Trennungsverfahren Techniken (in der Biologie)

Transkript

1 Trennungsverfahren Techniken (in der Biologie)?

2 Biomoleküle können getrennt werden aufgrund ihrer - chemischen Eigenschaften: Ladung, Löslichkeit, Wechselwirkung mit spezifischen Reagenzen, Molmasse - physikalischen Eigenschaften: Volumen, Dichte, Struktur

3 1. Trennung aufgrund der physikalischen Eigenschaften 1. Zentrifugation 2. Gel-Elektrophorese: - Agarose - Polyacrylamide 3. Gelfiltration 2. Trennung aufgrund der chemischen Eigenschaften 1. Ionenaustauschchromatographie 2. Affinitäts-Chromatographie 3. DNA/Protein/Lipid Chips oder Microarrays 4. zweidimensionale Elektrophorese

4 Homogenisierung biologischer Proben

5 Einfache Trennungstechniken Beim Sedimentieren lässt man eine mit einem unlöslichen Feststoff verunreinigte Flüssigkeit, zum Beispiel eine Suspension, länger stehen, wobei sich der Feststoff als Sediment absetzt. Das Abgießen der überstehenden Flüssigkeit heißt Dekantieren. Die beiden Verfahren werden im Haushalt angewandt, wenn man den Kaffee vom Kaffeesatz abgießt. Im Labor dienen sie zum Beispiel zur Trennung einer unlöslichen Ausfällung von Wasser.

6 Zentrifugation

7 Zentrifugation Beim Zentrifugieren wird eine Emulsion oder eine Suspension in ein starkwandiges Reagenzglas gegeben und in eine Zentrifuge gehängt. Durch eine schnelle Rotation entsteht eine Fliehkraft, wobei der Stoff mit der größeren Dichte ganz außen an den Boden des Reagenzglases "flieht": Die Trennung von Sediment und Überstand erfolgt nach dem Zentrifugieren durch Dekantieren. Durch Zentrifugieren können das Fett aus der Milch oder Stoffgemische von Gasen getrennt werden. Während Wäscheschleudern in Waschmaschinen mit bis zu 1500 Drehungen pro Minute rotieren, erreicht man mit guten Labor-Zentrifugen 8000 Umdrehungen pro Minute. Sogenannte Ultrazentrifugen schaffen sogar eine Million U/min. Sie werden vielfach bei biochemischen oder medizinischen Untersuchungen eingesetzt. Bei Blutuntersuchungen kann man so die roten und weißen Blutkörperchen vom Blutplasma trennen.

8 Der Sedimentationskoeffizient (S) Der Sedimentationskoeffizient S (Svedberg) beschreibt die Sinkgeschwindigkeit von Teilchen in der Ultrazentrifuge im Verhältnis zur Zentrifugalbeschleunigung. Aus dem Sedimentationskoeffizienten lässt sich bei Kenntnis des Diffusionskoeffizienten die Molmasse des gelösten Teilchens berechnen. Er ist abhängig von Masse, Form und Dichte des Teilchens.

9 Grundformen von Zentrifugation Differentielle Zentrifugation: (Niederschlag und Überstand) Dichtegradient-Zentrifugation: - Zone-Geschwindigkeitszentrifugation - Isopyknische Zentrifugation

10 Differentielle Zentrifugation

11 Erzeugung Mikrosomen- Fraktion Differentielle Zentrifugation

12 Dichtegradient-Zentrifugation

13 Gelfiltration Trennung: Nach der Grösse der Molekülen (z.b. Proteine)

14 Agarose Gel-Elektrophorese Agar agar: Gelatine Agarplatten in Petrischalen alsnährboden für die Mikrobiologie Agarose (mit D-Galaktose glycosidisch verbundene 3,6-Anhydrogalactose) stellt die Hauptkomponente des Agars dar und wird vor allem aus den Rotalgen-Gattungen gewonnen. Es wird für Separation von Protein Komplexen, DNA und RNA verwendet.

15 Agarose Gel-Elektrophorese

16 Agarose Gel-Elektrophorese: waagerecht Gelelektrophorese Diese Methode wird zur Auftrennung von Molekülen (oft DNA) entsprechend ihrer Ladung verwendet.

17 Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese (PAGE) PAGE wird verwendet für Separation von Proteine. Native-PAGE Molekulargewicht und Ladung gleichzeitig beeinflusst die Trennung SDS-PAGE Ausschließlich Molekulargewicht beeinflusst die Trennung SDS: Sodium-Dodecylsulfate, Detergens Seife

18 PAGE Gel: senkrecht

19 SDS-PAGE Abkürzung für englisch sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, Natriumdodecyl sulfat-polyacrylamidgelelektrophorese) Einer der häufigsten Methoden Proteine zu analysieren ist die Polyacrylamid-gel- Elektrophorese (PAGE). Proteine in dem starken ionischen Detregens Natriumdodecylsulfalt ( SDS) von den Antikörper abdissozieren. Dieses Verfahren nennt man demnach abgekürzt SDS-PAGE: Dabei bindet SDS ziemlich gleichmäßig an Proteine und verleiht ihnen eine Ladung, die das Molekül im elektrische Feld durch das Gel wandern läßt. Die Geschwindigkeit wird dabei vor allem von der Proteingröße bestimmt.

20

21 Isoelektrische Focussierung - A B P h g r a d i e n t

22 2D-Gelelektrophorese Erste Dimension: Isoelektrische Focusierung Zweite Dimension: Trennung aufgrund der Größe

23 2D-Gelelektrophorese Erste Dimension: Isoelektrische Focusierung Zweite Dimension: Trennung aufgrund der Größe Proteinen aus Brust-Krebs Zellen Proteinen aus gesunden Zellen

24 Ionenaustauschchromatographie Proteine in Form: Zwitterion

25 Affinitätschromatographie

26 Affinitätschromatographie Diese Methode dient zur Aufreinigung oft von Antikörpern oder Antigenen und beruht auf der Antigen- Antikörper- Bindung. Für die Aufreinigung eines spezifischen Antikörpers aus dem Serum befestigt man das Antigen an einer unlöslichen Matrix., beispielsweise an Chromatographiekügelchen. Anschließend schickt man das Serum durch die Matrix. Die spezifischen Antikörper binden, während andere Antikörper und Proteine ausgewaschen werden. Die spezifischen Antikörper lassen sich anschließend durch eine Änderung der ph- Wertes eluieren, da auf diese Weise die Bindung zwischen Antigen und Antikörper gewöhnlich aufgebrochen werden. Antigene kann man entsprechend aufreinigen, indem man die Antikörper an einen festen Träger bindet.

27 Biochemische Gründe der Affinitätschromatographie -Chemische Modifizierung Des Säulenmaterials -Spezifische Ligand- Protein Bindung -Elution mit einer Lösung die den Ligand enthält

28 Säulenchromotographie Praktikumsaufgabe: Hb und Br-Ph-blau Unter Silikagel Bei der Säulenchromatographie besteht die immobile Phase aus Körnchen eines in bestimmter Weise dreidimensionalen vernetzten Gels aus Silica-Gel, oder Polyacrylamid oder einem Polysaccharid (z.b. Agarose). Kleinere Proteinmoleküle werden stärker zurückgehalten als größere. Somit findet man Proteine mit einer kleineren Molekülmasse im oberen Teil der Säule.

29 Magnetische Trennung Dynabeads-Perlchen reagieren mit einem Bestandteil (polya-rna) Entfernung mithilfe Magnets

30 DNA/Protein Chips or microarrays

31 Micro Array

32 DNA-Microarrays DNA-Microarrays sind eine sehr moderne Methode, um die Expression aller Gene einer Zelle bei verschiedenen Wachstumsbedingungen zu untersuchen. Dabei macht man sich zu Nutze, dass jedes Gen einer Zelle zunächst in ein mrna Molekül umgeschrieben wird, bevor es in ein Protein übersetzt wird. Da nun meistens die Konzentration dieser mrna mit der Menge des letztendlich gebildeten Proteins korreliert, kann man mit einer einheitlichen Methode die Art und Menge der in einer Zelle vorhandenen Proteine bestimmen. Für die Herstellung eines DNA-Microarrays wird ein Fragment jedes Gens einer Zelle in einem definierten Raster auf der Oberfläche eines Glasträgers fixiert, der die Größe eines Objektträgers besitzt. Da die einzelnen spots nur Durchmesser von ca. 100 µm haben, passen bis zu verschiedene Genfragmente auf ein einzelnes DNA-Microarray. Für die Transkriptionsanalyse wird nun mrna aus Zellen, die bei unterschiedlichen Bedingungen gewachsen sind, isoliert und mit zwei verschiedenen Fluoreszenz-Farbstoffen markiert. Die markierten Nukleinsäuren werden dann mit dem DNA-Microarray hybridisiert und die Fluoreszenzintensität der einzelnen Spots durch abtasten mit Laserlicht quantifiziert. Die erhaltenen Ergebnisse erlauben dann Rückschlüsse auf alle in einer Zelle ablaufenden Stoffwechselprozesse. Die Verifikation der erhaltenen Ergebnisse kann durch den Einsatz der gleichfalls sehr aktuellen Realtime-PCR vorgenommen werden. Solche Trankriptionsanalysen werden von der pharmazeutischen Industrie gegenwärtig intensiv für die Suche nach neuen Wirkstoffen benutzt. Ebenso kann man die Reaktion lebender Zellen auf diverse Schadstoffe sehr genau erfassen. Neben Transkriptionsanalysen sind aber mit DNA-Microarrays noch weitere experimentelle Ansätze, wie etwa der Vergleich der Genome verschiedener Stämme einer Art, möglich.

33 Die Fluoreszenz Auswertung DNA-Chip Ergebnisse der Transkriptom Verschiedene Farbintensität zeigt die relative Menge einer einzellen RNA

34 Größe des Chips

35 muss geübt sein Danke Ihre Aufmerksamkeit!