Paracrine regulation of skin homeostasis and repair by fibroblast growth factors

Transkript

1 DISS. ETH No Paracrine regulation of skin homeostasis and repair by fibroblast growth factors A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by ANNA-KATHARINA MÜLLER Dipl. Natw. ETH Zurich, Switzerland Born July 17 th, 1981 Citizen of Zihlschlacht-Sitterdorf (TG), Switzerland accepted on the recommendation of Prof. Dr. Sabine Werner, examiner Prof. Dr. Cornelia Halin Winter, co-examiner 2012

2 Zusammenfassung Die Haut schützt unseren Körper vor schädlichen Substanzen, sowie vor Krankheitserregern, UV Strahlung und exzessivem Wasserverlust. Aufgrund dieser essentiellen Funktionen müssen Verletzungen, welche die Barrierefunktion der Haut beeinträchtigen, so schnell und effizient wie möglich geheilt werden. Wundheilungsstörungen sind ein grosses Problem in der älteren Bevölkerungsschicht sowie bei Diabetespatienten und immunsupprimierten Patienten und sie führen zu einer enormen finanziellen Belastung des globalen Gesundheitssystems. Frühere Studien aus unserem Labor zeigten die Wichtigkeit des FGF Signalweges in der Wundheilung: Mäuse, welche eine dominant- negative FGFR2- IIIb Mutante in Keratinozyten exprimieren, haben eine stark verzögerte Reepithelialisierung von Hautwunden. Allerdings liess dieser Ansatz nicht darauf schliessen, welche FGF Liganden oder Rezeptoren für die verzögerte Wundheilung verantwortlich sind. Deshalb generierten wir Mäuse, denen FGFR1 und FGFR2 in Keratinozyten fehlen. Zusätzlich zu anderen phänotypischen Anomalien verloren diese Doppel- Knockoutmäuse ihre Haare und sie zeigten schwere Reproduktionsdefekte. Überraschenderweise konnte eine Akanthose in der Epidermis dieser Mäuse festgestellt werden. Diese resultierte aus der reduzierten Expression wichtiger Tight Junction Komponenten in den FGFR1 und FGFR2 defizienten Keratinozyten. Dieser Defekt verursachte ausgeprägte Hauttrockenheit, welche zur Aktivierung von epidermalen γδ T Zellen und der Produktion von IL- 1F8 in diesen Zellen führte. IL- 1F8 kombiniert mit von Keratinozyten stammendem S100A8 und S100A9 löste eine Hyperproliferation der Keratinozyten aus durch die Induktion eines doppel parakrinen Loops, welcher Stromazellen der Dermis involvierte. Die Hypothese, dass die Trockenheit der Haut den Phänotyp verschlimmert, wurde dadurch untermauert, dass das Eincrèmen der Haut der Mäuse mit einer befeuchtenden Hautcrème die Entzündung reduzierte, die wir in den Doppel- Knockoutmäusen beobachtet hatten. Nach Verwundung der Doppel- Knockoutmäuse zeigten diese eine Verzögerung im Heilungsprozess. Dies war auf eine reduzierte Kontraktion sowie auf Defekte

3 in der Reepithelialisierung zurückzuführen. Der Kontraktionsdefekt ist ein sekundärer Effekt, der auf Veränderungen in der Zusammensetzung des Bindegewebes der Dermis zurückzuführen ist. Die Verzögerung in der Reepithelialisierung hingegen ist ein direkter Effekt des FGFR1/2 Knockouts in Keratinozyten dieser Tiere. Keratinozyten von Doppel- Knockoutmäusen migrierten langsamer in vitro, und ihre gerichtete Migration war verschlechtert. Auch war die Anhaftung dieser Zellen an die extrazelluläre Matrix reduziert und verzögert. Als zugrunde liegenden Mechanismus identifizierten wir eine reduzierte Expression der Focal Adhesion Komponenten Paxillin und Focal Adhesion Kinase in den FGFR1/R2- defizienten Zellen. Zusammenfassend identifizierten wir neue Zielproteine des FGF Signalweges in der Haut, nämlich die Tight Junction Proteine Claudin 1, Claudin 3 und Occludin, sowie die Focal Adhesion Proteine Paxillin und Focal Adhesion Kinase. Die reduzierte Expression von Tight Junction Komponenten führte zu einem Phänotyp der Haut, der vergleichbar ist mit dem von Patienten, die an Atopischer Dermatitis leiden. Die reduzierte Expression der Focal Adhesion Komponenten führte zu Wundheilungs- Störungen, die Gemeinsamkeiten aufweisen mit denen von Patienten, die an chronischen Hautgeschwüren leiden. Daher sollte die Expression und die Aktivität der FGFRs sowie die Mengen ihrer Liganden in der Haut von Patienten mit Atopischer Dermatitis bzw. chronischen Hautgeschwüren untersucht werden. Die Ähnlichkeit der Anomalien in unseren Mäusen mit denen von Patienten, die an häufigen menschlichen Hautkrankheiten leiden, spricht dafür, dass die FGFR1/2 Doppel- Knockoutmäuse als interessantes Modellsystem dienen könnten, um zumindest einige Aspekte der Pathogenese dieser Krankheiten zu untersuchen und um neue Behandlungsstrategien zu entwickeln.

4 Summary The skin protects our body from harmful environmental insults, such as pathogens and UV irradiation, and from excessive water loss. Due to the essential functions of the skin, injuries, which disrupt the skin s barrier function, need to be rapidly and efficiently repaired. Wound healing disorders are a major problem in aged individuals as well as in patients with certain diseases, such as diabetes. The development of strategies to improve the wound healing process is therefore essential, and this requires a thorough understanding of the mechanisms underlying normal and impaired wound repair. Previous studies performed in our laboratory revealed the importance of the FGF signaling pathway in wound healing, since mice expressing a dominant- negative FGFR2- IIIb mutant in keratinocytes showed a severe delay in reepithelialization. However, this approach did not allow to identify the ligands or receptors that are responsible for the delay in wound healing. For this reason we generated mice lacking FGFR1 and FGFR2 in keratinocytes. Amongst other phenotypic abnormalities, these double knockout mice loose their hair and they show severe defects in reproduction. Surprisingly, a progressive acanthosis was observed in the epidermis. This resulted from reduced expression of major tight junction components in the absence of FGFR1 and FGFR2 in keratinocytes. The junctional defect caused severe skin dryness, resulting in activation of epidermal γδ T cells, and production of IL- 1F8 by these cells. This cytokine combined with keratinocyte- derived S100A8 and S100A9 caused keratinocyte hyperproliferation through induction of a double paracrine loop involving stromal cells of the dermis. In support of a role of skin dryness in the phenotype, topical treatment with moisturizing cream reduced the inflammatory infiltrate observed in the double knockout mice. Upon full- thickness skin wounding, the double knockout mice showed a delay in the wound repair process. This was due to impairments in contraction as well as in reepithelialization. The contraction defect is a secondary effect that arises from alterations in the connective tissue composition in the dermis. The delay in

5 reepithelialization, however, is a direct effect of the FGFR1/2 knockout in keratinocytes of these animals. Keratinocytes from double knockout mice had a reduced migratory speed in vitro and their directional migration was impaired. Furthermore, attachment of these cells to the extracellular matrix was reduced and delayed. As the underlying mechanism we identified reduced expression of paxillin and focal adhesion kinase, two focal adhesion proteins, in FGFR1/2- deficient keratinocytes. In summary, we identified new targets of the FGF signaling pathway in murine skin, including the tight junction proteins claudin 1, claudin 3 and occludin as well as the focal adhesion proteins paxillin and focal adhesion kinase. The impaired expression of tight junction components resulted in the development of a phenotype resembling atopic dermatitis, whereas the reduced expression of focal adhesion components caused wound healing abnormalities with similarities to chronic human skin ulcers. Therefore, expression and activity of FGFRs and the levels of their ligands should be determined in the skin of patients with atopic dermatitis or chronic ulcers. The similarities of the abnormalities of our mice with those seen in major human skin diseases suggest that the FGFR1/2 double knockout mice could serve as an interesting model system to study at least certain aspects of the pathogenesis of these disorders and for the development of novel treatment strategies.