Biochemisches Grundpraktikum

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1 Biochemisches Grundpraktikum Versuch Nummer G-06 06: Affinitätschromatographie und Charakterisierung von Immunglo- bulinen

2 Gliederung: I. Das Immunsystem... 2 a) Einleitung... 2 b) Humorale Abwehr... 2 c) Zelluläre Abwehr... 3 II. Ammoniumsulfatfällung... 3 a) Theoretische Grundlagen... 3 b) Versuchsziele, Aufgaben... 3 c) Versuchsdurchführung... 3 III. Gelfiltration... 4 a) Theoretische Grundlagen... 4 b) Versuchsziele, Aufgaben... 4 c) Versuchsdurchführung... 4 d) Beobachtungen... 4 IV. Affinitätschromatographie... 4 a) Theoretische Grundlagen... 4 b) Versuchsziele, Aufgaben... 5 c) Versuchsdurchführung... 5 d) Meßergebnisse und Beobachtungen... 5 e) Auswertung und Diskussion... 5 V. Titerbestimmung nach OUCHTERLONY... 6 a) Theoretische Grundlagen... 6 b) Versuchsziele, Aufgaben... 6 c) Versuchsdurchführung... 6 d) Meßergebnisse und Beobachtungen... 7 e) Auswertung und Diskussion... 7 VI. SDS-Gelelektrophorese... 7 a) Auswertung und Diskussion

3 I. Das Immunsystem a) Einleitung Damit sich ein Organismus gegen die Einflüsse von außen schützen kann, hat sich in vielen Lebewesen eine effektive Abwehr aufgebaut. Die Hauptaufgabe dieses Immunsystems ist es, zwischen fremd und eigen zu unterscheiden. Zum einen gibt es die unspezifische Resistenz, zum anderen die spezifische Immunität. Bei Wirbeltieren ist letzere sehr stark ausgeprägt; deshalb wird im folgenden Text Bezug auf das menschliche Immunsystem genommen. Besonders wichtig sind seine Fähigkeiten, spezifisch zu arbeiten und sich zu erinnern. Dafür stehen zwei unterschiedliche aber in Verbindung stehende Wege: Die humorale und die zelluläre Abwehr. b) Humorale Abwehr Zu dieser Immunantwort zählen lösliche Proteine, die Antikörper, die von Plasmazellen bereitgestellt werden. Sie sind in unvorstellbar hoher Anzahl (ca ) im Körper vorhanden. Nur ein Bruchteil von ihnen ist (zufällig) identisch, denn der Organismus stellt sie willkürlich her. Trotzdem findet sich zu nahezu allen Fremdstoffen (Antigenen) ein passender Antikörper. Die Strukturen, die von einem Antikörper erkannt werden, heißen Epitope. Es sind Regionen auf großen Molekülen wie z.b. Proteinen, Kohlenhydraten und Nukleinsäuren. Sie sind oft klein (bei Proteinen reichen 10 Aminosäuren), aber geringe Veränderungen können durch Antikörper erkannt werden. Der Antikörper an sich ist ebenfalls ein Proteinmolekül. Er besteht aus ca Atomen und baut sich aus vier Polypeptidketten auf: Zwei identische leichte und zwei identische schwere Ketten (siehe Abb. I-1). Bis auf rund 50 variable Positionen unter den ersten 110 Aminosäuren gleichen sich die Antikörpermoleküle. Durch diese Positionsunterschiede Abb. I-1 : Modell eines Antikörpers 1 entstehen die variablen Regionen, die für die spezifische Bindung verantwortlich sind. An der Spitze jedes variablen Anschnitts befindet sich eine konkav geformte Bindungsstelle, deren dreidimensionale Struktur ein komplementäres Epitop erkennen und fest binden kann. Orte mit besonders hoher Variabilität nennt man hot spots; hier ist die Mutationsrate am höchsten. Die schweren und die leichten Ketten werden durch interchenäre Disulfidbrücken verkettet. Die einzelnen Ketten sind intrachenär ebenfalls durch Disulfidbrücken stabilisiert. Antikörper können auf verschiedene Weisen in ihre Untereinheiten gespalten werden (siehe Abb. I-2, nächste Seite). Die antigenbindenden Regionen (FAB) können durch Papain abgetrennt werden, so daß man zwei identische Fragmente und das an Rezeptoren bindende Teilstück FC erhält. Soll die Fähigkeit zur Präzipitation uns Agglutination erhalten bleiben, kann mit Pepsin gespalten werden. Dadurch bleiben die FAB-Regionen als Funktionseinheit erhalten und lediglich das FC-Fragment wird hydrolysiert. 1 Quelle: Spektrum der Wissenschaft: Immunsystem - 2 -

4 Abb. I-2: Enzymatische Spaltung von Antikörpern c) Zelluläre Abwehr Der zweite Teil des Abwehrmechanismus besteht, wie der Name vermuten läßt, aus Zellen. Die wichtigsten Zelltypen sind die Leukozyten. Je nach Herkunft unterscheide man zwischen T- und B-Lymphozyten. Das T stehe für thymus, das B für bonemarrow, also das Knochenmark. Weitere Unterscheidungen werden durch die Funktionen der Zellen gegeben. So gibt es T-Helferzellen, T-Killerzellen und T-Gedächtniszellen. Auf ihnen befinden sich hochspezifische Rezeptoren, mit denen sie gebundene (präsentierte) Antigene erkennen können. Die B-Lymphozyten produzieren Antikörper, die sie auf ihrer Zelloberfläche präsentieren. Plasmazellen entstehen durch die induzierte Zellteilung und nachfolgende Differenzierung zu ER-reichen, ihr Antikörper-Protein synthetisierenden und sezernierenden Effektorzellen. II. Ammoniumsulfatfällung a) Theoretische Grundlagen Die Löslichkeit des Proteins wird durch Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) so stark vermindert, daß es ausfällt. b) Versuchsziele, Aufgaben Das anti-bsa-protein soll mit Ammoniumsulfat ausgefällt werden. c) Versuchsdurchführung In einem Eppendorfgefäß werden 200 µl des anti-bsa-serums mit 200 µl der ausstehenden Ammoniumsulfatlösung (418 mg in 1 ml Wasser) versetzt und gut vermischt (Whirl-Mix). Durch zweiminütiges Zentrifugieren bei 5000 U min -1 erhält man das Protein als Sediment; der Überstand wird vorsichtig abpipettiert. Das Sediment wird in 200 µl PBS (phosphate buffered saline) gelöst (ebenfalls mit Hilfe des Whirl-Mix). Davon entnimmt man 20 µl und pipettiert sie in ein anderes Eppendorfgefäß. Den Rest der Lösung versetzt man mit wenig Hämoglobin, um eine Rotfärbung zu erhalten

5 III. Gelfiltration a) Theoretische Grundlagen Bei der Gelfiltration werden Moleküle nach ihrer Größe getrennt. Das Prinzip ist folgendes: Die Polymere des Gels bilden ein Netzwerk mit unterschiedlich großen Poren aus. Kleine Moleküle können sich dort einlagern, während die großen daran vorbei diffundieren. Aus diesem Grund bleiben die kleinen Moleküle länger in der Säule zurück. b) Versuchsziele, Aufgaben Durch die Gelchromatographie soll eine erste Reinigung der Proteinlösung erfolgen. Vor allem noch enthaltenes Ammoniumsulfat wird abgetrennt. c) Versuchsdurchführung Zuerst wird die Säule mit ca. 5 ml der Sephadex 50-Suspension gefüllt und nach dem Absetzen zweimal mit ca. 10 ml PBS äquilibriert, wodurch sich ein gleichmäßiges Gel absetzt. Nachdem fast der gesamte Überstand abgelassen worden ist, werden vorsichtig die 180 µl angefärbte Probe aufgetragen und ins Gelbett einlaufen gelassen. Die Probe wird mit ca ml PBS eluiert und das Eluat zu 1 ml in numerierten Eppendorfgefäßen aufgefangen. Die am stärksten gefärbte Fraktion wird für die Affinitätschromatographie aufbewahrt. d) Beobachtungen Von den eluierten Fraktionen sind bis auf vier alle nicht sichtbar gefärbt. Die stärkste Färbung weist die dritte Fraktion auf; sie wurde für den nächsten Versuch verwendet. IV. Affinitätschromatographie a) Theoretische Grundlagen Mit dieser Methode hat die Biochemie eines ihrer effektivsten Trennverfahren gewonnen. Die Grundlagen der Affinitätschromatographie liegen in spezifischen Wechselwirkungen zwischen (Makro)Molekülen. Besonders wichtig sind hierbei Antikörper Antigen, Protein Substrat, Hormon Rezeptor, Kohlenhydrat Lectin und komplementäre Nukleinsäuren. Wie bei allen chromatographischen Verfahren gibt es auch hier eine stationäre und eine mobile Phase. Die stationäre Phase besteht häufig aus hochmolekularen Biopolymeren wie Polysacchariden. An diese sind die Effektoren gebunden, die für die spezifische Affinität verantwortlich sind. An den Träger der stationären Phase werden eine Menge Anforderungen gestellt, u.a. chemische Resistenz, keine Wechselwirkungen und definierte Porengröße. Kompliziert ist daher die Bindung der Effektors an den Träger und zwar in der Weise, daß die funktionelle Einheit frei zugänglich bleibt. Eine Methode für Agarosegele ist die Aktivierung durch Bromcyan (siehe Skript, G-05 Seite 5). Die Effektivität der Trennung ist durch die Dissoziationskonstante des gebildeten Komplexes aus Effektor und Substrat gegeben. Je geringer sie ist, desto besser ist die Affinität und damit die Trennleistung. Zum Ablösen des Substrats muß man die Bedingungen häufig drastisch ändern (z.b. ph-wert oder Ionenstärke). Als Effektor in diesem Versuch wird ein 46 kda Protein (Protein A) aus staphyllococcus aureus verwendet, das in seiner Membran vorkommt. Es kann spezifisch mit den Fc- Regionen der IgG Molekülen interagieren und auf diese Weise zwei Antikörper - 4 -

6 gleichzeitig binden. Für die Bindung von 25 mg IgG sind 2 mg des Protein A notwendig. Die photometrische Messung beruht auf der Absorption zweier Aminosäuren (Tryptophan und Tyrosin) bei dieser Wellenlänge. Sie unterliegt allerdings großen Schwankungen. b) Versuchsziele, Aufgaben Durch die Affinitätschromatographie soll das anti-bsa von den übrigen Proteinen getrennt werden. Die erhaltenen Fraktionen werden in einem UV-Photometer auf ihren Proteingehalt untersucht. c) Versuchsdurchführung Die ausgegebene Sepharose -4Cl-Protein-A-Säule wird mit PBS dreimal gewaschen. Dann gibt man die zuvor aufbewahrte Proteinfraktion auf, läßt diese einsinken und eluiert mit PBS solange, bis das Eluat farblos ist. Damit wird erreicht, das die mit Hämoglobin markierten Proteine entfernt wurden. Um die an Protein-A gebundenen anti-bsa-moleküle freizusetzen, eluiert man mit dem Elutionspuffer, der einen ph- Wert von 2.5 hat. Damit die Proteine sich wieder regenerieren können legt man in die Eppendorfgefäße je 5µl einer 1 M Na2HPO4-Lösung vor; die Lösung erhält so einen ph-wert von ca Es werden ca. 10 Fraktionen zu 1 ml gesammelt, von denen bei 280 nm die Extinktion (gegen den Elutionspuffer als Referenzwert) gemessen wird. d) Meßergebnisse und Beobachtungen Bis das Eluat farblos ist, werden ca. 6 ml PBS benötigt. Die photometrische Bestimmung lieferte folgende Extinktionen: Fraktion E e) Auswertung und Diskussion Die Messung wurde nach der fünften Fraktion eingestellt, da dieser Wert bereits null war. Aufgrund der Extinktionen erkennt man deutlich, daß die Ablösung der Proteine schnell erfolgt. Schon nach der zweiten Fraktion ist kaum noch Protein in der Lösung enthalten. wie man anhand der graphischen Darstellung (Diagramm IV-1, nächste Seite) sieht, setzt sich der Peak der zweiten Fraktion sich klar von den übrigen Werten ab, so daß diese Fraktion eindeutig die größte Menge an Protein enthält

7 Elutionsdiagramm Extinktion Fraktionszahl Diagramm IV-1 : Elutionsdiagramm V. Titerbestimmung nach OUCHTERLONY a) Theoretische Grundlagen Zur Feststellung der Konzentration einer Antikörperlösung kann die Doppeldiffusions-Methode nach OUCHTERLONY eingesetzt werden. Das Prinzip beruht auf der Bildung von sichtbaren (opaken) Banden in einem Agarosegel In dem Gel können die Antikörper frei gegen ihre Antigene diffundieren und bilden am Äquivalenzpunkt eine Präzipitatlinie aus. Je nach Konzentration der zu untersuchenden Lösung liegt diese Linie in der Nähe der Auftragungsstelle der Antikörper oder der der Antigene. Mit geeigneten Substratkonzentration kann man daher die enthaltene Menge abschätzen. b) Versuchsziele, Aufgaben Die isoliert IgG-Fraktion aus IV wird dem Doppeldiffusionstest nach OUCHTERLONY unterzogen. c) Versuchsdurchführung In eine kleine Petrischale wird die heiße Agaroselösung gegossen und bis zum Erstarren stehengelassen. Mit Hilfe einer Stanze werden sieben Vertiefungen markiert, die mit einer Pipettenspitze abgesaugt werden. Dabei ist darauf zu achten, daß die Vertiefungen nicht bis auf den Glasboden reichen. In die Taschen werden folgende Lösungen (nächste Seite) aufgetragen: - 6 -

8 Reagenzglas, Tasche Die Verdünnungsreihe erhält man, indem man von der Stammlösung 40 µl in ein kleine Reagenzglas füllt, davon 20 µl entnimmt und in ein mit 20 µl PBS beschicktes Reagenzglas füllt. Davon entnimmt man wiederum 20 µl und verfährt wie zuvor. Die fertige Petrischale wird abgedeckt für vier Stunden in einer feuchten Kammer inkubiert. d) Meßergebnisse und Beobachtungen Es waren keinerlei Banden oder Veränderungen erkennbar. e) Auswertung und Diskussion Verdünnung Konzentration in mg/ml 1 Stammlösung 2 2 1: : : : : : Als Erklärung des Mißlingens kann eine zu hohe Verdünnung angegeben werden. Die untersuchte Fraktion enthält wahrscheinlich zu wenige Antikörper, da nur die stärksten Fraktionen aus zwei Säulenchromatographien verwendet wurden. Hinzu kamen Pipettierfehler, die bei so kleinen Mengen einen großen Einfluß auf die Ergebnisse haben. VI. SDS-Gelelektrophorese a) Auswertung und Diskussion Die Banden (6 und 7) der SDS-Page sind nur sehr undeutlich zu erkennen. Eine davon kommt durch die schweren Ketten mit ca. 50 kda, die andere durch die leichten Ketten mit ca. 25 kda zustande. Da bei der Elektrophorese die größeren (schwereren) Proteine weniger weit wandern, handelt es sich bei der ersten Bande um die 50 kda- Ketten, bei der zweiten um die 25 kda. Wie schon bei der Titerbestimmung nach OUCHTERLONY, sind hier die zu große Verdünnung und Pipettierfehler als Ursachen für die zu schwache Färbung anzusehen. Selbst bei der ungereinigten Fraktion ist keine deutliche Bandenbildung zu sehen