Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Molekulare Zellbiologie

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1 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Molekulare Zellbiologie Vorlesung "Grundlagen der Biologie I" WS 2013/14 Molekulargenetik Püschel 2013

2 Vorlesung Grundlagen der Biologie I Molekulargenetik 1 Einführung: Das Dogma der Molekularbiologie Teil 1 Molekulargenetik der Prokaryonten 2 Organisation und Replikation des bakteriellen Genoms 3 Transkription I: Prokaryonten 4 Genregulation I: Prokaryonten 5 Translation in Prokaryoten 6 Rekombinante DNA I Teil 2 Molekulargenetik der Eukaryonten 7 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen I 8 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen II 9 Zellzyklus, Mitose, Meiose 10 Meiose und sexuelle Fortpflanzung 11 Formale Genetik: Mendel I 12 Formale Genetik: Mendel II 13 Formale Genetik: Mendel II 14 Transkription II: Eukaryoten 15 Genregulation II: Transkriptionsfaktoren 16 Genregulation II: Transkriptionsfaktoren 17 Genregulation III: Spleissen 18 Genregulation IV: Translation in Eukaryoten 19 Rekombinante DNA II 1

3 Literatur zur Vorlesung Vorlesung Purves Kapitel , , Empfehlung Biologie. Markl, Jürgen (Hrsg.); Purves, William K.; Sadava, David; Orians, Gordon H.; Heller, H. Craig. Spektrum Verlag, ISBN: Der Stoff der Vorlesung deckt sich weitgehend mit dem Lehrbuch Biologie ("Purves"). Die Kapitel 11 bis 18 beihalten den Stoff der Teils Molekulargenetik. Der Inhalt diser Kapitel ist Prüfungsstoff, unabhängig davon ob er in der Vorlesung explizit diskutiert wurde. 2

4 Fragen zur Vorlesung Grundlagen der Biologie I Molekulargenetik 1) Formulieren Sie in einem Satz das zentrale Dogma der Molekularbiologie. Gibt es Ausnahmen von diesem Dogma? 2) Benennen sie die Schritte, in denen die genetische Information umgesetzt wird. Welche Makromoleküle sind an den einzelnen Schritten beteiligt? 3) Das Polynucleotid 5'-GGACCTGACAAAGTCAAGTCTT-3' ist Bestandteil einer kodierenden Sequenz. Beantworten Sie folgende Fragen: a) Wie ist die Sequenz des komplementären Stranges, in 5'->3' Richtung geschrieben? b) Wie lautet die Sequenz der entsprechenden mrna? c) Die vorliegende Sequenz ist Teil eines offenen Leserasters. Können Sie aus dieser Sequenz mit Hilfe einer Codon-Tabelle eindeutig ableiten wie die Sequenz des Proteins lautet? Begründung? 4) An welchen zellulären Prozessen sind RNA-Moleküle beteiligt? Nennen Sie mindestens 3 derartige Prozesse. 5) Nennen Sie vier Eigenschaften, die die Struktur der DNA beschreiben. 6) Definieren Sie den Begriff Gen. 7) Welche Voraussetzungen braucht eine DNA-Polymerase um DNA replizieren zu können? 8) Wodurch unterscheiden sich "leading" und "lagging strand"? 9) Beschreiben Sie die Schritte bei der Synthese des "leading" und des "lagging strand". 10) Die DNA-Helicase entwindet bei der Replikation die DNA. Benötigt sie dazu Energie? Begründung? 11) Nennen Sie drei Stichworte, die die Replikation charakterisieren. 12) Welche der folgenden Sequenzen sind Bestandteil eines prokaryotischen Promotors? a) -10 Region b) Pribnow-Box c) CAAT-Box d) GC-Box e) Shine-Dalgarno-Sequenz f) terc-sequenz g) -35 Region h) Costello-box 13) Welchen Strang der DNA benutzt die RNA-Polymerase als Template, den codogenen oder den codierenden Strang? 14) Was ist ein Sigma-Faktor und was ist seine Funktion? 15) Die Transkription kann in drei Phasen unterteilt werden. Welche sind dies und wodurch sind sie charakterisiert? 16) Wie erfolgt die Termination der Transkription in Bakterien? 17) Was ist der Unterschied zwischen virulenten und temperenten Phagen? 18) Skizzieren Sie den Aufbau des lac-operons. 3

5 19) Definieren Sie die Begriffe Induktor, Repressor, Operator und Operon. 20) Was ist der Unterschied zwischen Regulator- und Strukturgenen? 21) Beschreiben Sie die Prozesse, die zur Transkription des lac-operons führen. 22) Skizzieren Sie die Struktur des Lac-Repressors. Was ist die Funktion der einzelnen Protein-Domänen? 23) Was ist die Funktion des Lac-Repressors? 24) Was bedeutet der Begriff Katabolit-Repression? 25) Sie lassen E. coli in drei verschiedenen Nährmedien wachsen und messen die Aktivität des lac-operons. Welche Ergebnisse würden Sie bei den folgenden Medien erwarten und warum? a) Mininalmedium mit Glucose b) Mininalmedium mit Lactose c) Mininalmedium mit Glucose und Lactose 26) Welche Konsequenzen haben folgende Mutationen für die Regulation des lac-operons: a) Eine Mutation im lac-operator, die die Bindung von LacI verhindet. b) Eine Mutation in lacz, die die Bindung von Lactose verhindert. c) Eine Mutation in laci, die die Bindung des Induktors verhindert. d) Eine Mutation in laci, die die DNA-Bindung verhindert. e) Eine Mutation in der CAP-Bindungsstelle. 27) Skizzieren Sie den Aufbau des trp-operons. 28) Wie unterscheidet sich die Regulation des trp-operons von der des lac-operons? 29) Welche Sequenzen der mrna legen ein Leseraster fest? 30) Welche RNA-Moleküle sind an der Translation eines Proteins beteiligt und was ist ihre Funktion? 31) Definieren Sie die Begriffe Codon und Anticodon. 32) Beschreiben Sie die Vorgänge während der Elongationsphase der Translation. 33) Wieviel Bindungsstellen für trnas hat ein Ribosom? Was ist deren Funktion? 34) Welche der folgenden DNA-Sequenzen sind palindromische Sequenzen? a) GAACCT b) GACGTC c) TTAAGC d) GAATTC e) GGATCC f) GATC g) CGAT h) AAGTTC i) AACGTT h) GTTAAG i) TTATAA j) TTATTA 35) Was sind Restriktionsenzyme? 36) Sie haben die Aufgabe ein Plasmid mit einem Restriktionsenzym in möglichst viele Fragmente zu zerlegen. Zur Auswahl haben Sie die folgenden Enzyme: HindIII (Erkennungssequenz: AAGCTT), HaeIII (GGCC) und NotI (GCGGCCGC). Welches Enzym würden Sie auswählen und warum? 37) Was sind Plasmide? Welche Merkmale müssen Sie aufweisen, um als Klonierungsvektoren zu dienen? 4

6 38) Definieren Sie die Begriffe Euchromatin und Heterochromatin. 39) In Eukaryoten ist die DNA mit Proteinen zum Chromatin verpackt. Welche der folgenden Aussagen sind falsch und warum? a) Das Chromatin dient zum Schutz vor DNasen. b) Das Chromatin ermöglicht eine kompakte Organisation der DNA im Zellkern. c) Das Chromatin ermöglicht eine Grobkontrolle der Genexpression. d) Im Chromatin ist die DNA einmal um ein Histonoktamer gewunden. e) Das Heterochromatin enthält die aktiven rrna Gene. 40) Nennen Sie drei Elemente, die für die stabile Weitergabe von Chromosomen bei der Zellteilung notwendig sind. 41) Was ist die Funktion des Centromers? 42) Was ist die Funktion des Telomers? 43) Welche besondere Struktur zeichnet ein Telomer aus? 44) Welche Funktion hat die Telomerase? 45) Die Telomerase ist eine a) DNA-abhängige DNA-Polymerase b) RNA-abhängige DNA-Polymerase c) DNA-abhängige RNA-Polymerase d) RNA-abhängige RNA-Polymerase e) DNA-unabhängige RNA-Polymerase f) reverse Transkriptase g) inverse Transkriptase 46) Definieren Sie die folgenden Begriffe: Nucleoid, Nucleotid, Nucleosid, Nucleosom, Nucleolus, Nucleus, Nuclease. Welche dieser Verbindungen oder Strukturen sind in einer eukaryotischen Zelle zu finden? Welche dieser Verbindungen oder Strukturen enthält DNA, welche RNA? 47) Wie unterscheiden sich pro- und eukaryotische Genome? Nennen Sie mindestens 4 Merkmale. 48) Welche der folgenden Bestandteile der Zelle haben ein eigenes Genom? a) Ribosomen b) Mitochondrien c) Golgi-Apparat d) Centriolen e) Chloroplasten f) Tonoplast g) Endoplasmatisches Reticulum 49) Welche der folgenden Aussagen sind falsch und warum: a) Chloroplasten haben eine eigene Transkritpions- und Translationsmaschinerie. b) Die Erbinformation der Chloroplasten enthält alle Gene, um die vollständige Struktur dieses Organells aufzubauen. c) Die Gene der Chloroplasten werden unabhängig von denen des Zellkerns vererbt. d) Das Genom der Chloroplasten ist im Lauf der Evolution aus dem Genom des Zellkerns ausgelagert worden. 5

7 50) Zur Klärung der Verwandtschaftsverhältnisse von Homo sapiens sapiens und Homo sapiens neanderthalensis wurden mitochondriale DNA-Sequenzen isoliert und bestimmt. Weswegen eignen sich diese wesentlich besser zur Gewinnung von DNA- Sequenzinformation aus fossilen Proben als Sequenzen des nucleären Genoms? 51) Skizzieren Sie den Aufbau eines Retrovirus. Woraus besteht das Genom des Virus und wofür kodiert es? 52) Wie erfolgt die Replikation eines Retrovirus? 53) Was ist eine Reverse Transkriptase? 54) Was ist ein Retrotransposon? 55) Welche Ereignisse charakterisieren die einzelnen Phasen einer Mitose? 56) Wie ändert sich der DNA-Gehalt einer Zelle während des Zellzyklus? Wie die Chromosomenzahl? 57) Welche Ereignisse charakterisieren die einzelnen Phasen einer Meiose. 58) Wodurch unterscheidet sich die erste meiotische Teilung von einer mitotischen Zellteilung? 59) Erläutern Sie die Begriffe Synapsis, synaptonemaler Komplex, Cross-over und Chiasma. 60) Wie unterscheiden sich die Produkte von Mitose und Meiose? Nennen Sie mindestens drei Unterschiede. 61) Wodurch kommt es bei der Meiose zur Neuordnung des genetischen Materials? 61) Wie verändern sich DNA-Gehalt und Chromsomenzahl während der Meiose? 62) Fehler bei der Verteilung von Chromosomen in der Meiose haben schwere Erbkrankheiten zur Folge. Ein Beispiel dafür sind Turner's Syndrom (Geschlechtschromosomen XO) und Klinefelter's Syndrom, (Geschlechtschromosomen XXY). Wie nennt man die Störung der Meiose, die für eine Fehlverteilung der Chromosomen verantwortlich ist? Wieviel Chromosomen enthalten diese Chromosomensätze? Welches Geschlecht haben Individuen mit diesen Chromosomensätzen? 63) Für die Gene A, B, C wurden folgende Rekombinationsfrequenzen ermittelt: A/B: 2%, A/C: 5%, B/C: 7%, Stellen Sie mit Hilfe dieser Angaben eine Genkarte auf und begründen Sie Ihr Ergebnis. 64) Weibliche Calico-Katzen zeigen oft dreifarbig geflecktes Fell. Die schwarzen und orangene Fellfarbe wird durch ein X-chromosomales Gen bestimmt, für das zwei Allele bekannt sind, die für unterschiedliche Farben verantwortlich sind. Erläutern Sie warum ein dreifarbig geflecktes Fell nur bei weiblichen Katzen auftritt. 65) Definieren Sie die Begriffe Allel, homozygot und heterozygot. 66) Formulieren Sie die Mendelschen Gesetze. 67) Was besagt die Uniformitätsregel? 6

8 68) Was besagt die Spaltungsregel? 69) Was bedeutet der Begriff Reziprozität? Gilt dieses Prinzip für alle Erbgänge? 70) Wie spalten sich bei einem monohybriden dominant-rezessiven Erbgang die Phenotypen in der F2 auf? Wie würden sie sich bei einem dihybriden Erbgang aufspalten? 71) Erläutern Sie mit Hilfe eines Punnetschen Quadrats die in der F1 auftretenden Phenotypen bei der folgenden Kreuzung: WWvv x WwVv Die Allele W und V sind dominant über die Allele w und v. 72) Das Gen gbr bestimmt die Federfarbe einer seltenen Papageienart. Expression des dominanten Allels Gbr führt zu grünen Federn, des rezessiven Allels gbr zu blauen Federn. Bei der Kreuzung eines Männchens mit grünen Federn und eines Weibchens mit blauen Federn zeigten die Nachkommen güne und blaue Federn im Verhältnis 1:1. Was können Sie daraus über den Genotyp des Männchens schliessen? 73) Definieren Sie die Begriffe Mutation, Wildtyp und Polymorphismus. 74) Eine Mutation in einer codierenden Sequenz hat die Insertion von 3 Basenpaaren zur Folge. Welche Konsequenzen hat dies? 75) Können Mutationen ausserhalb der codierenden Sequenz Folgen für die Expression eines Gens haben? Begründung? 76) Welche Folgen haben die folgenden Mutationen (Bearbeitung mit Hilfe einer Codontabelle): a) CGA -> GGA b) CGA -> TGA c) CCA -> CCG d) CCC -> CGCC 77) Was unterscheidet die Transkription in Pro- und Eukaryoten? 78) Welches Enzym synthetisiert die mrna in Eukaryoten? 79) Was ist eine TATA-Box? 80) Was ist die Funktion eines Promotors, was die eines Enhancers? 81) Welche Funktionen haben allgemeine Transkriptionsfaktoren? 82) Was ist TFIID? 83) Eukaryotische Gene, die von der RNA Polymerase II transkribiert werden, können folgende Sequenzelemente enthalten: Enhancer, "Hormone-responsive Element" und Promotor. Was ist die Funktion dieser Sequenzen für die Kontrolle der Genexpression? 84) Eukaryotische Transkriptionsfaktoren sind modular aufgebaut. Welche Funktion können Protein-Domänen dabei übernehmen? Skizzieren Sie die Struktur eines eukaryotischen Transkriptionsfaktors. 85) Wie wird die Transkription eines eukaryotischen Gens durch camp reguliert? 86) Was bewirken Histon-Acetyltransferasen? Nennen Sie eine Beispiel für ein Protein mit Histon-Acetyltransferase Aktivität. 7

9 87) Wie stellt man sich die Wirkung von Enhancern vor? 88) Wodurch unterscheiden sich Pro- und Eukaryoten in der Regulation der Transkription? 89) Wie wird das 3'-Ende eines Transkriptes der Polymerase II erzeugt? 90) Was ist eine Polyadenylierung? 91) Definieren Sie die Begriffe Intron und Exon. 92) Warum ist kein Energieaufwand beim Spleissen von Transkripten notwendig? 93) Was ist ein Lariat? 94) Welche Schritte folgen in Eukaryoten auf die Transkription zur Erzeugung einer reifen mrna? 95) Wodurch unterscheiden sich die mrnas von Eubakterien und Eukaryoten? 96) Wodurch unterscheidet sich die Translation in Eubakterien und Eukaryoten? 97) Was ist ein Signalpeptid? 98) Wie wird ein Membranprotein bei der Translation in die Membran inseriert? 99) Welche Faktoren sind während der Translation für die Insertion eines Membranproteins in die Membran notwendig? 100) Ist das Signalpeptid Bestandteil des reifen Proteins? Was ist seine Funktion? 101) Auf welchem Prinzip beruht die PCR? 102) Aufgrund welchen Prinzips kann man in einem Southern-Blot ein spezifisches Gen nachweisen? 8

10 Einführung 1! Das Dogma der Molekularbiologie! Replikation! DNA! Transkription! RNA! Translation! Protein! 2!

11 Phosphat! Gruppe!! O! O=P-O! O! Zucker! (Deoxyribose)! CH2! C 4! Nucleotide! 5! O! C 3! C 2! C 1! N! Base! (A, G, C, T)! 3! RNA DNA Purine Pyrimidine Purine Pyrimidine Adenin Uracil Adenin Thymin Guanin Cytosin Guanin Cytosin 4!

12 Röntgenstrukturanalyse Strahlungsquelle Kristall 5! Basenpaarungen komplementärer Basen!! H-Brücken G C A G T C T A DNA: Polymer aus vier Bausteinen (A, G, C, T)! Doppelhelix mit komplementären und! antiparallelen Strängen! 6!

13 Was ist ein Gen? Die Definition änderte sich mit der Entwicklung der Genetik: 1) Ein Gen = Ein Merkmal (ein vererbbares Kennzeichen eines Organismus) 2) Ein Gen = Ein Protein (ein DNA-Abschnitt, der die Information für die Synthese eines Proteins trägt ) 3) Ein Gen = Eine Transkriptionseinheit (ein DNA-Abschnitt, der als ganzes transkribiert wird und die Information für ein Protein oder eine RNA enthält ) 7! Drei Reiche des Lebens! Eubakterien! Eukaryonten! Archaea! Chloroplasten! Mitochondrien! Endosymbiontentheorie! 8!

14 Organisation und Replikation des bakteriellen Genoms 9! Replikation 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' Komplementarität der DNA-Stränge ermöglicht Replikation der Erbinformation 10!

15 - DNA-Polymerasen benötigen zur Synthese:" 3'-OH Ende" Template!! 5' 3' OH C dgtp PP 5' G-3' OH C 11! Replikation in E. coli! 1) Initiation! 2) Elongation! 3) Termination! 12!

16 Das Genom der Prokaryoten ist zirkulär oric bp E. coli terc Das Genom hat einen Origin of Replication 13! 1) Initiation! DNA Replikation ist bidirektionell! 5' 3' 5' Replikationsgabel! 5' 3' Replikationsblase 5' Initiation der Replikation:! Replikationsursprung! (Origin of replication)! 14!

17 2) Elongation! RNA-Polymerase (Primase)! synthetisiert einen RNA-Primer -> 3'OH-Ende! 5' 3' OH nt 5' 15! DNA Replikation ist diskontinuierlich! lagging strand (Folgstrang)! Okazaki-Fragmente! Bewegung der Replikationsgabel! leading strand (Leitstrang)! 16!

18 DNA Replikation ist diskontinuierlich! leading strand: kontinuierliche Synthese! ine Initiation durch Primase! lagging strand: Synthese in Fragmenten (Okazaki Fragmente)! wiederholte Initiation durch Primase! 17! DNA Polymerasen in Prokaryoten (E. coli)! DNA-Polymerase I! DNA-Reparatur, DNA-Replikation! eine Untereinheit mit! 5'->3' Exonuklease und! 3'->5' Exonuklease! DNA-Polymerase III! DNA-Replikation, Core-Enzym aus! 3 Untereinheiten! 3'->5' Exonuklease!! 18!

19 Synthese des "lagging strand"! 1) Synthese des RNA-Primers durch eine RNA-Polymerase (Primase)! 2) Verlängerung des RNA-Primers durch DNA-Polymerase III! 3) Entfernen des RNA-Primers und Auffüllen der Lücke durch DNA- Polymerase I! 4) Verknüpfung der Fragmente durch DNA-Ligase! 19! Replikationskomplex! Helicase! lagging strand (Folgstrang)! SSB! ATP! SSB! Helicase! leading strand (Leitstrang)! ADP! DNA-Polymerase! 20!

20 DNA-Polymerase III besteht aus! mehreren Untereinheiten! α-untereinheit:! Katalytischer Core! " τ-untereinheit:! Dimerisation! " β-untereinheit:! Prozessivität, ("Clamp")! " γ-komplex (5 Proteine):! Assemblierung β-ring auf DNA ("Clamp-loader")! 21! DNA-Polymerase Holoenzym! β" α" τ" β" γ" τ" α" 2 α-untereinheiten:!katalytischer Core! 2 τ-untereinheiten:!dimerisation! 2 β-untereinheiten:! Clamp! 1 γ-komplex:!!"clamp-loader"! 22!

21 Topoisomerasen! Gyrase! ATP! ATP! Topoisomerase I! 23! DNA-Replikation ist:! 1) Semikonservativ! 2) Bidirektional! 3) Diskontinuierlich! 24!

22 Transkription I: Prokaryonten 25! 5' 3' codierender Strang codogener Strang 3' 5' DNA 5' 3' Template Strang 3' 5' 5' 3' mrna 26!

23 RNA-Polymerase: DNA-abhängige RNA-Polymerase! RNA-Polymerasen kopieren den codierenden Strang! Initiation codierende Region Termination Promotor! RNA-Polymerase! 5' 3' Transkript = mrna Promotor: Sequenzen, die es der Polymerase! erlauben den Anfang des Gens zu erkennen! Terminator: Sequenzen, die es der Polymerase! erlauben das Ende des Gens zu erkennen! 27! Initiation +1! CAC ! -1! DNA! +1! AC ! mrna! ATG! Promotor! AUG! codierende Region Transkript mrna! DNA! 28!

24 -35 Region! -10 Region! Initiation -35! -10! +1! TCTTGACA TATAAT------CAT ! -1! ATG! Promotor! kodierende Region 29! Der Sigma-Faktor erlaubt die Erkennung der Promotor-Region! RNA-Polymerase - Untereinheiten:! α" β! β'!! σ! Core-Enzym! α, β, β'! σ" σ" Holoenzym! 30!

25 Initiation der Transkription! 12 bp! -9! +3! 5' 3' σ" 3' 5' Template Strang -55! +20! offener Promotor-Komplex!! 31! Elongation! 5' 3' σ" Template Strang 3' 5' σ" Transkript! 5' 3' Template Strang 3' 5' 32!

26 Termination! Zwei Mechanismen der Termination in E. coli! 1) Rho-unabhängige Termination: "Stem-Loop"-Struktur! der mrna, bei der Mehrzahl der E. coli Gene zu finden!! 2) Rho-abhängigen Termination: Bindung des Rho-Protein! an die mrna führt zur Termination!! 33! Prokarotische Gene! - Alle Gene durch die gleiche RNA-Polymerase transkribiert! - σ-faktor : Erkennung von Promotoren! - Termination: RNA-Pol. terminiert an einer definierten Position!! 34!

27 polycistronische mrna in Prokaryoten Initiation kodierende Region Termination Promotor! Transkript -10-Region: Pribnow-Box oder TATA-Box!! -35-Region! 35! 36!

28 Genregulation I: Prokaryonten 37! Enzyme des Lactose-Stoffwechsels! β-galactosidase!!lacz! Lactose-Permease!!lacY! Transacetylase!!lacA! in Lactose-freiem Medium nicht exprimiert! Lactose als einzige C-Quelle:! Induktion der Enzyme! von einem Promotor transkribiert: P lac! P lac! lacz! lacy! laca! 38!

29 P i! laci! Das Lac-Operon! P lac! O lac! lacz! lacy! laca! P i! P i : Promotor des Lac-Repressor! O lac! laci! Gen für Lac-Repressor! O lac : Operator! Regulatorgen! P lac! lacz! lacy! laca! P lac : Promotor des lac-operons! Strukturgene! 39! P i! laci! P lac! O lac! laci! laci! laci!laci! lacz! lacy! laca! laci! laci! laci! laci! laci! laci! laci!laci! 40!

30 P i! laci! P lac! O lac! lacz! lacy! laca! laci! LacZ! LacY! LacA! laci! laci! laci! laci!laci! laci!laci! Induktor! 41! Das Lac-Operon! P i! laci! P lac! O lac! lacz! lacy! laca! P i : Promotor des Lac-Repressor! Lac-Repressor! O lac : Operator! P lac : Promotor des lac-operons! Regulationseinheit in Bakterien, die aus Promotor, Operator! und Strukturgenen besteht, die gemeinsam reguliert werden.!! Folge von Strukturgenen als! polygenische (= polycistronische) mrna trankribiert! 42!

31 Das Lac-Operon! Jacob-Monod-Modell! In Abwesenheit des Induktors (Lactose) bindet der! Lac-Repressor an den Operator und reprimiert das Lac-Operon! Die RNA-Polymerase wird daran gehindert die! Strukturgene zu transkribieren! Der Induktor bindet an den Lac-Repressor ->! Konformationsänderung! Der Repressor ist nicht mehr in der Lage den! Operator zu binden ->! RNA-Polymerase kann die Transkription initiieren! 43! Lac-Repressor! Dimere bilden eine funktionelle Einheit! zwei Dimere -> Tetramer! modularer Aufbau! DNA-Bindungs-! domäne! flexibler Linker! Induktor-Bindung! Tetramerisierung! 44!

32 P i! laci! O lac! P lac! O lac! lacz! lacy! laca! +1! ca. 90 bp! ca. 400 bp! P i! laci! O lac! P lac! O lac! lacz! Zwei intakte Operatoren für vollständige Repression notwendig! 45! tetramerer Lac-Repressor kann zwei Operator-Sequenzen! gleichzeitig binden, für vollständige Repression notwendig! -> DNA-Schleife! Olac! laci! laci! laci!laci! P lac! O lac! laci! Pi! lacz! 46!

33 Katabolit-Repression des lac-operons durch Glucose! Katabolit-Repression: Glucose-Repression der! Lactose Verwertung.! In Anwesenheit von Glucose wird das! lac-operon nicht transkribiert! Signal: camp (Adenosin-3'-5'-Monophosphat)! 47! Katabolit-Repression des lac-operons durch Glucose! camp bindet an CAP (catabolite activator protein)! = CRP (camp receptor protein)! camp-bindung -> Konformationsänderung! CAP camp erkennt DNA-Sequenz 5' des lac Operators! P i! laci! O lac!cap! P lac! O lac! lacz! CAP camp fördert die Bindung der RNA Polymerase an! den Promotor des lac Operons! 48!

34 Katabolit-Repression des lac-operons durch Glucose! Glucose! ATP! Adenylat-Cyclase! camp! PP! Glucose:! inaktive Cyclase! geringe camp-konzentration! - :! aktive Cyclase! hohe camp-konzentration! 49! RNA-Polymerase! -35! -10! +1! laci! O lac! CAP! P lac! O lac! lacz! 50!

35 P i! laci! CAP! P lac! O lac! lacz! lacy! laca! CAP! Glucose! Lactose! 51! Glucose! Glucose + Lactose! Lactose! [camp]! [camp]! [camp]! CAP inaktiv! CAP inaktiv! CAP aktiv! Repressor aktiv! Repressor inaktiv! Repressor inaktiv! lac Operon nur aktiviert wenn! Glucose fehlt UND Lactose vorhanden ist! 52!

36 Operons ermöglichen koordinierte Regulation von Genen! positive Kontrolle:! Aktivierung des Promotors durch CAP camp! negative Kontrolle:! Repression des Promotors durch lac-repressor! 53! DNA-Bindungsdomäne : Helix-Turn-Helix-Motiv! ein Monomer bindet jeweils eine Hälfte der Bindungsstelle! Bindung des Induktors -> Konformationsänderung! -> Bindung an die Erkennungssequenz verhindert! 54!

37 P i! trpr! P trp! O trp! trpe! trpd! trpc! P i! P i : Promotor des Trp-Repressor! O trp! trpr! Gen für Trp-Repressor! trp : Operator! Regulatorgen! P trp! trpe! trpd! trpc! trpb! trpa! P trp : Promotor des trp-operons! Strukturgene! 55! P i! trpr! P trp! O trp! trpe! trpd! trpc! TrpE! TrpD! TrpC! 56!

38 P i! trpr! P trp! O trp! trpe! trpd! trpc! TrpE! TrpD! TrpC! Tryptophan (Korepressor)! 57! P i! trpr! P trp! O trp! trpe! trpd! trpc! 58!

39 P i! trpr! P trp! O trp! trpe! trpd! trpc! Trp! 59! Lac-Operon! Lac Repressor! Induktor: Allolactose! Induktion! Induktor verhindert! Bindung an Operator! Trp-Operon! Trp Repressor! Korepressor: Tryptophan! Repression! Korepressor induziert! Bindung an Operator! 60!

40 Translation in Prokaryoten 61!! 5' ccatgaccgagcggcccgagatgcaggccatcaagtgatt! 3' ggtactggctcgccgggctctacgtccggtagttcactaa! M T E R P E M Q A I K * V -! ORF DNA- und Proteinsequenz sind kolinear Ein Triplett (Codon) -> eine Aminosäure Start und Stop Codon legen Anfang und Ende der kodierenden Region fest Open Reading Frame (ORF) (offenes Leseraster)! 62!

41 5'-AUG UGG UAG -3' 3'-UAC UCC AUC -5' 5'-AUG UGG UAG -3' M T * 3'-UAC UCC AUC -5' H P L 63! 3 Leseraster 5' tgccattgctgcaggtcgacggatccggggaattcccggggatcccgtcg! ! acggtaacgacgtccagctgcctaggccccttaagggcccctagggcagc!! 5' 3 Leseraster 64!

42 RNA übernimmt drei verschiedene Rollen bei der Proteinbiosynthese (Translation)! 1) mrna: Anweisung für die Art und! Reihenfolge der Aminosäuren! 2) trna: entziffert mrna und! trägt die Aminosäuren! 3) rrna: bildet zusammen mit Proteinen die! Ribosomen, die Proteinsynthesemaschine! 65! Anticodon! 3' 5' C G G! mrna 5' G C C! 3' Codon! 66!

43 Aminoacyl-tRNA-Synthetase! Vernüpfung von Aminosäure und trna,! mindestens 20 verschiedene Enzyme! eines für jede Aminosäure! trna! Aminosäure! ATP! Aminoacyl-tRNA! 67! Prokaryotische Ribosomen! 50S-Untereinheit: 23 S, 5 S rrna! 50 S! 30S-Untereinheit: 16 S rrna! 60% RNA! 40 % Protein! 30 S! 70 S! 68!

44 Translation:! Initiation, Elongation und Termination! Shine-Dalgarno-Sequenz! Initiation! Sequenz im 5'-nichtcodierenden Bereich der mrna! Ribosomen-Bindungsstelle! ATTCCTCCACUAG! AGGAGGU! 16 S rrna 3' 5' AUG 3' mrna 69! Die drei Phasen der Translation werden durch!! Initiationsfaktoren! Elongationsfaktoren! und Terminationsfaktoren gesteuert! Initiationsfaktoren verhindern die! vorzeitige Bindung der 50 S Untereinheit! Elongationsfaktoren sorgen für den geordneten! Ablauf der Elongation! 70!

45 Synthese: N-Terminus -> C-Terminus 5' 3' N NH 2 - C -COOH 1. Aminosäure = 1. Codon 71! Expression von rekombinantem Insulin in Bakterien! Protein! DNA Sequenz! Expression in Bakterien! 72!

46 Expression von rekombinantem Insulin in Bakterien! Protein! DNA Sequenz! Expression in Bakterien! ATG Insulin TAG 73! Eco RI ist eine Endonuclease, die eine palindromische Sequenz erkennt 5' ----GAATTC----! 3' ----CTTAAG----! ----G! -OH! ----CTTAA! P-! "klebrige (sticky) Enden" AATTC----! G----! 74!

47 m! 5' ----GAATTC----! 3' ----CTTAAG----! m! Methylierung der Erkennungssequenz GAATTC durch! die EcoRI-Methylase blockiert die Hydrolyse durch Eco RI! 75! "Chromosom"! F-Plasmid ("extrachromosomales" autonomes genetisches Element)! ca. 100 kb! 76!

48 Klonierungsvektoren! Plasmide: episomale (= extrachromosomale Elemente)! autonom replizierende zirkuläre DNA-Moleküle!! F-Plasmid: enthält Gene für Übertragung von! DNA-Molekülen zwischen Bakterien! R-Plasmid: enthält zusätzlich Gen für Antibiotika-Resistenz! Klonierungsvektor:! Origin of replication! Selektierbarer Marker (Antibiotika-Resistenz)! Region zur Insertion fremder DNA! 77! Transposon: ein mobiles genetisches Element, das an! beliebigen Stellen eines Genoms inserieren kann! Transposon! 78!

49 replikative Transposition! das Transposon wird kopiert, die Zahl der Transposons nimmt zu! nicht-replikative Transposition! das Transposon wird als Einheit bewegt, die Zahl der Transposons! bleibt konstant! 79! Bakterielle Transposons! Insertionssequenzen (IS-Elemente)! (1-2 kb)! Transpoase! kodierende Region! 5 bis 10 bp! direct repeat! 9-50 bp! inverted repeat IS 5! nicht-replikative Transposition! 80!

50 Bakterielle Transposons! Beispiel: Tn9 (zusammengesetztes Transposon)! Transposon! IS! IS! Antibiotika-! Resistenzgen! duplizierte 5 bp! 81! Klonierungsvektor! EcoRI pbr322! 4363 bp! Ori amp R 82!

51 EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI Restriktionsverdau! Ligation! EcoRI 83! Verdau eines Genoms mit EcoRI! Restriktionsfragmente! EcoRI Transformation! 84!

52 Restriktionskarten EcoRI HindIII HindIII EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI HindIII HindIII 85! EcoRI HindIII HindIII EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI HindIII HindIII + 1: Grössen-! Standard! 2: unverdaut! 3: EcoRI! 4: HindIII!! 86!

53 Expressionsvektor p T7! MCS pet bp Ori amp R p T7 : Promotor, T7 Phage! MCS: Multiple cloning site! 87! Verdau eines Genoms mit EcoRI Restriktionsfragmente EcoRI Transformation 88!

54 Bakteriophagen! virulente Phagen: Infektion hat immer Zellyse zur Folge!! temperente Phagen: neben lytischer Vermehrung! Lysogenisierung als alternativer Vermehrungsweg! 89! Der lytische Replikationszyclus des E. coli Bacteriophagen T4! Lyse der Zelle! Infektion! Replikation! 90!

55 λ Phage! E. coli Genom! integrierter λ Phage (Prophage)! 91! Der Bacteriophage λ hat zwei Möglichkeiten! Infektion! Replikation! Integration ins! Wirtsgenom! lytischer Zyklus! lysogener Zyklus! Lyse! Replikation! zusammen! mit Bakterien-Genom! 92!

56 Verdau EcoRI Restriktionsfragment rekombinante λ-phagen! Infektion 93! 5'... CCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGGGGGAAC TGTGGACCACCTTCGAGAGATGGATCACA 94! 5'!

57 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen!! Der Zellkern Heterochromatin: inaktives Chromatin Euchromatin: aktives Chromatin Kernmembran Chromatin Heterochromatin Euchromatin Nucleolus: Ribosomen Kernporenkomplex

58 Eukaryotische DNA ist in Chromosomen verpackt! 1) Genom in Chromosomen! unterteilt!! 2) Zellteilung:! DNA wird kondensiert!! Das Genom der Eukaryoten ist linear! 1 Chromosom: eine DNA-Doppelhelix! Telomer! Centromer! Telomer!

59 Mitose Tochterzellen Interphase Zellzyklus! DNA-Synthese Replikation 1 Chromosom Mitose 2 Chromatide

60 Metaphasen Chromosom Chromatid Centromer! DNA-Sequenz, bindet Kinetochor!! dadurch Verknüpfung mit Spindelapparat!!! Kinetochor! Spezialisierter Proteinkomplex!! Spindelapparat! Mikrotubuli, mit Kinetochor verknüpft!!! Cohesin! Verbindung der Schwesterchromatiden Chromosomensatz: 2n (diploide Zelle) Jedes autosomale Gen kommt in 2 Kopien vor Mensch: 23 Chromosomenpaare, 2n = 46 Chromosomen 1-22: Autosomen, X, Y: Geschlechtschromosomen

61 Für die stabile Vererbung von Chromosomen sind 3 Elemente notwendig: - "Origins of Replication" Initiation der Replikation - Centromer: Verteilung bei der Zellteilung - Telomere: Schutz der Enden Chromatin Nucleosom: DNA + Histon-Oktamer

62 Histon-Oktamer: je zwei Kopien von Histon H2A Histon H2B Histon H3 Histon H4 zusammen mit 146 bp DNA R K R K K R K K K K K R R H3 Acetylierung Phosphorylierung Methylierung Lysin - (CH2) 4 -NH (CH2) 4 -NH-COCH 3 flexibler N-Terminus Globuläre Domäne R: Arginin K: Lysin S: Serin

63 R K R K K R K K K K K R R H3 Acetylierung Phosphorylierung Methylierung Lysin - (CH2) 4 -NH (CH2) 4 -NH-CH 3 flexibler N-Terminus Globuläre Domäne R: Arginin K: Lysin S. Serin Organisation des Chromatins Interphase Verpackung in Nucleosomen ("Beads on a string") Mitose Verpackung in Nucleosomen ("Beads on a string") 30 nm Faser 30 nm Faser Chromatin-Schleifen Chromatin-Schleifen Euchromatin Heterochromatin (Centromere, Telomere) Chromosomen

64 DNA Replikation in Eukaryoten! erfolgt in Abschnitten: Replikons! Replikation in Eukaryoten: Chromatin! Organisation der DNA zu Chromosomen Eukaryotische Genome: in mehrere Chromosomen unterteilt Chromosom: eine lineare DNA mit mehreren Origins of replication (Replikons) Chromosomen: DNA durch Histone und andere Proteine zum Chromatin verpackt Centromere und Telomere: Stabilität und Vererbung von Chromosomen

65 Telomere schützen die Chromosomen vor:! Rekombination! Fusion mit anderen Chromosomen! Erkennung als beschädigte DNA! Telomere enden mit einer t-loop Struktur! 5'! 3'! 5'! 3'! D-Loop! 5'! t-loop! D: displacement t: telomere

66 5'! 3'! 5'! 3'! Tetrahymena:! nt! ----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG! (TTGGGG)n! Telomerase! Polymerase mit zwei Untereinheiten:!!!Protein (TERT: Telomerase Reverse Transkriptase)!!RNA (TER: Telomerase RNA)!

67 5'! 3'! 5'! 3'! 3'! 5'! RNA! AACCCCAAC! ----TTGGGGTTG! GGGTTG! Tetrahymena! 5'! 3'! 5'! 3'! 3'! 5'! AACCCCAAC! GGTTGGGGTTG! GGGTTG! Tetrahymena!

68 Telomerase RNA: Template! zur Synthese des 3'-Überhangs der Telomere! AACCCCAAC! GGTTGGGGTTG! AACCCCAAC! GGTTGGGGTTGGGGTTG! TERT: RNA-abhängige DNA-Polmerase! Die Grösse der Genome verschiedener Organismen E. coli 4,5 Mb (4,5 x 10 6 ) S. cerevisiae 12,1 Mb D. melanogaster 165 Mb C. elegans 97 Mb Amphibien Mb H. sapiens 3300 Mb Pflanzen Mb

69 Organisation des Genoms Sequenzklassen im Genom der Eukaryoten! - "single copy" Sequenzen! - repetitive Sequenzen! Single copy Sequenzen! 1) Protein-kodierende Gene! 2) Gene für rrna, trna, andere "kleine" RNAs! 3) nicht-kodierende RNAs (ncrnas)! 4) nicht transkribierte Sequenzen!

70 Genstruktur: Eukaryonten Exon! Intron! Exon! Transkription! AUG! STOP! Primärtranskript: pre-mrna! Spleissen! mrna! Genstruktur: Eukaryonten Exon! Intron! Exon! Intron = Abschnitt des Primärtranskriptes, das durch Spleissen entfernt wird und nicht Bestandteil der reifen mrna ist Exon = Abschnitt des Primärtranskriptes, das Bestandteil der reifen mrna ist

71 Repetitive Sequenzen - wiederholte Sequenzelemente: ähnlich aber nicht identisch - hochrepetitive Sequenzen (auch Satelliten-DNA genannt) Hunderte von Repeats an einigen Stellen des Genom konzentriert wie Centromere (GAAAAA AG! TC T)! Repetitive Sequenzen - mittelrepetitive Sequenzen z.b. Telomere z.b. Gene für trna z.b. Transposons Transposon:! mobiles genetisches Element! Insertion an beliebigen Stellen des Genoms!

72 Transposon:! mobiles genetisches Element! Insertion an beliebigen Stellen des Genoms! Chr 1 Transposon! Chr 5 Chr 1 Chr 5 Transposon:! mobiles genetisches Element! Insertion an beliebigen Stellen des Genoms! nicht-replikative Transposition! Transposon als Einheit bewegt, Zahl Transposons konstant!

73 Transposon:!! Beispiel: P-Element, Drosphila! Transpoase: Rekombinase, vermittelt Transposition Beispiel: Sleeping Beauty, künstliches Transposon! Transposon:! mobiles genetisches Element! Insertion an beliebigen Stellen des Genoms! Chr 1 Chr 5 replikative Transposition! Transposon kopiert, Zahl Transposons steigt!

74 Retrotransposon Transposons, die sich durch Reverse Trankription verbreiten Chr 1 Transkript DNA Chr 5 Integration in Genom Aufbau eines Retrovirus! Glykoproteine! RNA-Genom! Lipidhülle! Virus-Kern! LTR! gag! pol! env! LTR!

75 Aufbau eines Retrovirus! gag (gruppenspezifisches Antigen):! Bestandteile des Viruskerns! pol (polymerase):! Reverse Transkriptase, Integrase! env (envelope):! Glykoproteine der Membranhülle! Retroviren: RNA-Viren! RNA Genom in DNA umgeschrieben! RNA Genom Reverse Transkription Integration integrierter Pro-Virus Transkription durch RNA-Polymerase der Zelle neue virale Genome mrna zur Produktion viraler Proteine

76 Retroviren: RNA-Viren!! in doppelsträngige DNA umgeschrieben!!! (Reverse Transkriptase)!! integrieren in das Wirtsgenom! Einige repetitive Sequenzen entstehen durch reverse Transkription Das Dogma der Molekularbiologie DNA RNA Protein

77 Das Genom enthält nicht nur kodierende Sequenzen Nur 5-10% des Genoms der Eukaryoten! sind kodierende Sequenzen!!! Rest:!! Single Copy Sequenzen (z.b. Introns, Kontrollelemente)! Repetitive Sequenzen! Wieviel Gene gibt es?! Organismus! H. pylori! E. coli!! S. cerevisiae!! C. elegans!! D. melanogaster!! H. sapiens!! Reis! Vorhergesagt! Zahl der proteinkodierenden Gene! 1589! 4290!! 5726!! 19820!! 13472!! ca !! ca !

78 Immunoglobuline: V-D-J Rekombination! V (ca. 100)! D (ca. 30)! J (6)! C! variable Region! konstante Region! Antigen! schwere Kette! leichte Kette! Immunoglobulin: 2x schwere Kette + 2x leichte Kette! Purves: Kap. 18 (S. 456)! Campbell: Kap. 43! Immunoglobuline: V-D-J Rekombination! vor V-D-J Rekombination! V (ca. 100)! D (ca. 30)! J (6)! C! nach V-D-J Rekombination! VDJ! Purves: Kap. 18 (S. 456)! Campbell: Kap. 43!

79 V (ca. 100)! D (ca. 30)! J (6)! C! vor V-D-J Rekombination! nach V-D-J Rekombination! Hypermutation! Transkript! Protein! Purves: Kap. 18 (S. 456)! Campbell: Kap. 43! Extrachromosomale Gene! mtdna! ctdna!

80 Mitochondrien und Chloroplasten:! mehrere Kopien ihres Genoms!! Mitochondrien: 2-10 Kopien (10 kb - 2 Mb)! Chloroplasten: Kopien ( kb)!!!!darunter Gene für:!!trnas, rrna, Proteine -> eigene Translation! Das Genom kodiert nur für kleinen Teil! der Proteine der Organellen! Zellzyklus, Mitose, Meiose

81 M! Mitose G 2! Tochterzellen Interphase Zellzyklus! G 1! S! DNA-Synthese Prophase Chromatin kondensiert zu Chromosomen Bildung Mitosespindel Prometaphase Kernhülle zerfällt Spindelfasern binden Kinetochor Metaphase Chromosomen in Metaphasenplatte Anaphase Trennenung der Schwesterchromatiden -> entgegengesetzte Pole Telophase Neubildung des Zellkerns Dekondensierung der Chromatiden

82 Cohesin Komplex! Interphase! Prophase! Metaphase! Cohesin Komplex! Separase! Metaphase! Anaphase!

83 Mitose Prophase Prometaphase Metaphase Anaphase Telophase Cytokinese Chromatin kondensiert zu Chromosomen Bildung Mitosespindel Kernhülle zerfällt Spindelfasern binden Kinetochor Chromosomen in Metaphasenplatte Trennenung der Schwesterchromatiden -> entgegengesetzte Pole Neubildung des Zellkerns Dekondensierung der Chromatiden Zellteilung Kontraktiler Ring! (aus Aktin und Myosin)! trennt die Zellen! Synthese der neuen Zellwand! (durch Phragmoplast)! trennt die Zellen!

84 Interphase G1 S G2 M G1 DNA-Gehalt pro Zelle 4x 2x n=2 x = 2 n=2 x = 4 n=2 n=2 n=2 x = 2 1x x = DNA-Gehalt n = Chromosomensatz (diploid, n=2) Zeit Kontrolle des Zellzyklus Zellteilung nicht vor Verdopplung der Zellmasse nicht vor Ende der Replikation (Replikation einmal und nur einmal )

85 zentraler Regulator koordiniert alle Prozesse des Zellzyklus:!! 1. Cyclin-abhängige Proteinkinasen (Cdk)!!!!!! Cdk 2. Cycline!!! Kontrolle des Zellzyklus Kontrolle des Zellzyklus zentraler Regulator koordiniert alle Prozesse des Zellzyklus:!! Cdk Cdk Cdk inaktiv Cdk/Cyclin Komplex aktiv

86 Kontrolle des Zellzyklus Synthese von neuem Cyclin Interphase Abbau von Cyclinen Cdk Cdk Cdk Mitose Konzentration M G 1 S G 2 M G 1 S G 2 M Zeit Menge Cyclin Aktivität Cdk/Cyclin Cdk

87 Kontrollpunkt für! DNA-Integrität! M! Mitose Interphase G 2! Kontrollpunkt für! nicht-replizierte! DNA! S! Zellzyklus! DNA-Synthese Tochterzellen G 1! G 0! Wachstumsfaktoren! (Mitogene)! Kontrollpunkt für! DNA-Integrität! Kontrolle des Zellzyklus Kontrolle an spezifischen Punkten des Zellzyklus G1: Restriktionspunkt Entscheidung zur Replikation entscheidender Kontrollpunkt in tierischen Zellen G2: Entscheidung zur Zellteilung

88 Meiose und sexuelle Fortpflanzung haploide Zellen! n = 23! Gameten! Meiosis! Keimbahn Befruchtung! Ovar! n = 46! Testis! diploide Zellen! Mitose! Zygote!

89 Interphase Meiose 1 Meiose 2 G1! S! G2! DNA-Gehalt pro Zelle 4x 2x n = 2 n = 2 n = 1 n=2 n=1 1x n = 1 x = DNA-Gehalt n = Chromosomensatz (diploid, n=2) Zufällige Segregation homologer Chromosomen! Gameten Kombinationen

90 Zufällige Segregation homologer Chromosomen! n mögliche Chromosomenkombinationen! n = haploide Chromosomenzahl! Mensch: 2 23 = > 8,4 x 10 6 mögliche Kombinationen! Interphase! Prophase I!

91 Metaphase I! Anaphase I!

92 Anaphase II! Rekombination in der Meiose

93 Rekombination! 1) homologe Rekombination: Austausch von DNA-Abschnitten! zwischen gleichen oder ähnlichen Sequenzen! 2) nicht-homologe = integrative Rekombination:! Einbau eines DNA-Abschnitts in ein anderes DNA-Molekül! unhabhängig von Sequenzhomologien (Beispiel: Transposon)!!! Homologe Rekombination! Voraussetzung! Strangbrüche! Einzelstrang-DNA Bereiche! Cross-over! "Branch migration"!

94 Cross-overs führen zu neuen Allelkombinationen! A! B! a! b! A! a! B! b! A! a! b! B! Chiasma! Meiose I (Reduktionsteilung)! Prophase I:! wesentlich länger als bei der Mitose! Synapsis: paarweise Anordnung homologer Chromosomen! Chiasmata als Folge von homologer Rekombination! Metaphase I:! Metaphasenplatte: Tetrade homologer Chromosomen! voneinander unabhängige Anordnung der Chromosomen! Anaphase I:! Wanderung homologer Chromosomen! Schwesterchromatiden bleiben an Centromeren verbunden! Telophase I und Cytokinese!

95 Prophase II! Metaphase II! Anaphase II! Telophase II! analog zur Mitose! aber: haploider Chromosomensatz! Cytokinese! Mitose: es entstehen 2 Tochterzellen, die genetisch! identisch zueinander und zur Elternzelle sind! Meiose: es entstehen 4 Tochterzellen, die sich genetisch! voneinander und von der Elternzelle unterscheiden! Meiose I: homologe Chromosomen werden getrennt! Mitose: Schwesterchromatiden werden getrennt!

96 Cohesin Komplex! Interphase! Prophase I! Cohesin Komplex! Prophase I! Metaphase I!

97 Cohesin Komplex! Metaphase I! Anaphase I! Cohesin Komplex! Separase! Metaphase II! Anaphase II!

98 Cross-over während Prophase I! synaptonemaler Komplex! hält homologe Chromosomen! zusammen! Synapsis! paarweise Anordnung! homologer Chromosomen!! Chiasma! Struktur in Meiose! zeigt Cross-over an! Homologe Rekombination in der Meiose! Homologe Rekombination -> neue Allelkombinationen! Cross-over -> Austausch von Blöcke zwischen!!!!!homologen Chromosomen! Ergebnis: Erhöhung der genetischen Diversität!

99 Mitose ist eine konservativer Prozess der den Status Quo! aufrechterhält! Meiose erzeugt dagegen Variation! 1) Zufällige Verteilung mütterlicher und väterlicher! Chromosomen! 2) Neue Allelkombinationen durch! homologe Rekombination zwischen Chromosomen! Geschlechtschromosomen! p! pseudoautosomale Region! X-chromosomale Vererbung! q! Duchenne's Muscular Distrophy! Atrophie der Muskeln! X! Y! Lebenserwartung: 20 Jahre!

100 Geschlechtsbestimmung! Mensch! XX! XY! homogametisch! heterogametisch! heteromorphe Chromosomen! Geschlechtsbestimmung! Drosophila! X:A = 1! X:A = 0,5! Ameisen! 2n! 1n!

101 XX! XY! XXY! X0! Drosophila! Mensch! X-Chromosomen Inaktivierung! Barr Körperchen! Zum Ausgleich der Genexpression: ein X-Chromsom inaktiviert!! Früh in der Entwicklung wird zufallsbedingt das maternale! oder das paternale X inaktiviert!

102 X-Chromosomen Inaktivierung! X-Chromosomen! Formale Genetik: Mendel

103 Verwendung reiner Linien:! Linien, die homozygot für das! betrachtete Merkmal sind! Quantitative Behandlung der Daten: Statistik! Fellfarbe von Mäusen! Mehrere Gene bestimmen die Fellfarbe!! Die wichtigsten sind:!! A: Agouti! B: Brown! C: Albino! D: Dilute! A: agouti! a: non-agouti (schwarz)! Diese Gene bestimmen Synthese (B, C) und Verteilung des! Pigments (A, D)!

104 Fellfarbe von Mäusen! A: Agouti! a: non-agouti! A: agouti! a: non-agouti (schwarz)! Fellfarbe von Mäusen! C: Wildtyp (Agouti)! c: Albino!

105 Allele! C! c! alternative Formen eines Gens!! gleiche Position (Genort) homologer Chromosomen!! -> alternative Ausprägungen eines Merkmals!!! Homozygotie! Eine Linie ist homozygot für ein Genpaar:! zwei identische Allele an einem Genort! CC oder cc! Heterozygotie! Eine Linie ist heterozygot für ein Genpaar:! zwei unterschiedliche Allele an einem Genort! Cc!

106 Dominantes Allel! Ein dominantes Allel bestimmt allein die Ausprägung des Phenotyps!! bestimmt Phenotyp im homo- und heterozygoten Zustand! Y dominant über y -> identischer Phenotyp von YY und Yy! Rezessives Allel! Rezessives Allel exprimiert Phenotyp nur im! homozygoten Zustand! CC! Cc! cc! CC x cc ->! Genotyp! Cc! Phenotyp! agouti! CC! cc!

107 1. Mendelsches Gesetz! Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines! allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten.! Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele! CC! cc! Gameten:! C! C! c! c!

108 CC! X! cc! P! C! c! Cc! F1! F1:! Cc! 1. Mendelsches Gesetz! Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines! allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten.! Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele! Uniformitätsregel! Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der! F1 Generation alle gleich!

109 Cc! X! Cc! F1! C! c! C! c! F2! Cc! X! Cc! F1! C! c! C! c! CC! Cc! Cc! cc! F2! F2! :!

110 Cc! X! Cc! F1! C! c! C! c! CC! Cc! Cc! cc! F2! F2! :! Cc! X! Cc! F1! C! c! C! c! CC! Cc! Cc! cc! F2! F2! 3:1! :!

111 X! F1! Cc! Cc! C! c! C! CC! Cc! F2! c! Cc! cc! F2! :! 6022! 2001! 75%! 25%! 1. Mendelsches Gesetz! Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines! allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten.! Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele! Uniformitätsregel! Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der! F1 Generation alle gleich! Spaltungsregel! Bei der Kreuzung von Individuen der F1-Generation spalten! sich die Merkmale in definierten Zahlenverhältnissen auf!

112 Genotyp!Phenotyp! YY! Yy! yy! F1! yy! 1:2:1! 3:1! X! P! C R C R! C W C W! F1! C R C W! intermediärer Phenotyp! unvollständige Dominanz!

113 X! C R C W! C R C W! C R! C W! C R C R! Intermediärer Erbgang! C R! C W! C R C W! C R C W! C W C W! F1! F2! 1:2:1! F2! 1! 2! 1! 1. Mendelsches Gesetz! Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines! allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten.! Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele! Uniformitätsregel! Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der! F1 Generation alle gleich! Spaltungsregel! Bei der Kreuzung von Individuen der F1-Generation spalten! sich die Merkmale in definierten Zahlenverhältnissen auf! Aufspaltung der Merkmale in der F2! dominant-rezessiver Erbgang: 3 : 1 (dominantes : rezessives Merkmal)! intermediärer Erbgang: 1: 2 : 1!

114 Rückkreuzung! X! R! cc! F1! F1! 1:1! :! Rückkreuzung! Cc! X! R! cc! c! c! C! c! Cc! cc! Cc! cc! F1! F1! 1:1! :!

115 Rückkreuzung! CC! X! R! cc! c! c! C! C! Cc! Cc! Cc! Cc! F1! F1! Reziprozität! Ausprägung des Merkmals ist unabhängig davon ob! der männliche oder der weibliche Elternteil ein bestimmtes Allel! vererbt.! P! CC! X! cc! cc! X! CC! F1! Cc! cc!

116 2. Mendelsche Gesetz! Verschiedene Allelpaare segregieren bei der Gametenbildung! unabhängig voneinander und können neu kombiniert werden! Beispiel! Brown (B) AA BB! aa bb! AA;BB agouti! aa;bb black! AAbb cinnamon! aa;bb brown!

117 X! P! AA;BB! aa;bb! a;b! a;b! A;B! A;B! Aa;Bb! Aa;Bb! F1! Aa;Bb!Aa;Bb! F1! F1! Aa;Bb! X! Aa;Bb! Gameten:! A;B! A;b! a;b! a;b!

118 A;B! A;b! a;b! a;b! A;B! A;b! a;b! F2! a;b! A;B! A;b! a;b! a;b! A;B! A;b! a;b! AA;BB!AA;Bb! Aa;BB! Aa;Bb! AA;bB! AA;bb! Aa;bB! Aa;bb! aa;bb! aa;bb! aa;bb! aa;bb! F2! a;b! aa;bb! aa;bb! aa;bb! aa;bb! 9! 3! 3! 1!

119 2. Mendelsche Gesetz! Verschiedene Allelpaare segregieren bei der Gametenbildung! unabhängig voneinander und können neu kombiniert werden! Das 2. Mendelsche Gesetz trifft nur für Gene zu,! die nicht gekoppelt sind,! also z.b. auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind!! Carl Correns! Hugo De Vries! Erich von! Tschermak-Seysenegg! Zur Geschichte der Genetik: Thomas Hunt Morgan! Drosophila melanogaster! Geschlechtsgebundene Vererbung!

120 I! Hämophilie A in europäischen Königshäusern! Ausgangspunkt : Königin Victoria! I.1: Victoria! II.3: Alice von Hessen! II.9: Leopold von Albany! 1! 2! weiblich! männlich! II! 1! 3! 4! 9! III! 1! 2! 3! Geschlechtschromosomen! X-chromosomale Vererbung! Hämophilie A: Faktor VIII Defizienz! X! Y! hemizygot: Gen nur in einer Kopie pro diploiden Genom vorhanden!

121 Mutation = Veränderung der Sequenz eines Gens oder eines Chromosoms im Vergleich zum Wildtyp!!! Wildtyp = Genotyp oder Phenotyp, der in der Natur oder in einem Standard-Stamm im Labor zu finden ist.! Polymorphismus = verschiedene Varianten eines Gens! oder Merkmals in einer Population!! Polymorphismus: A, B, C! C! A! B! Mutation: 1 Organismus!

122 SNP ("snip")! Single Nucleotide Polymorphism! AAGCCTA! AAGCTTA! DNA Sequenzvariation! im Mittel alle bp (humanes Genom)! Mutation! 1) Genom-Mutation: Veränderung des Genoms, z.b.! Änderung der Zahl der Chromosomen!! Beispiel: Trisomie 21 (Down's Syndrome)!

123 Mutation! 1) Genom-Mutation: Veränderung des Genoms, z.b.! Änderung der Zahl der Chromosomen! 2) Chromosomen-Mutation: Veränderung der! Form und Strukur von Chromosomen! 3) Gen-Mutation: Veränderung in der! Sequenz eines Gens oder seiner! Kontrollsignale! Genetische Analyse! Mutagenese! (Strahlung,! Chemisch,! Transposon)! F0! Mutanten! Gen!

124 F0! Nachkommen! Mutante mit Entwicklungsdefekt! Klonierung des Gens! X! A!

125 b + b vg + vg!grau!!schwarz! b + vg + ; b + vg + x b vg; b vg!!normal!!stummelflügel (vestigial)! P! b + vg + ; b vg! x b vg; b vg! F1! b + b vg + vg!grau!!schwarz! b + vg + ; b + vg + x b vg; b vg!!normal!!stummelflügel (vestigial)! b +! vg +! b! vg! b + vg + ; b vg x b vg; b vg! P! F1! b + vg +! wt! b vg! schwarz! vestigial! b + vg! b vg +! wt! vestigial! schwarz! wt! 965! 944! 206! 185! b vg! F2! 17% Rekombination! (391 von 2300)!

126 b + b vg + vg!grau!!schwarz! Kreuzung zur Genkartierung!!normal! (linkage map)!!stummelflügel! b +! vg +! b! vg! b + vg +! b vg! 17 cm! b + vg! b vg +! 1 cm (centimorgan)! =! 1% Rekombinationshäufigkeit! wt! schwarz! vestigial! wt! vestigial! schwarz! wt! b vg! 965! 944! 206! 185! 17% Rekombination! A! B! C! a! b! c! A! a! B! b! C! c! Gameten! Rekombination! AB! 50 %! AB! AB! ab! 48,5 %! 48,5 %! 97%! AB! ab! ab! 50 %! ab! Ab! ab! 1,5 %! 1,5 %! 3%! Ab! ab! 100 %!

127 A! B! C! a! b! c! Rekombination! AB! ab! 48,5 %! 48,5 %! 97%! AC! ac! 46 %! 46 %! 92%! Ab! ab! 1,5 %! 1,5 %! 3%! Ac! ac! 4 %! 4 %! 8%! 100 %! 100 %! A! B! C! a! b! c! 3 cm! 8 cm! AB! ab! Ab! ab! 48,5 %! 48,5 %! 1,5 %! 1,5 %! AC! ac! Ac! ac! 46 %! 46 %! 4 %! 4 %! 1 cm (centimorgan)! =! 1% Rekombinationshäufigkeit!

128 A! B! C! a! b! c! 3 cm! 5 cm! Genkarte! 8 cm! AB! 48,5 %! AC! 46 %! BC! 47,5 %! ab! 48,5 %! ac! 46 %! bc! 47,5 %! Ab! ab! 1,5 %! 1,5 %! Ac! ac! 4 %! 4 %! Bc! bc! 2,5 %! 2,5 %! Genkarte! Additivität der Rekombinationsfrequenzen nur bei geringen Abständen!! Grund: Doppel Cross-over! A! a! B! b! C! c! A! a! b! B! C! c! 3 cm! 5 cm! 7 cm!

129 Identifikation des mutierten Gens! Ko-Segregation der Mutation mit einer bekannten DNA-Sequenz! nach einer Test-Kreuzung! X! A! B! C! unbekanntes Gen! genetische Karte! physikalische Karte! Autosomal dominanter Erbgang! weiblich! männlich!

130 Autosomal dominanter Erbgang! weiblich! männlich! x,d,f! f! x,d,f! f! x,d! f! x,d! x! d! x,d! f! f! x,d! x,d! Mutante! Wild typ! x!mutation! d, f!marker! 10% der Population! Multiple Allele: Agouti! Phenotyp! Gensymbol! Genotyp! Yellow! A Y! A Y A! Agouti! A! AA! non-agouti! a! aa! black-and-tan! a t! a t a t!

131 Multiple Allele: Agouti! AA x aa ->! AA x a t a t ->! Genotyp! Aa! Aa t! Phenotyp! agouti! agouti! a t a t x aa ->! a t a! black-and-tan! A > a t > a! Multiple Allele! Allelische Serie! A Y > A > a t > a! Satz von Allelen! Dominanz und Rezessivität definiert sich im Kontext eines Paares! von Allelen! a t ist dominant über a aber rezessiv gegenüber A!

132 Yellow x Agouti! Yellow : Agouti = 1 : 1! Schlussfolgerung: heterozygot! Yellow dominant über Agouti! Yellow x Yellow! Yellow : Agouti = 2 : 1!

133 Yellow x Yellow! A Y A! A Y A! Embryo:! A Y A Y : A Y A : AA = 1 : 2 : 1! Neugeborene:! A Y A : AA = 2 : 1! Yellow : Agouti = 2 : 1! 1. Schlussfolgerung: der Genotyp A Y A Y ist embryonal letal!! 2. Schlussfolgerung: der Genotyp A Y A Y ist rezessiv letal!! Pleiotropie: Mutation hat Auswirkungen auf mehrere,! scheinbar unzusammenhängende Merkmale! Das mutierte Gen codiert für ein Protein,! das an mehreren Prozessen beteiligt ist! A Y : 1) Fellfarbe! 2) Embryonale Letalität!