülstruktur von Antikörpern Die Antigen-Antikörper-Bindung Herstellung von Antikörpern Das Antigen Die Wahl der Spezies Antigenapplikation Polyklonale Antikörper Monoklonale Antikörper Rekombinante Antikörper Reinigung von Antikörpern Quick and dirty" - Präzipitationsmethoden Affinitätschromatographie Klassische Methoden der Proteinreinigung Aufreinigung von IgY aus Eigelb Aufreinigung rekombinanter Antikörper Wichtige analytische Techniken Chemische Kopplung und Markierung von Antikörpern Chemische Kopplung von Antikörpern an feste Phasen Kopplung von Markerenzymen an Antikörper Kopplung von Fluorochromen an Antikörper Kopplung von Biotin Markierung mit Gold Markierung mit radioaktiven Isotopen 47 2 Zellseparation Trennung nach Zellgröße und Zelldichte - Zentrifugationstechniken Differenzialzentrifugation Dichtegradienten-Zentrifugation Separationsmedien Gegenstromzentrifugation Trennung nach zeilspezifischen Oberflächenmolekülen Adhäsion an Kunststoffoberflächen ' Adhäsion an Nylonwatte Erythrocyten-Rosettierung Immunmagnetische Separation Lysierende Antikörper 74 V XIII

3 VIII Inhaltsverzeichnis 3 Durchflusscytometrie Wie funktioniert das eigentlich? Fluoreszenzen Probenvorbereitung, Zellmarkierung ( Inbetriebnahme des Durchflusscytometers Kompensation und Messung Kompensation Messung Auswertung, Histogramm-Plot Dot-Plot Dichteplot Konturplot Isometrische Darstellung Modelle und Ausstattungen Autosampier Zellsorter Quantitative Immunoassays Assaykonzepte Der kompetitive Assay Der Sandwich Assay Welches Assaykonzept für welche Anwendung? Radioimmunoassay (RIA) Historisches Praktisches Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Coaten, Blocken, Waschen Enzyme und Substrate ELISA in der Praxis ELISPOT-Assay Anwendung und Vergleich mit anderen Methoden Prinzip und Praxis P.artikel-Immunoassay (PIA) Prinzip der Mini-Kugeln Trapping-Assay Multiplex-Assay Vergleich mit anderen Immunoassays Verstärkersysteme Erhöhung der Markerdichte Multi-Enzym-Kaskaden 129

4 Inhaltsverzeichnis IX 5 Western-Blot Probenvorbereitung Auftrennung eines Proteingemisches mittels Gelelektrophorese Die diskontinuierliche SDS-PAGE Native Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung Transfer der Proteine auf eine Membran (Blot) Wet-Blot Semi-Dry-Blot Fehlerquellen, Proteindetektion Blocking Antikörpermarkierung Visualisierung Fehlerquellen und Kontrollen Dot- und Slot-Blot in silu-immunlokalisation Untersuchung von Zellsuspensionen Zellsuspensionen Cytospins Zellausstriche Einbettung von Zellen Variationen und Details zur Behandlung von Zellsuspensionen Untersuchung von Geweben Vorbereitung Fixierung Paraffin-Einbettung.' Schneiden Nachbehandlung Immundetektion Eindeckung Immunelektronenmikroskopische Untersuchung von Geweben Fixierung Einbettung Mikrotomie Immundetektion Immunpräzipitation Die Klassiker Eindimensionale Immundiffusion Zweidimensionale Immundiffusion nach Ouchterlony Radiale Immundiffusion nach Mancini Immunelektrophoresen Limitierung und aktuelle Bedeutung 194

5 X Inhaltsverzeichnis 7.2 Immunpräzipitation heute" Die Präzipitationsmatrix Reduktion unspezifisch präzipitierender Proteine Analyse der Immunpräzipitate Die Zelle: leben, fressen, sterben ; Zellviabilitätsbestimmung? Farbstoff-Exklusion Tetrazoliumsalz-Reduktion ATP-Assay Zellproliferation DNA-Markierung mit [ 3 H]Thymidin DNA-Markierung mit 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) Phagocytose-Assays Die Testpartikel - Futter für die Phagocyten Methoden der Partikelvisualisierung Zeilvermittelte Cytotoxizität Chrom[ 5l Cr]-release-Assay Lactat-Dehydrogenase(LDH)-release-Assay Apoptose-Assays Färbungen des Zellkerns DNA-Leiter Nucleosomen-Quantifizierungs-ELISA TUNEL-Technik Annexin V 222 i Messung von Caspase-Aktivität 222 i Sonstiges 224,1 9 Spezielle Immuno-Assays 225 j 9.1 Blutgruppenbestimmung 225 j 9.2 HLA-Typisierung Lymphocytotoxizitätstest Lymphoblastentransformation 232 j 10 Ein kurzer Ausflug in die ungeliebte Welt der Statistik Deskriptive Statistik 237 'I Lokationsmaße Streuungsmaße Korrelationsmaße 242 > Prüfstatistik Skalen und ihre Daten 244 < Skizze des Ablaufs einer wissenschaftlichen Untersuchung 244 } Die Wahl eines geeigneten Signifikanztests 247 I t

6 Inhaltsverzeichnis XI 11 Naturwissenschaft vs. Übernatürliches Die Lieferanten - unsere Partner? Lieferantenverzeichnis (alphabetisch) Lieferanten geordnet nach Schwerpunkten /. 261 Anhang 1: CD-Antigene 265 Glossar 277 Register 287