RNA-Regulationsmechanismen: RNA Interferenz

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1 RNA-Regulationsmechanismen: RNA Interferenz Vorlesung System-Biophysik 9. Jan Literatur Martens: BIOspektrum 4/02 8. Jahrgang M. Kuhlmann: Biol. Unserer Zeit Nr.3 (2004), S. 142.

2 Genregulation durch Transkriptionsfaktoren (Jacob&Monod)

3 RNA Interferenz (Fire&Mello) RNA Moleküle können interferieren, d.h. insbesondere kann doppelsträngige RNA den Abbau von RNA und damit die posttranskriptionelle Stillegung (Silencing) eines Gens bewirken.

4 Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 2006 Andrew Z. Fire and Craig C. Mello for their discovery of "RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

5 Auch RNA kann komplementäre Strukturen bilden Doppelstrang } (dsrna)

6 The simplest of all viral life cycles. The hypothetical virus shown consists of a small double-stranded DNA molecule that codes for only a single viral capsid protein. No known virus is this simple.

7 The life cycle of the Semliki forest virus. The virus parasitizes the host cell for most of its biosyntheses.

8 Beispiele für virale Genome RNAtobacco mosaic virus parvovirus SV40 DNAT4 bacteriophage fx174 bacteriophages

9 The life cycle of a retrovirus. The enzyme reverse transcriptase first makes a DNA copy of the viral RNA molecule and then a second DNA strand, generating a double-stranded DNA copy of the RNA genome. The integration of this DNA double helix into the host chromosome, catalyzed by the viral integrase, is required for the synthesis of new viral RNA molecules by the host-cell RNA polymerase.

10 Transposons

11 Transfektion Plasmid-DNA genomic DNA mrna proteins Die Einführung von Fremd-DNA (exogener Gene) in den Zellkern erlaubt die Expression beliebiger Proteine.

12 Nucleic acid is a potentially powerful drug: transient expression or stable transformation of forgein genes in human cells genomic DNA therapeutic plasmid mrna proteins

13 Gene transfer into eucaryotic cells mechanical methods microinjection electroporation chemical vectors Ca ++ phosphate cationic polymers cationic liposomes non-viral gene delivery systems viral vectors retroviruses (Rv) Adenovirus (Ad) AAV, SV40

14 Kationische Liposome sind effiziente Transfektions- Reagenzien lipoplexes lipid-dna-complexes DNA DNS cationic liposomes DNA und Liposome fusionieren zu flüssigkristallinen Aggregaten

15 CATIONIC AMPHIPHILES H 3 C CH 3 N CH 3 H O O O O DOTAP Silvius, DDAB + + NH 3 H 3 C H 3 C N Pinnuduwage, B.B.A.,1989 Cationic Liposome NH 2 O C N DOGS H 2 N C O Behr, PNAS,1989 H 3 N Felgner et al. PNAS 1987

16 Gene Delivery Mediated by Synthetic Reagents DNA cationic liposomes - Transfer across many barriers k 0 complex formation k 1 endocytosis k 2 Golgi ER DNase endosomal breakup k 3 nuclear translocation nucleus

17 Monitoring Gene Expression via Reporter Genes Green Fluorescent Protein GFP optical real time assay firefly enzyme: GFP expressing cell culture Luciferase as reporter : capable of emitting light through ATP, O2 dependent oxidationof luciferin bacterial enzymes: e.g. β-galactosidase Chloramphenicol-Acetyl-Transferase

18 Ein Transkriptions-Aktivator und ein Transkriptions- Repressor kontrollieren das lac-operon

19 Hefe-Zwei-Hybrid-System englisch Yeast Two-Hybrid System (Y2H) Der Transkriptionsfaktors GAL4 besitzt zwei verschiedene Domänen, eine zum Binden an derdna (Bindedomäne, GAL4-Bd) und eine, welche die Transkription aktiviert (Aktivierungsdomäne, GAL4-AD). Es werde künstlich Fusionsproteine der Domänen mit zwei unterschiedlichen Proteinen erzeugt, die man Köder (Bait) und Beutetier (Prey) bezeichnet. Der Transkription kann nur erfolgen, wenn Bait und Prey interagieren und die Domänen zusammenbringen.

20 Y2H Screening zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

21 Die offenen Fragen im klassischen Modell der Genregulation (bis 1998) 1. Das Problem mit der Petunie - cosuppression 2. Antisense DNA

22 Die blaue Farbe der Petunie wird durch das Enzym Chalkonsynthase erzeugt Läßt sich die blaue Farbe durch Zugabe von zusätzlichen Chalkonsynthase-Genen verstärken?

23 Überraschung: Die Zugabe eines zusätzlichen Gens für Chalkon- Synthase führt zur Unterdrückung der Farbe - Ein Phänomen das man Cosuppression nennt.

24 Die Antisense Strategie Durch Zugabe kleiner Antisense DNA Stücke werden spezifische mrna Moleküle für die Translation gesperrt

25 Das Experiment von Fire und Mello RNA carrying the code for a muscle protein is injected into the worm C. elegans. Single-stranded RNA has no effect. But when double-stranded RNA is injected, the worm starts twitching in a similar way to worms carrying a defective gene for the muscle protein.

26 RNA silencing 1. DICER: analog einer RNase III 2. sirna (small interfering RNA)

27 3. RISC: RNAi-induzierter silencing complex (mit unbekannter Untereinheit : SLICER)

28 Standardmodell für RNAi: RISC: RNAi-induzierter silencing complex (mit unbekannter Untereinheit : SLICER) doppelsträngige RNA wird von Dicer (ein Homolog der dsrnaspezifischen RNase III) in sirnas zerlegt, sirnas werden von RISC gebunden und entwunden, der Antisense-Strang spezifiziert RISC (RNA Induced Silencing complex mit ssrnase-aktivität) zur Degradation der Ziel-mRNA.

29 Alternativer RNAi Mechanismus Entwundene sirnas dienen der RNA abhängigen RNA-Polymerase RdRP als Primer, sodass mit der mrna als Matrize ein neuer Doppelstrang gebildet wird. Weil dieser Doppelstrang wieder als Substrat für Dicer dienen kann, ist die mrna Degradation durch RISC theoretisch nicht erforderlich.

30 Verbindung zwischen Antisense RNA und RNAi

31 Natürliche Funktionen des Gene Silencings

32 Zelluläre Funktionen von RNAi Abbau aberranter RNAs und RNA-Bruchstücke Post-transkriptionale Genregulation durch endogene Antisense-RNAs Unterdrückung von springenden Genen (Transposons) Erhalt der Chromosomenintegrität durch RNA-vermittelte DNA Methylierung Abwehr von Retroviren (z.b. Aids, TMV etc.)

33 Retro-Virus indiziertes Gene Silencing

34 Molekulare Geschwister: sirna und mirna endogen codierte micro-rna (mirna) wird durch den RNAi Mechanismus in Bruchstücke zerlegt die spezifisch die Translation unterdrücken können.

35 Gene knock down genomic DNA mrna Die sirna werden in isolierte Zellen eingebracht (transfiziert) und die mrna des Zielgens wird abgebaut. Die resultierende Verringerung der Genprodukte (knock down) ermöglicht es, Hinweise auf die physiologische Bedeutung des betreffenden Genes zu erhalten. RISC proteins sirna Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001). "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836):

36 Beispiel : sirna zur Bekämpfung von HIV Ansatzpunkte für sirna bei HIV: Angriff auf virale RNA: Hier kann gleich die RNA nach dem Eindringen in die Zelle angegriffen werden, noch bevor die Reverse Transkriptase die virale RNA in cdna umwandeln kann.

37 sirna Therapieansatz gegen Krebs Einsatzmöglichkeiten von sirna bei Krebserkrankungen ist z.b. die Unterdrückung des mutierten p53-proteins. Wildtyp-p53 funktioniert als Tumorsuppressor, indemes die Zelle dazu zwingt, in Apoptose oder einen Zellzyklus-arrest überzugehen. Eine sporadisch entstandene Mutation in einem Allel des p53-gen wirkt dominant und kann so den Eintritt in die Apoptose oder den Zellzyklusarrest verhindern. sirna-vermittelte Inhibition des mutierten p53-allels könnte daher die Krebsentstehung verhindern.

38 Zusammenfassung RNAi... * Kann Verdau von mrna triggern * Benötigt Dicer, RISC und RdRP * Ist in der Lage spezifische mrna (damit Gene) auszuschalten * Ist Teil eines alten molekularen Immunsystems zur RNA Kontrolle * Ist auf zwei Arten für die Gentechnik von hoher Bedeutung a) Therapeutisch b) Research Bereich