Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Allgemeine Zoologie und Genetik

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1 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Institut für Allgemeine Zoologie und Genetik Vorlesung "Grundlagen der Biologie I" WS 2009/10 Molekulargenetik Püschel 2009

2 Vorlesung Grundlagen der Biologie I Molekulargenetik Teil 2 Teil 2 Molekulargenetik der Eukaryonten 8 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen I 9 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen II 10 Zellzyklus, Mitose, Meiose 11 Meiose und sexuelle Fortpflanzung 12 Formale Genetik: Mendel I 13 Formale Genetik: Mendel II 14 Transkription II: Eukaryoten 15 Genregulation II: Transkriptionsfaktoren 16 Genregulation III: Spleissen 17 Genregulation IV: Translation in Eukaryoten 18 Rekombinante DNA II 1

3 Literatur zur Vorlesung Vorlesung Purves Kapitel , , 10, , 16, 17 Empfehlung Biologie. Markl, Jürgen (Hrsg.); Purves, William K.; Sadava, David; Orians, Gordon H.; Heller, H. Craig. Spektrum Verlag, ISBN: Der Stoff der Vorlesung deckt sich weitgehend mit dem Lehrbuch Biologie ("Purves"). Die Kapitel 9 bis 17 beihalten den Stoff der Teils Molekulargenetik. Der Inhalt diser Kapitel ist Prüfungsstoff, unabhängig davon ob er in der Vorlesung explizit diskutiert wurde. 2

4 Organisation des Genoms und Struktur der Chromosomen Der Zellkern Heterochromatin: inaktives Chromatin Euchromatin: aktives Chromatin Kernmembran Chromatin Heterochromatin Euchromatin Nucleolus: Ribosomen Kernporenkomplex

5 Eukaryotische DNA ist in Chromosomen verpackt 1) Genom in Chromosomen unterteilt 2) Zellteilung: DNA wird kondensiert Das Genom der Eukaryoten ist linear 1 Chromosom: eine DNA-Doppelhelix Telomer Centromer Telomer

6 Mitose Tochterzellen Interphase Zellzyklus DNA-Synthese Replikation 1 Chromosom Mitose 2 Chromatide

7 Metaphasen Chromosom Centromer DNA-Sequenz, bindet Kinetochor dadurch Verknüpfung mit Spindelapparat Kinetochor Spezialisierter Proteinkomplex Spindelapparat Mikrotubuli, mit Kinetochor verknüpft Chromatid Cohesin Verbindung der Schwesterchromatiden Chromosomensatz: 2n (diploide Zelle) Jedes autosomale Gen kommt in 2 Kopien vor Mensch: 23 Chromosomenpaare, 2n = 46 Chromosomen 1-22: Autosomen, X, Y: Geschlechtschromosomen

8 Für die stabile Vererbung von Chromosomen sind 3 Elemente notwendig: - "Origins of Replication" Initiation der Replikation - Centromer: Verteilung bei der Zellteilung - Telomere: Schutz der Enden Chromatin Nucleosom: DNA + Histon-Oktamer

9 Histon-Oktamer: je zwei Kopien von Histon H2A Histon H2B Histon H3 Histon H4 zusammen mit 146 bp DNA R K RK K RK KK K KR R H3 Acetylierung Phosphorylierung Methylierung Lysin - (CH2) 4 -NH (CH2) 4 -NH-COCH 3 flexibler N-Terminus Globuläre Domäne R: Arginin K: Lysin S: Serin

10 R K RK K RK KK K KR R H3 Acetylierung Phosphorylierung Methylierung Lysin - (CH2) 4 -NH (CH2) 4 -NH-CH 3 flexibler N-Terminus Globuläre Domäne R: Arginin K: Lysin S. Serin Organisation des Chromatins Interphase Verpackung in Nucleosomen ("Beads on a string") Mitose Verpackung in Nucleosomen ("Beads on a string") 30 nm Faser 30 nm Faser Chromatin-Schleifen Chromatin-Schleifen Euchromatin Heterochromatin (Centromere, Telomere) Chromosomen

11 DNA Replikation in Eukaryoten erfolgt in Abschnitten: Replikons Replikation in Eukaryoten: Chromatin Organisation der DNA zu Chromosomen Eukaryotische Genome: in mehrere Chromosomen unterteilt Chromosom: eine lineare DNA mit mehreren Origins of replication (Replikons) Chromosomen: DNA durch Histone und andere Proteine zum Chromatin verpackt Centromere und Telomere: Stabilität und Vererbung von Chromosomen

12 Telomere schützen die Chromosomen vor: Rekombination Fusion mit anderen Chromosomen Erkennung als beschädigte DNA Telomere enden mit einer t-loop Struktur 5' 3' 3' 5' D-Loop 5' t-loop D: displacement t: telomere

13 5' 3' 3' 5' Tetrahymena: nt ----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG (TTGGGG)n Telomerase Polymerase mit zwei Untereinheiten: Protein (TERT: Telomerase Reverse Transkriptase) RNA (TER: Telomerase RNA)

14 5' 3' 3' 5' 3' 5' RNA AACCCCAAC ----TTGGGGTTGGGGTTG Tetrahymena 5' 3' 3' 5' 3' 5' AACCCCAAC GGTTGGGGTTGGGGTTG Tetrahymena

15 Telomerase RNA: Template zur Synthese des 3'-Überhangs der Telomere AACCCCAAC GGTTGGGGTTG AACCCCAAC GGTTGGGGTTGGGGTTG TERT: RNA-abhängige DNA-Polmerase Die Grösse der Genome verschiedener Organismen E. coli 4,5 Mb (4,5 x 10 6 ) S. cerevisiae 12,1 Mb D. melanogaster 165 Mb C. elegans 97 Mb Amphibien Mb H. sapiens 3300 Mb Pflanzen Mb

16 Organisation des Genoms Sequenzklassen im Genom der Eukaryoten - "single copy" Sequenzen - repetitive Sequenzen Single copy Sequenzen 1) Protein-kodierende Gene 2) Gene für rrna, trna, andere "kleine" RNAs 3) nicht-kodierende RNAs (ncrnas) 4) nicht transkribierte Sequenzen

17 Genstruktur: Eukaryonten Exon Intron Exon Transkription AUG STOP Primärtranskript: pre-mrna Spleissen mrna Genstruktur: Eukaryonten Exon Intron Exon Intron = Abschnitt des Primärtranskriptes, das durch Spleissen entfernt wird und nicht Bestandteil der reifen mrna ist Exon = Abschnitt des Primärtranskriptes, das Bestandteil der reifen mrna ist

18 Repetitive Sequenzen - wiederholte Sequenzelemente: ähnlich aber nicht identisch - hochrepetitive Sequenzen (auch Satelliten-DNA genannt) Hunderte von Repeats an einigen Stellen des Genom konzentriert wie Centromere (GAAAAA AG TC T) Repetitive Sequenzen - mittelrepetitive Sequenzen z.b. Telomere z.b. Gene für trna z.b. Transposons Transposon: mobiles genetisches Element Insertion an beliebigen Stellen des Genoms

19 Transposon: mobiles genetisches Element Insertion an beliebigen Stellen des Genoms Chr 1 Transposon Chr 5 Chr 1 Chr 5 Transposon: mobiles genetisches Element Insertion an beliebigen Stellen des Genoms nicht-replikative Transposition Transposon als Einheit bewegt, Zahl Transposons konstant

20 Transposon: Beispiel: P-Element, Drosphila Transpoase: Rekombinase, vermittelt Transposition Beispiel: Sleeping Beauty, künstliches Transposon Transposon: mobiles genetisches Element Insertion an beliebigen Stellen des Genoms Chr 1 Chr 5 replikative Transposition Transposon kopiert, Zahl Transposons steigt

21 Retrotransposon Transposons, die sich durch Reverse Trankription verbreiten Chr 1 Transkript DNA Chr 5 Integration in Genom Aufbau eines Retrovirus Glykoproteine RNA-Genom Lipidhülle Virus-Kern LTR gag pol env LTR

22 Aufbau eines Retrovirus gag (gruppenspezifisches Antigen): Bestandteile des Viruskerns pol (polymerase): Reverse Transkriptase, Integrase env (envelope): Glykoproteine der Membranhülle Retroviren: RNA-Viren RNA Genom in DNA umgeschrieben RNA Genom Reverse Transkription Integration integrierter Pro-Virus Transkription durch RNA-Polymerase der Zelle neue virale Genome mrna zur Produktion viraler Proteine

23 Retroviren: RNA-Viren in doppelsträngige DNA umgeschrieben (Reverse Transkriptase) integrieren in das Wirtsgenom Einige repetitive Sequenzen entstehen durch reverse Transkription Das Dogma der Molekularbiologie DNA RNA Protein

24 Das Genom enthält nicht nur kodierende Sequenzen Nur 5-10% des Genoms der Eukaryoten sind kodierende Sequenzen!! Rest: Single Copy Sequenzen (z.b. Introns, Kontrollelemente) Repetitive Sequenzen Wieviel Gene gibt es? Organismus H. pylori E. coli S. cerevisiae C. elegans D. melanogaster H. sapiens Reis Vorhergesagt Zahl der proteinkodierenden Gene ca ca

25 Immunoglobuline: V-D-J Rekombination V (ca. 100) D (ca. 30) J (6) C variable Region konstante Region Antigen schwere Kette leichte Kette Immunoglobulin: 2x schwere Kette + 2x leichte Kette Purves: Kap. 18 (S. 456) Campbell: Kap. 43 Immunoglobuline: V-D-J Rekombination vor V-D-J Rekombination V (ca. 100) D (ca. 30) J (6) C nach V-D-J Rekombination VDJ Purves: Kap. 18 (S. 456) Campbell: Kap. 43

26 V (ca. 100) D (ca. 30) J (6) C vor V-D-J Rekombination nach V-D-J Rekombination Hypermutation Transkript Protein Purves: Kap. 18 (S. 456) Campbell: Kap. 43 Extrachromosomale Gene mtdna ctdna

27 Mitochondrien und Chloroplasten: mehrere Kopien ihres Genoms Mitochondrien: 2-10 Kopien (10 kb - 2 Mb) Chloroplasten: Kopien ( kb) darunter Gene für: trnas, rrna, Proteine -> eigene Translation Das Genom kodiert nur für kleinen Teil der Proteine der Organellen Zellzyklus, Mitose, Meiose

28 M Mitose G 2 Tochterzellen Interphase Zellzyklus G 1 S DNA-Synthese Prophase Chromatin kondensiert zu Chromosomen Bildung Mitosespindel Prometaphase Kernhülle zerfällt Spindelfasern binden Kinetochor Metaphase Chromosomen in Metaphasenplatte Anaphase Trennenung der Schwesterchromatiden -> entgegengesetzte Pole Telophase Neubildung des Zellkerns Dekondensierung der Chromatiden

29 Cohesin Komplex Interphase Prophase Metaphase Cohesin Komplex Separase Metaphase Anaphase

30 Mitose Prophase Prometaphase Metaphase Anaphase Telophase Cytokinese Chromatin kondensiert zu Chromosomen Bildung Mitosespindel Kernhülle zerfällt Spindelfasern binden Kinetochor Chromosomen in Metaphasenplatte Trennenung der Schwesterchromatiden -> entgegengesetzte Pole Neubildung des Zellkerns Dekondensierung der Chromatiden Zellteilung Kontraktiler Ring (aus Aktin und Myosin) trennt die Zellen Synthese der neuen Zellwand (durch Phragmoplast) trennt die Zellen

31 Interphase G1 S G2 M G1 DNA-Gehalt pro Zelle 4x 2x n=2 x = 2 n=2 x = 4 n=2 n=2 n=2 x = 2 1x x = DNA-Gehalt n = Chromosomensatz (diploid, n=2) Zeit Kontrolle des Zellzyklus Zellteilung nicht vor Verdopplung der Zellmasse nicht vor Ende der Replikation (Replikation einmal und nur einmal )

32 zentraler Regulator koordiniert alle Prozesse des Zellzyklus: 1. Cyclin-abhängige Proteinkinasen (Cdk) Cdk Kontrolle des Zellzyklus 2. Cycline Cyclin Kontrolle des Zellzyklus zentraler Regulator koordiniert alle Prozesse des Zellzyklus: Cyclin Cdk Cdk Cyclin Cdk inaktiv Cdk/Cyclin Komplex aktiv

33 Kontrolle des Zellzyklus Synthese von neuem Cyclin Interphase Cyclin Abbau von Cyclinen Cdk Cdk Cdk Cyclin Cyclin Mitose Konzentration M G 1 S G 2 M G 1 S G 2 M Zeit Menge Cyclin Cyclin Aktivität Cdk/Cyclin Cdk Cyclin

34 Kontrollpunkt für DNA-Integrität M Mitose Interphase G 2 Kontrollpunkt für nicht-replizierte DNA S Zellzyklus DNA-Synthese Tochterzellen G 1 G 0 Wachstumsfaktoren (Mitogene) Kontrollpunkt für DNA-Integrität Kontrolle des Zellzyklus Kontrolle an spezifischen Punkten des Zellzyklus G1: Restriktionspunkt Entscheidung zur Replikation entscheidender Kontrollpunkt in tierischen Zellen G2: Entscheidung zur Zellteilung

35 Meiose und sexuelle Fortpflanzung haploide Zellen n = 23 Gameten Meiosis Keimbahn Befruchtung Ovar n = 46 Testis diploide Zellen Mitose Zygote

36 Interphase Meiose 1 Meiose 2 G1 S G2 DNA-Gehalt pro Zelle 4x 2x n = 2 n = 2 n = 1 n=2 n=1 1x n = 1 x = DNA-Gehalt n = Chromosomensatz (diploid, n=2) Zufällige Segregation homologer Chromosomen Gameten Kombinationen

37 Zufällige Segregation homologer Chromosomen n mögliche Chromosomenkombinationen n = haploide Chromosomenzahl Mensch: 2 23 = > 8,4 x 10 6 mögliche Kombinationen Interphase Prophase I

38 Metaphase I Anaphase I

39 Anaphase II Rekombination in der Meiose

40 Rekombination 1) homologe Rekombination: Austausch von DNA-Abschnitten zwischen gleichen oder ähnlichen Sequenzen 2) nicht-homologe = integrative Rekombination: Einbau eines DNA-Abschnitts in ein anderes DNA-Molekül unhabhängig von Sequenzhomologien (Beispiel: Transposon) Homologe Rekombination Voraussetzung Strangbrüche Einzelstrang-DNA Bereiche Cross-over "Branch migration"

41 Cross-overs führen zu neuen Allelkombinationen A a B b A a B b A a b B Chiasma Meiose I (Reduktionsteilung) Prophase I: wesentlich länger als bei der Mitose Synapsis: paarweise Anordnung homologer Chromosomen Chiasmata als Folge von homologer Rekombination Metaphase I: Metaphasenplatte: Tetrade homologer Chromosomen voneinander unabhängige Anordnung der Chromosomen Anaphase I: Wanderung homologer Chromosomen Schwesterchromatiden bleiben an Centromeren verbunden Telophase I und Cytokinese

42 Prophase II Metaphase II Anaphase II Telophase II analog zur Mitose aber: haploider Chromosomensatz Cytokinese Mitose: es entstehen 2 Tochterzellen, die genetisch identisch zueinander und zur Elternzelle sind Meiose: es entstehen 4 Tochterzellen, die sich genetisch voneinander und von der Elternzelle unterscheiden Meiose I: homologe Chromosomen werden getrennt Mitose: Schwesterchromatiden werden getrennt

43 Cohesin Komplex Interphase Prophase I Cohesin Komplex Prophase I Metaphase I

44 Cohesin Komplex Metaphase I Anaphase I Cohesin Komplex Separase Metaphase II Anaphase II

45 Cross-over während Prophase I synaptonemaler Komplex hält homologe Chromosomen zusammen Synapsis paarweise Anordnung homologer Chromosomen Chiasma Struktur in Meiose zeigt Cross-over an Homologe Rekombination in der Meiose Homologe Rekombination -> neue Allelkombinationen Cross-over -> Austausch von Blöcke zwischen homologen Chromosomen Ergebnis: Erhöhung der genetischen Diversität

46 Mitose ist eine konservativer Prozess der den Status Quo aufrechterhält Meiose erzeugt dagegen Variation 1) Zufällige Verteilung mütterlicher und väterlicher Chromosomen 2) Neue Allelkombinationen durch homologe Rekombination zwischen Chromosomen Geschlechtschromosomen p pseudoautosomale Region X-chromosomale Vererbung q Duchenne's Muscular Distrophy Atrophie der Muskeln X Y Lebenserwartung: 20 Jahre

47 Geschlechtsbestimmung Mensch XX XY homogametisch heterogametisch heteromorphe Chromosomen Geschlechtsbestimmung Drosophila X:A = 1 X:A = 0,5 2n Ameisen 1n

48 XX XY XXY X0 Drosophila Mensch X-Chromosomen Inaktivierung Barr Körperchen Zum Ausgleich der Genexpression: ein X-Chromsom inaktiviert Früh in der Entwicklung wird zufallsbedingt das maternale oder das paternale X inaktiviert

49 X-Chromosomen Inaktivierung X-Chromosomen Formale Genetik: Mendel

50 Verwendung reiner Linien: Linien, die homozygot für das betrachtete Merkmal sind Quantitative Behandlung der Daten: Statistik Fellfarbe von Mäusen Mehrere Gene bestimmen die Fellfarbe Die wichtigsten sind: A: Agouti B: Brown C: Albino D: Dilute A: agouti a: non-agouti (schwarz) Diese Gene bestimmen Synthese (B, C) und Verteilung des Pigments (A, D)

51 Fellfarbe von Mäusen A: Agouti a: non-agouti A: agouti a: non-agouti (schwarz) Fellfarbe von Mäusen C: Wildtyp (Agouti) c: Albino

52 Allele C c alternative Formen eines Gens gleiche Position (Genort) homologer Chromosomen -> alternative Ausprägungen eines Merkmals Homozygotie Eine Linie ist homozygot für ein Genpaar: zwei identische Allele an einem Genort CC oder cc Heterozygotie Eine Linie ist heterozygot für ein Genpaar: zwei unterschiedliche Allele an einem Genort Cc

53 Dominantes Allel Ein dominantes Allel bestimmt allein die Ausprägung des Phenotyps bestimmt Phenotyp im homo- und heterozygoten Zustand Y dominant über y -> identischer Phenotyp von YY und Yy Rezessives Allel Rezessives Allel exprimiert Phenotyp nur im homozygoten Zustand CC Cc cc CC x cc -> Genotyp Cc Phenotyp agouti CC cc

54 1. Mendelsches Gesetz Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten. Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele CC cc Gameten: C C c c

55 CC X cc P C c Cc F1 F1: Cc 1. Mendelsches Gesetz Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten. Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele Uniformitätsregel Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der F1 Generation alle gleich

56 Cc X Cc F1 C c C c F2 Cc X Cc F1 C c C c CC Cc Cc cc F2 F2 :

57 Cc X Cc F1 C c C c CC Cc Cc cc F2 F2 : Cc X Cc F1 C c C c CC Cc Cc cc F2 F2 3:1 :

58 X F1 Cc Cc C c C CC Cc F2 c Cc cc F2 : % 25% 1. Mendelsches Gesetz Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten. Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele Uniformitätsregel Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der F1 Generation alle gleich Spaltungsregel Bei der Kreuzung von Individuen der F1-Generation spalten sich die Merkmale in definierten Zahlenverhältnissen auf

59 Genotyp Phenotyp YY Yy yy F1 yy 1:2:1 3:1 X P C R C R C W C W F1 C R C W intermediärer Phenotyp unvollständige Dominanz

60 Intermediärer Erbgang X C R C W C R C W C R C W C R C R C R C W F1 F2 1:2: C R C W C R C W C W C W F2 1. Mendelsches Gesetz Bei der Gametenbildung trennen sich die beiden Mitgleider eines allelischen Paares und werden Bestandteil getrennter Gameten. Die Gameten enthalten damit nur je eines der Allele Uniformitätsregel Bei der Kreuzung reiner Linien sind die Nachkommen in der F1 Generation alle gleich Spaltungsregel Bei der Kreuzung von Individuen der F1-Generation spalten sich die Merkmale in definierten Zahlenverhältnissen auf Aufspaltung der Merkmale in der F2 dominant-rezessiver Erbgang: 3 : 1 (dominantes : rezessives Merkmal) intermediärer Erbgang: 1: 2 : 1

61 Rückkreuzung X cc R F1 F1 1:1 : Rückkreuzung Cc X cc R c c C c Cc cc Cc cc F1 F1 1:1 :

62 X R Rückkreuzung CC cc c c C Cc Cc F1 C Cc Cc F1 Reziprozität Ausprägung des Merkmals ist unabhängig davon ob der männliche oder der weibliche Elternteil ein bestimmtes Allel vererbt. P X X CC cc cc CC F1 Cc cc

63 2. Mendelsche Gesetz Verschiedene Allelpaare segregieren bei der Gametenbildung unabhängig voneinander und können neu kombiniert werden Beispiel Brown (B) AA BB aa bb AA;BB agouti aa;bb black AAbb cinnamon aa;bb brown

64 AA;BB X aa;bb P a;b a;b A;B A;B Aa;Bb Aa;Bb Aa;Bb Aa;Bb F1 F1 F1 Aa;Bb X Aa;Bb Gameten: A;B A;b a;b a;b

65 A;B A;b a;b a;b A;B A;b a;b F2 a;b A;B A;b a;b a;b A;B A;b a;b AA;BB AA;Bb Aa;BB Aa;Bb AA;bB AA;bb Aa;bB Aa;bb aa;bb aa;bb aa;bb aa;bb F2 a;b aa;bb aa;bb aa;bb aa;bb

66 2. Mendelsche Gesetz Verschiedene Allelpaare segregieren bei der Gametenbildung unabhängig voneinander und können neu kombiniert werden Das 2. Mendelsche Gesetz trifft nur für Gene zu, die nicht gekoppelt sind, also z.b. auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind! Carl Correns Hugo De Vries Erich von Tschermak-Seysenegg Zur Geschichte der Genetik: Thomas Hunt Morgan Drosophila melanogaster Geschlechtsgebundene Vererbung

67 I Hämophilie A in europäischen Königshäusern Ausgangspunkt : Königin Victoria I.1: Victoria II.3: Alice von Hessen II.9: Leopold von Albany 1 2 weiblich männlich II III Geschlechtschromosomen X-chromosomale Vererbung Hämophilie A: Faktor VIII Defizienz X Y hemizygot: Gen nur in einer Kopie pro diploiden Genom vorhanden

68 Mutation = Veränderung der Sequenz eines Gens oder eines Chromosoms im Vergleich zum Wildtyp Wildtyp = Genotyp oder Phenotyp, der in der Natur oder in einem Standard-Stamm im Labor zu finden ist. Polymorphismus = verschiedene Varianten eines Gens oder Merkmals in einer Population Polymorphismus: A, B, C C A B Mutation: 1 Organismus

69 SNP ("snip") Single Nucleotide Polymorphism AAGCCTA AAGCTTA DNA Sequenzvariation im Mittel alle bp (humanes Genom) Mutation 1) Genom-Mutation: Veränderung des Genoms, z.b. Änderung der Zahl der Chromosomen Beispiel: Trisomie 21 (Down's Syndrome)

70 Mutation 1) Genom-Mutation: Veränderung des Genoms, z.b. Änderung der Zahl der Chromosomen 2) Chromosomen-Mutation: Veränderung der Form und Strukur von Chromosomen 3) Gen-Mutation: Veränderung in der Sequenz eines Gens oder seiner Kontrollsignale Genetische Analyse Mutagenese (Strahlung, Chemisch, Transposon) F0 Mutanten Gen

71 F0 Nachkommen Mutante mit Entwicklungsdefekt Klonierung des Gens X A

72 b + b vg + vg grau schwarz b + vg + ; b + vg + x b vg; b vg normal Stummelflügel (vestigial) P b + vg + ; b vg x b vg; b vg F1 b + b vg + vg grau schwarz b + vg + ; b + vg + x b vg; b vg normal Stummelflügel (vestigial) b + vg + b vg b + vg + ; b vg x b vg; b vg P F1 b + vg + wt b vg schwarz vestigial b + vg b vg + wt vestigial schwarz wt b vg F2 17% Rekombination (391 von 2300)

73 b + b vg + vg grau schwarz Kreuzung zur Genkartierung normal (linkage map) Stummelflügel b + vg + b vg b + vg + b vg 17 cm b + vg b vg + 1 cm (centimorgan) = 1% Rekombinationshäufigkeit wt schwarz vestigial wt vestigial schwarz wt b vg % Rekombination A a A a B b B b C c C c Gameten Rekombination AB 50 % AB AB ab 48,5 % 48,5 % 97% AB ab ab 50 % ab Ab ab 1,5 % 1,5 % 3% Ab ab 100 %

74 A a B b C c Rekombination AB ab 48,5 % 48,5 % 97% AC ac 46 % 46 % 92% Ab ab 1,5 % 1,5 % 3% Ac ac 4 % 4 % 8% 100 % 100 % A a B b C c 3 cm 8 cm AB ab Ab ab 48,5 % 48,5 % 1,5 % 1,5 % AC ac Ac ac 46 % 46 % 4 % 4 % 1 cm (centimorgan) = 1% Rekombinationshäufigkeit

75 A a B b C c 3 cm 5 cm Genkarte 8 cm AB 48,5 % AC 46 % BC 47,5 % ab 48,5 % ac 46 % bc 47,5 % Ab ab 1,5 % 1,5 % Ac ac 4 % 4 % Bc bc 2,5 % 2,5 % Genkarte Additivität der Rekombinationsfrequenzen nur bei geringen Abständen! Grund: Doppel Cross-over A a B b C c A a b B C c 3 cm 5 cm 7 cm

76 Identifikation des mutierten Gens Ko-Segregation der Mutation mit einer bekannten DNA-Sequenz nach einer Test-Kreuzung X A B C unbekanntes Gen genetische Karte physikalische Karte Autosomal dominanter Erbgang weiblich männlich

77 Autosomal dominanter Erbgang weiblich männlich x,d,f f x,d,f f x,d f x,d x d x,d f f x,d x,d Mutante Wild typ x Mutation d, f Marker 10% der Population Multiple Allele: Agouti Phenotyp Gensymbol Genotyp Yellow A Y A Y A Agouti A AA non-agouti a aa black-and-tan a t a t a t

78 Multiple Allele: Agouti AA x aa -> AA x a t a t -> Genotyp Aa Aa t Phenotyp agouti agouti a t a t x aa -> a t a black-and-tan A > a t > a Multiple Allele Allelische Serie Satz von Allelen A Y > A > a t > a Dominanz und Rezessivität definiert sich im Kontext eines Paares von Allelen a t ist dominant über a aber rezessiv gegenüber A

79 Yellow x Agouti Yellow : Agouti = 1 : 1 Schlussfolgerung: heterozygot Yellow dominant über Agouti Yellow x Yellow Yellow : Agouti = 2 : 1

80 Yellow x Yellow A Y A A Y A Embryo: A Y A Y : A Y A : AA = 1 : 2 : 1 Neugeborene: A Y A : AA = 2 : 1 Yellow : Agouti = 2 : 1 1. Schlussfolgerung: der Genotyp A Y A Y ist embryonal letal! 2. Schlussfolgerung: der Genotyp A Y A Y ist rezessiv letal! Pleiotropie: Mutation hat Auswirkungen auf mehrere, scheinbar unzusammenhängende Merkmale Das mutierte Gen codiert für ein Protein, das an mehreren Prozessen beteiligt ist A Y : 1) Fellfarbe 2) Embryonale Letalität

81 Agouti: sekretiertes Protein steuert Melanin-Synthese und Fettstoffwechsel A a Wildtyp Null-Mutante A Y Mutante in nicht-kodierender Region -> Expressionsmuster verändert Bb;Cc X Bb;Cc

82 B;C B;c b;c b;c B;C B;c b;c b;c BB;CC BB;Cc Ba;CC Bb;Cc BB;cC BB;cc Bb;cC Bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc bb;cc F2 schwarz : braun: albino = 9 : 3 : 4 Epistase agouti : non-agouti: albino = 9 : 3 : 4 Erwartung nach Mendel: 9 : 3 : 3 : 1

83 Epistase Epistase: Interaktion zwischen nicht-allelischen Genen, bei der ein Gen die phenotypische Ausprägung des anderen Gens verhindert. Die Wirkung eines Gens hängt also von der Aktivität eines anderen Gens ab. Der Genotyp cc ist epistatisch gegenüber BB Der Nachweis einer epistatischen Beziehung: genetische Hierarchie von Genen C B

84 Agouti C (Tyrosinase) Rezeptor B (Tyrp1) Melanocyt Abweichungen vom Mendelschen Erbgang bei monohybriden Erbgängen sind Anzeichen für: Letalität Abweichungen vom Mendelschen Erbgang bei dihybriden Erbgängen sind Anzeichen für: - Koppelung der Gene (die Gene liegen auf einem Chromosom) - Epistase

85 Imprinting (genomische Prägung) Ausprägung mütterlich und väterlich vererbter Allele unterscheidet sich, obwohl Sequenzen identisch sind Nachkommen igf2 igf2 Expression + - Angelmann und Prader-Willi Syndrom Chr. 15 Deletion! * *! Prader-Willi Syndrom Angelmann Syndrom

86 DNA Methylierung de novo Methylierung CG GC DNMT CH 3 CG GC CH 3 DNMT: DNA Methyltransferasen DNA Methylierung Erhaltungs Methylierung Replikation CH 3 CG GC CH 3 CH 3 CG GC CG GC CH3 DNMT: DNA Methyltransferasen

87 CH 3 CG GC CG GC CH 3 DNA Methylierung Erhaltungs Methylierung Replikation DNMT CH 3 CG GC CH 3 CH 3 CG GC CH 3 DNMT: DNA Methyltransferasen Transkription II: Eukaryoten

88 Eukaryoten haben drei RNA Polymerasen RNA Polymerase I RNA Polymerase II RNA Polymerase III 28S-, 18S- und 5,8S-rRNA proteinkodierende Gene regulatorische RNAs (mirna) Gene für: 5S-rRNA, trnas und andere "kleine" RNAs Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer // Proximale Promotor-Elemente Core Promotor Haushaltsgene regulierte Gene

89 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Initiator BRE um Position -35 TATA-Box um Position -25 BRE BRE: TFIIB recognition element Aber: nur ein kleiner Teil der Gene hat TATA-Box oft bei regulierten Genen Struktur von RNA Polymerase II Promotoren 1) variabler als bei Prokaryoten 2) Core Promotor: basale Transkription 3) Proximale Promotor-Elemente 4) Enhancer

90 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Promoter-Region: generelle Transkriptionsfaktoren (TFII) ermöglichen Initiation der Transkription durch RNA Polymerase II TFIID TATA-Box Initiation der Transkription durch Polymerase II Schrittweiser Aufbau des Initiatiationskomplex TFIID bindet an die TATA-Box TBP: TATA Bindeprotein Untereinheit von TFIID TFIID TATA-Box

91 TFIID + TFIIB: Plattform für Bindung weiterer TFIIs und RNA Polymerase II Schrittweiser Aufbau des Initiatiationskomplex TFIIB bindet an Promotor TFIIB TFIID TATA-Box TFIID + TFIIB: Plattform für Bindung weiterer TFIIs und RNA Polymerase II TFIID Pol II TATA-Box

92 TFIID + TFIIB: Plattform für Bindung weiterer TFIIs und RNA Polymerase II Zuletzt bindet TFIIH TFIIH TFIID Pol II TATA-Box TFII's und RNA-Polymerase II: geschlossener Initiationskomplex (Prä-Initiationskomplex) TFIIH TFIID Pol II TATA-Box

93 TFIIH: DNA-Helicase Aktivität, entwindet DNA des Promotors: offener Initiations-Komplex TFIIH TFIID Pol II TATA-Box TFIIH: Protein-Kinase Aktivität: Phosphorylierung des C-Terminus der RNA-Polymerase P P P P P P P C IIE TFIIH TFIID Pol II TATA-Box

94 Phosphorylierung des C-Terminus -> Dissoziation des Initiationskomplexes -> Elongation P P P P P P P C IIE TFIIH TFIID Pol II TATA-Box Elongation: TFIID bleibt an TATA-Box gebunden -> neue Initiation Elongationskomplex TFIIH P P P P P P P C Pol II TFIID TATA-Box

95 Initiation an Pol II Promotoren 1) TFIID erkennt die TATA-Box -> Plattform für Polymerase II 2) TFIIH phosphoryliert C-Terminus der Polymerase II 3) Phosphorylierung -> Polymerase II löst sich von TATA-Box -> Synthese der mrna Unterschiede zu Prokaryoten 1) RNA-Polymerase in Bakterien ausreichend für Initiation in Eukaryoten: allgemeine Transkriptionsfaktoren notwendig 2) Promotor in Eukaryoten nicht ausreichend für effiziente Initiation

96 Genregulation II: Transkriptionsfaktoren Struktur von RNA Polymerase II Promotoren TATA-Box Proximale Promotor-Elemente z.b. bei regulierten Genen

97 CRE: camp-responsive Element CRE ist ein Promoter-Element - > camp-induzierte Transkription CRE TATA-Box Initiator Der Aufbau von CREB CREB: CRE binding protein DNA-Bindungsdomäne basisch N C Aktivierungsdomäne Glu-reich: sauer Dimerisierungsdomäne Leucine-Zipper

98 Der Aufbau von CREB DNA-Bindungsdomäne Aktivierungsdomäne Dimerisierungsdomäne N C S P Phosphorylierung durch PKA (Protein Kinase A)

99 Ligand Rezeptor Adenylat-Cyclase ATP camp Second Messenger Protein-Kinase A (PKA) ADP ATP CREB CREB-P Co-Aktivatoren: CBP CREB-Bindeprotein: CBP P P TFIID

100 CREB -> Rekrutierung von CBP Co-Aktivatoren: CBP CBP -> Rekrutierung von RNA Polymerase II P CBP P PolII TFIID Co-Aktivatoren: CBP CBP: Histon-Acetyl-Transferase (HAT) Histon-Acetylierung verändert die Chromatin-Struktur -> Aktivierung des Gens P CBP P PolII TFIID

101 Chromatin-Remodeling Komplex CRE P P CBP TATA Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Chromatin-Remodeling Komplex CRE P P CBP TATA Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac

102 Aktivierungsdomänen der Transkritionsfaktoren Rekrutieren Co-Aktivatoren (z.b. CBP) Co -Aktivatoren interagieren mit - RNA Polymerase II - allgemeinen Transkriptionsfaktoren - Chromatin Funktion als -> Gerüstprotein -> Enzym Alles zusammen fördert Assemblierung der Transkriptionsmaschinerie am Promotor Vergleich Regulation durch camp in Pro- und Eukaryoten Bakterien direkte Regulation bindet Transkriptionsfaktor Eukaryoten indirekte Regulation aktiviert Kinase

103 CREB und Lernen Synapse -> camp -> CREB -> Transkription -> Genprodukte -> Verstärkung der Synapse Wirkung von Steroidrezeptoren Hsp90 Hsp90 hält Rezeptor in Abwesenheit von Hormon im Cytoplasma Ligand: Steroid-Hormon Kernpore HRE TFIID

104 Chromatin-Remodeling Komplex Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac HRE TATA Ac Ac Ac Ac Chromatin-Remodeling Komplex Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac HRE TATA Ac Ac Ac Ac

105 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer Promotor Enhancer aktivieren Transkription über grosse Distanzen Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer Promotor Enhancer binden spezifische Transkriptionsfaktoren

106 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer binden spezifische Transkriptionsfaktoren Stimulation Transkription? nein nein ja Rekrutierung von Co-Aktivatoren Komplex aus Co-Aktivatoren und allgemeinen Transkriptionsfaktoren Enhancer // Promotor Mediatorkomplex P P TFIID PolII

107 Struktur von RNA Polymerase II Promotoren Enhancer // Promotor Promotor: Startpunkt der Transkription: (Initiationspunkt und Richtung) abhängig von Orientierung Enhancer: Stärke der Expression unabhängig von Position und Orientierung Transkriptionsmaschinerie Repressoren der Transkription wirken z. B. durch: Rekrutierung von Histon-Deacetylasen (HDAC) Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac AcAc Ac Ac Ac Ac TATA Ac Ac Ac Ac

108 Transkriptionsmaschinerie Repressoren der Transkription wirken z. B. durch: Histon-Methyltransferasen (HMT) Me Me Me Me Me Me Me Me MeMe Me Me Me Me Me Me Me Me R K RK K RK K KR KK R H3 Acetylierung: Aktivierung der Genexpression Methylierung: Repression der Genexpression

109 DNA Methylierung MBP: Methyl CpG Binding Protein HMT: Histon Methyl Transferase HMT CH 3 CH 3 CH 3 CG 1) Nucleosomen entfernen (Hindernis) 2) Nucleosomen aufbauen (Schutz vor falscher Initiation, crpytische TATA Boxen) P C P P P P P P Pol II

110 HDAC P P P P P P HMT C Me Me Me Me P Pol II HAT Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Transkriptionsmaschinerie RNA Polymerasen Allgemeine Transkriptionsfaktoren (TFIID, TFIIB, TFIIH etc.) Sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren (CREB) Co-Aktivatoren (CBP) Histonacetylasen/Histondeacetylasen Histonmethyltransferasen Chromatin-Remodeling Komplexe

111 Genregulation III: Spleissen Genstruktur: Eukaryonten Exon Intron Exon prä-mrna AUG Transkription STOP mrna Spleissen

112 Genstruktur: Eukaryonten Cap mrna A eukaryotische mrna enthalten modifizierte 5' und 3' Enden 5' Ende: Cap 3' Ende: Poly(A)-Ende Kurz nach Beginn der Synthese wird das 5'-Ende der mrna modifiziert: Capping: mg-ppp-mrna Cap: 7-Methylguanosin über eine 5'-5'-Triphosphat-Brücke

113 Termination 3' Ende der mrna durch Endonuclease gebildet -----AAUAAA-----(10-30 nt) ----CAUUCACCUCUGUGUUUGUGUCUGC -----AAUAAA-----(10-30 nt) ----CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1) Nucleotide 3' des Polyadenylierungssignals: pre-mrna von einer Endonuclease geschnitten 2) An das 3'-Ende der pre-mrna Adenylat-Reste angeheftet: Polyadenylierung Prozessierung eukaryotischer mrna 1) 5'-Ende: Capping (mg-ppp-) 2) 3'-Ende: Endonuclease 3) Polyadenylierung des 3'-Endes 4) Splicing zur Entfernung der Introns

114 Erkennungssequenzen für das Splicing Exon Donor 5' splice site 3' splice site b ---NN GU // A YYYYYYYNCAG N Intron Akzeptor Exon Y: Pyrimidin (C oder T) ---AGG prä-mrna 1. Transesterreaktion 2'-OH Exon 1 Exon 2 NN P GU A AG P 2'-OH P NN GU A AG P G NN-OH U P 3' A AG P Exon 1 Exon 2 Lariat

115 2. Transesterreaktion G NN-OH U P 3' A Branch point AG P G U P NN A AG P Exon 1 Exon 2 NNP Spleissreaktion: Zwei-Schritt-Reaktion koordinierte Lösung und Bildung von Phosphodiester-Bindungen: 2 Transester-Reaktionen Zahl der Ester-Bindungen bleibt gleich -> keine Energiezufuhr (ATP)

116 Elongation CE: Capping Enzym 7mG CE mrna P C P P P P P P Pol II TFIID Elongation CE: Capping Enzym SF: Splicing Faktoren SF mrna 7mG SF SF P P P P P P P C Pol II

117 Elongation SF mrna 7mG CE: Capping Enzym SF: Splicing Faktoren 3' PF: 3' Ende Prozessierungs Faktoren P C 3' PF P P P P P AAUAAA P Pol II Elongation Pol II CTD als flexible Plattform für: CE: Capping Enzym SF: Splicing Faktoren 3' PF: 3' Ende Prozessierungs Faktoren P C P P P P P P Muster der Phosphorylierung Pol II

118 PABP: Poly(A) binding protein AAAAAAAAAAAAA eif4g 7mG eif4e eif: Initiationsfaktoren Genregulation IV: Translation in Eukaryoten

119 Eukaryotische Ribosomen 60S-Untereinheit 40S-Untereinheit 60 S 40 S 80 S Initiation ternärer Komplex aus Intitiator-tRNA Inititationsfaktor eif2 und der kleinen 40 S Untereinheit eif2 Met 40 S

120 Initiation eif2 AUG 40 S Met mrna Initiation beginnt am 5'-Ende der mrna und erfolgt in der Regel am ersten AUG Translation in Eukaryoten im Prinzip wie bei Bakterien aber: Initiationskomplex erkennt Cap bewegt sich in 5'->3' Richtung zum ATG also: keine interne Initiation!

121 Unterschiede in der Translation von Pro- und Eukaryoten Prokaryoten Eukaryoten Ribosomen 70 S 80 S Transkription und Translation gekoppelt getrennt Initiation intern 5'-Ende Cap-abhängig Translation 1) zytosolische Proteine: Zytosol 2) Membran- und sezernierte Proteine: rauhes ER

122 Membranprotein Hydrophob Sezernierte Proteine und Membranproteine enthalten ein Signalpeptid Met-Gly-Leu-Gly-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Leu-Leu-Trp-Thr-Arg Signalpeptid hydrophobe Aminosäuren

123 sezernierte Proteine Signalpeptid Transmembrandomäne integrales Membranprotein Signal Recognition Particle = SRP mrna SRP-Rezeptor Lumen des ER

124 mrna SRP-Rezeptor Lumen des ER mrna SRP-Rezeptor Lumen des ER

125 Translokationskanal SRP-Rezeptor Lumen des ER Translokationskanal Lumen des ER

126 Peptidase entfernt Signalpeptid Lumen des ER Lumen des ER

127 Lumen des ER Membranproteine und sekretierte Proteine Signalpeptid vom Signal Recognition Particle (= SRP) gebunden Peptid durch Membrankanal in das ER geschleust Peptidase entfernt das Signalpeptid

128 RNA Interferenz Transkription durch RNA Pol. II Cap (A) n Vorläufer Dicer pre-microrna (pre-mirna) mirna (ds, ca. 22 bp) RISC (RNA-induced silencing complex) 5' mrna Cap (A) n 3' Repression der Translation RNA Interferenz exogene sirna (small interfering RNA) Dicer exogene shrna mirna (ds, ca. 22 bp) (small hairpin RNA) RISC (RNA-induced silencing complex) 5' Cap 3' (A) n Cap Abbau der mrna (A) n

129 Rekombinante DNA II cdna kodierende Sequenz für Insulin kodierende Sequenz für Insulin Expressionsvektor für Bakterien

130 Polymerase Kettenreaktion (Polymerase chain reaction) Thermostabile DNA-Polymerase Taq Polymerase: DNA Polymerase von Thermus aquaticus DNA-Primer (20-30 nt lange chemisch synthetisierte Oligonucleotide) PCR ermöglicht die Amplifikation von DNA-Sequenzen aus geringsten Mengen DNA Aufgabe: Amplifikation eines DNA-Fragments

131 Denaturierung Polymerase Kettenreaktion (Polymerase chain reaction) 100 o C Temperatur Annealing Extension Denaturierung 30 Zyklen Zeit

132 Klonierung mittels PCR Insulin cdna kodierende Sequenz für Insulin kodierende Sequenz für Insulin Expressionsvektor für Bakterien DNA-Sequenzierung Denaturierung -> Einzelstränge Template + Primer + DNA-Polymerase, dntps dideoxy-nucleotid

133 Sequenzierung nach der Sanger-Methode CCCG '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' CCCGTACA '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' CCCGTACACCCG '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' CCCGTACACCCGAC '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' CCCGTACACCCGACT '3-GGGCATGTGGGCTGAGGCAGGCTTGCCCA-5' Terminatoren: A, G, C, T -> Abbruch der DNA-Synthese Expression von rekombinantem Insulin in Bakterien mrna in cdna umschreiben mit Reverser Transkriptase cdna-klon PCR Klonierung Sequenzierung Expression

134 RFLP: Restriction fragment length polymorphism EcoRI Allel A EcoRI 3 kb EcoRI EcoRI Allel B EcoRI 1 kb 2 kb Hybridisierung Denaturierung + markiert Probe 32 P

135 Hybridisierung 60 o C AA BB AB EcoRI Allel A EcoRI 3 kb EcoRI EcoRI Allel B EcoRI 1 kb 2 kb EcoRI EcoRI Probe

136 A B Anwendung der PCR: Fingerprinting VNTR: repetitive Sequenzen (variable number of sequence repeats) (AC) n

137 SNP ("snip") Single Nucleotide Polymorphism AAGCCTA AAGCTTA DNA Sequenzvariation im Mittel alle bp (humanes Genom)