Prävalenz von Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp. in Zecken aus dem Stadtgebiet Hamburg

Transkript

1 Tierärztliche Hochschule Hannover Prävalenz von Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp. in Zecken aus dem Stadtgebiet Hamburg Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.) vorgelegt von Kathrin May Daun/Eifel Hannover 2015

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD, Institut für Parasitologie 1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD, Institut für Parasitologie 2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Lothar Kreienbrock, Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung Tag der mündlichen Prüfung:

3 Für Walter Göden ( )

4

5 Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt: Kathrin May, Thomas Schnieder, Christina Strube (2012): Prävalenz von Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp. in Zecken aus dem Stadtgebiet Hamburg Tagung der DVG Fachgruppe Parasitologie und parasitäre Krankheiten", Hannover, Elisabeth Janecek, Daniela Jordan, Julia Tappe, Kathrin May, Volker Fingerle, Christina Strube (2014): Untersuchungen zur transovarialen Übertragung von pathogenen Mikroorganismen in Ixodes ricinus 2. Süddeutscher Zeckenkongress, Stuttgart,

6 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Publikationen Prävalenz von Rickettsiales (Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp.) in Schildzecken (Ixodes ricinus) aus dem Stadtgebiet Hamburg Borrelia burgdorferi sensu lato und Koinfektionen mit Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp. in Ixodes ricinus in Hamburg Zusammenfassung der Ergebnisse Probematerial Detektion von A. phagocytophilum in I. ricinus Detektion von Rickettsia spp. in I. ricinus Speziesbestimmung von Rickettsia spp Detektion von B. burgdorferi s.l. in I. ricinus Genospeziesidentifizierung von B. burgdorferi s.l Koinfektionen mit B. burgdorferi s.l. und Rickettsiales Übergreifende Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abbildungs- und Tabellenverzeichnis... 35

7 Einleitung 1 1 Einleitung Die Schildzecke Ixodes ricinus ist die am weitesten verbreitete Zeckenart in Europa und fungiert als Vektor für diverse pathogene Mikroorganismen. Hierzu zählen unter anderem Bakterien der Ordnung Rickettsiales wie Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp. sowie Spirochäten des Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.)-komplexes. Die Lyme-Borreliose des Menschen stellt die häufigste durch Zecken übertragene Krankheit in Europa dar. Sie wird durch diverse Borrelia-Genospezies des B. burgdorferi s.l.-komplexes ausgelöst, welche vielfältige klinische Symptome bei erkrankten Patienten auslösen können. So kann es neben der Infektion der Haut (Erythema migrans, Acrodermatitis chronica atrophicans) zur Dissemination der Erreger in die Gelenken (Lyme-Arthritis), das Herz (Lyme-Carditis) und das Nervensystem (Neuroborreliose) kommen. Während der Frühmanifestation der Lyme- Borreliose kommt es zunächst zu Fieber, Muskelschmerzen und in ca. 50 % der Fälle zum Erythema migrans. Im weiteren Verlauf der Infektion kann sich eine Neuroborreliose oder Lyme-Carditis ausbilden. Im Zuge der Spätmanifestation können eine Lyme-Arthritis oder Acrodermatitis chronica atrophicans auftreten. Zurzeit werden mindestens 12 von 20 weltweit anerkannten B. burgdorferi s.l.-genospezies in Europa beschrieben, nämlich B. afzelii, B. bavariensis, B. bissettii, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. carolinensis, B. finlandensis, B. garinii, B. lusitaniae, B. kurtenbachii, B. spielmanii, B. turdi und B. valaisiana. Mit Ausnahme von B. carolinensis, B. finlandensis und B. turdi, bei denen bislang kein pathogenes Potential nachgewiesen wurde, wurden alle genannten Genotypen als humanpathogen eingestuft (RUDENKO et al. 2011). In zentraleuropäischen Ländern sind mehr als 20 % der adulten Zecken und 11 % der Nymphen mit B. burgdorferi s.l. infiziert (RAUTER u. HARTUNG 2005), wobei die Prävalenz in I. ricinus in Deutschland von 3,1 % an der Ostseeküste bis 36,3 % in Bayern variiert (FINGERLE et al. 1999; FRANKE et al. 2011). Borrelia miyamotoi, ein ebenfalls zu den Spirochäten zählendes Humanpathogen, wurde bei 1,8 % der I. ricinus in Deutschland nachgewiesen (CROWDER et al. 2014). Diese Borrelien können das sog. Rückfallfieber aus, welches mit klinischen Anzeichen wie Fieber, Schüttelfrost, Abgeschlagenheit, Kopf- und Gliederschmerzen sowie Übelkeit einhergeht (KRAUSE et al. 2015). Im Gegensatz zum Anfangsstadium der Lyme-Borreliose sind die akuten klinischen Symptome des Rückfallfiebers meist stärker ausgeprägt und das Erythema migrans tritt seltener auf (PLATONOV et al. 2011). Zudem sind bei einer Infektion mit B. miyamotoi rezidivierende Fieberschübe möglich. Das zu den Rickettsiales gehörende Pathogen A. phagocytophilum ist ein obligat intrazelluläres Gram-negatives Bakterium, welches neutrophile Granulozyten befällt und die humane

8 2 Einleitung granulozytäre Anaplasmose (HGE) induzieren kann. Betroffene Patienten zeigen häufig unspezifische klinische Symptome wie Fieber, Kopf- und Muskelschmerzen sowie Abgeschlagenheit, gelegentlich auch Erbrechen und Durchfall. Auch wurde ein akuter transienter sensorineuraler Hörverlust bei einem Patienten mit einer A. phagocytophilum- Infektion in Verbindung gebracht (GHERA et al. 2011). Die granulozytäre Anaplasmose wird nicht nur beim Menschen, sondern auch bei Hunden und Pferden beschrieben (GRIBBLE 1969; PUSTERLA et al. 1998). Bei erkrankten Tieren werden Fieber, Lahmheit und Blutbildveränderungen wie Anämie, Thrombozytopenie und Leukopenie beobachtet. Eine Infektion mit A. phagocytophilum löst des Weiteren bei Schafen und Rindern das sog. tickborne fever" oder Weidefieber aus und verursacht wirtschaftliche Verluste durch Aborte, gestörtes Allgemeinbefinden und verminderte Produktivität wie reduzierte Milchleistung und Gewichtszunahme (HUDSON 1950; STAMP 1950). Die ebenfalls obligat intrazellulären Bakterien der Gattung Rickettsia befallen hauptsächlich Endothelzellen und induzieren grippeähnliche Symptome (z. B. Fieber und Myalgie), Exantheme und Lymphadenopathien (FOURNIER et al. 2000; RICHTER et al. 2002; BAUMANN et al. 2003). Bislang wurden sechs verschiedene Rickettsienspezies aus deutschen Zecken isoliert, die alle der Zecken-Fleckfiebergruppe zuzuordnen sind. R. massiliae, R. monacensis, R. felis und R. helvetica wurden in der Schildzecke I. ricinus nachgewiesen, während R. raoultii und R. slovaca in der Auwaldzecke Dermacentor reticulatus präsent waren (SIMSER et al. 2002; WÖLFEL et al. 2006; DOBLER u. WÖLFEL 2009; SCHORN et al. 2011; SCHICHT et al. 2012; TAPPE und STRUBE 2013). Alle genannten Spezies sind von humanpathogener Bedeutung (MEDIANNIKOV et al. 2008; DOBLER u. WÖLFEL 2009; PAOLA et al. 2009), wobei R. helvetica die am häufigsten vorkommende Rickettsienart in Deutschland ist (SIMSER et al. 2002; HARTELT et al. 2004; PICHON et al. 2006; WÖLFEL et al. 2006; DOBLER u. WÖLFEL 2009; HILDEBRANDT et al. 2010; SCHORN et al. 2011; SCHICHT et al. 2012; TAPPE u. STRUBE 2013). R. helvetica induziert die sogenannte Sommergrippe, eine fieberhafte Erkrankung, bei der typischerweise keine Hautsymptome auftreten. Bei schweren Verläufen kann es zur Infektion der Hirnhäute und des Herzens kommen. Das klassische Fleckfieber, welches mit einem fleckigen Hautausschlag einhergeht, kann durch R. massiliae und R. monacensis ausgelöst werden. Im Unterschied dazu führt eine Infektion mit R. felis, dem Erreger des Floh-Fleckfiebers, zu einem masernähnlichen Hautausschlag. Auch bei einer Infektion mit R. raoultii werden Hautausschläge sowie Lymphadenopathien beobachtet. Die sogenannte TIBOLA ( tick-borne-lymphadenitis"), eine ebenfalls fieberhafte Erkrankung, wird

9 Einleitung 3 durch R. slovaca verursacht. Hierbei kommt es im Bereich der Einstichstelle zur Lymphadenitis, jedoch nicht zum Exanthem (DOBLER u. WÖLFEL 2009). Obwohl zoonotische, durch Zecken übertragene Erkrankungen eine zunehmende Gesundheitsgefährdung darstellen (GRAY et al. 2009), sind bislang Studien über das Vorkommen von Rickettsiales und B. burgdorferi s.l. in norddeutschen Zecken nur aus Hannover (SCHICHT et al. 2011; SCHICHT et al. 2012; TAPPE u. STRUBE 2013; TAPPE et al. 2014) und der Ostseeküste verfügbar (FRANKE et al. 2011). Um weitere Informationen über Pathogene in Zecken aus Norddeutschland zu erhalten und das Expositionsrisiko für Besucher innerstädtischer Grünanlagen abzuschätzen, war das Ziel dieser Arbeit, erste Daten zur Prävalenz von A. phagocytophilum, Rickettsia spp. und B. burgdorferi s.l. in I. ricinus-zecken aus dem Stadtgebiet Hamburg, der zweitgrößten deutschen und der sechstgrößten Stadt der Europäischen Union, zu erheben. Die gewonnen Erkenntnisse sollen im Weiteren als Grundlage für einen innerstädtischen Vergleich zwischen Hamburg und Hannover bezüglich der Prävalenz dieser Pathogene in I. ricinus dienen. Hamburg liegt etwa 130 km von Hannover entfernt und ist durch seine küstennahe Lage mit bestimmten klimatischen Bedingungen assoziiert. Daten des Deutschen Wetterdienstes ( zeigen nahezu identische langfristige (zwischen ) durchschnittliche Temperaturen für beide Städte (9,6 C für Hannover; 9,5 C für Hamburg); jedoch weist die langfristige durchschnittliche Niederschlagsmenge mit 659 mm in Hannover und 795 mm in Hamburg deutliche Unterschiede auf. Zudem wurden in Hamburg vier Frosttage weniger als in Hannover registriert. Diese klimatischen Parameter können sowohl das Überleben der Zecken als auch die in der Zecke vorkommenden Pathogene beeinflussen. Begünstigen beispielsweise lokale Klimaparameter wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit den Entwicklungszyklus von I. ricinus, kann dies zur Aufrechterhaltung des Lebenszyklus der Pathogene beitragen. Neben der Untersuchung der Zecken bezüglich der Infektionen mit A. phagocytophilum, Rickettsia spp. und B. burgdorferi s.l. unter Verwendung der quantitativen real-time PCR (qpcr) wurde die Verteilung der Borrelia-Genospezies mittels des Reverse Line Blots (RLB) und der Rickettsia-Spezies mittels der real-time Pyrosequenzierung bestimmt. Des Weiteren wurde die Koinfektionsrate B. burgdorferi s.l.-positiver Zecken mit A. phagocytophilum und Rickettsia spp. bestimmt.

10 4 Publikationen 2 Publikationen 2.1 Prävalenz von Rickettsiales (Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp.) in Schildzecken (Ixodes ricinus) aus dem Stadtgebiet Hamburg MAY, K 1 u. C. STRUBE 1 (2014): Prevalence of Rickettsiales (Anaplasma phagocytophilum and Rickettsia spp.) in hard ticks (Ixodes ricinus) in the city of Hamburg. Parasitol. Res. (2014) 113, Institut für Parasitologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Abstract: To narrow the gap of missing knowledge on Rickettsia spp. and Anaplasma phagocytophilum infections in ticks in northwestern Germany and, at the same time, to provide first prevalence data on these pathogens in the city of Hamburg, a total of 1,400 questing Ixodes ricinus ticks were collected at ten different public green areas from April until October Ticks were examined using probe-based quantitative real-time PCR. A percentage of 3.6 % (51/1,400) ticks were tested positive for A. phagocytophilum infections divided into 2.1 % (3/141) adults [1.7 % (1/60) females and 2.5 % (2/81) males] and 3.8 % (48/1,259) nymphs. The percentage of infected ticks per sampling site varied statistically significantly from 0.7 % (1/140) to 12.1 % (17/140), whereas between sampling months, no statistically significant differences were observed ( %, 4 13/140). The overall Rickettsia spp. infection rate was 52.5 % (735/1,400). In adult ticks, Rickettsia spp. infection rate was 56 % (79/141) divided into 61.7 % (37/60) infected females and 51.9 % (42/81) infected males. Nymphs showed an infection rate of 52.1 % (656/1,259). In contrast to A. phagocytophilum infections, no statistically significant differences in Rickettsia spp. infection rates among sampling sites ( %, 62 89/140) were observed, whereas seasonal variations were obvious: the percentage of Rickettsia-positive ticks was significantly lower in April (36.5 %, 73/200) and May (29.5 %, 59/200) compared to the summer and fall months ( %, /200). Rickettsia species differentiation via real-time pyrosequencing revealed Rickettsia helvetica as the only occurring species. Coinfections with both Rickettsia spp. and A. phagocytophilum were detected in 2.0 % (28/1,400) of the ticks. The present study revealed that in the city of Hamburg, the tick infection rate with A. phagocytophilum is comparable with other German data, whereas the Rickettsia spp. infection rate of 52.5 % is by far the highest prevalence detected in Germany so far. As the city

11 Publikationen 5 of Hamburg has 1.8 million inhabitants and attracts millions of tourists every year, the potential health risk should not be underestimated. Erklärung über den eigenen Anteil der Publikation: Konzept, Versuchsplanung: Christina Strube Experimentelle Durchführung: Kathrin May Diskussion, Beratung: Kathrin May, Christina Strube Manuskript, Korrespondenz: Kathrin May, Christina Strube

12 6 Publikationen 2.2 Borrelia burgdorferi sensu lato und Koinfektionen mit Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp. in Ixodes ricinus in Hamburg MAY, K. 1, D. JORDAN 1, V. FINGERLE 2 u. C. STRUBE 1 (2015): Borrelia burgdorferi sensu lato and coinfections with Anaplasma phagocytophilum and Rickettsia spp. in Ixodes ricinus in Hamburg, Germany. Med. Vet. Entomol. (2015) 29, Institut für Parasitologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 2 Nationales Referenzzentrum für Borrelien, Oberschleißheim Abstract: To obtain initial data on Borrelia burgdorferi sensu lato (Spirochaetales: Spirochaetaceae) in Ixodes ricinus (Ixodida: Ixodidae) ticks in Hamburg, Germany, 1400 questing ticks were collected by flagging at 10 different public recreation areas in 2011 and analysed using probebased quantitative real-time polymerase chain reaction. The overall rate of infection with B. burgdorferi s.l. was 34.1%; 30.0% of adults were infected (36.7% of females and 26.0% of males), as were 34.5% of nymphs. Significant differences in tick infection rates were observed between the spring and summer/autumn months, as well as among sampling locations. Borrelia genospecies identification by reverse line blotting was successful in 43.6% of positive tick samples. The most frequent genospecies was Borrelia garinii/borrelia bavariensis, followed by Borrelia afzelii, Borrelia valaisiana, B. burgdorferi sensu stricto, Borrelia spielmanii, Borrelia bissettii and Borrelia lusitaniae. Based on previously published data, co-infection of Borrelia and Rickettsiales spp. was determined in 25.8% of ticks. Overall, 22.9% of ticks were coinfected with Rickettsia spp. (Rickettsiales: Rickettsiaceae), 1.7% with Anaplasma phagocytophilum (Rickettsiales: Anaplasmataceae), and 1.2% with both pathogens. Study results show a high prevalence of Borrelia-positive ticks in recreation areas in the northern German city of Hamburg and the potential health risk to humans in these areas should not be underestimated. Erklärung über den eigenen Anteil an der Publikation: Konzept, Versuchsplanung: Christina Strube Experimentelle Durchführung: Kathrin May, Daniela Jordan Diskussion, Beratung: Kathrin May, Daniela Jordan, Volker Fingerle, Christina Strube Manuskript, Korrespondenz: Kathrin May, Christina Strube

13 Zusammenfassung der Ergebnisse 7 3 Zusammenfassung der Ergebnisse 3.1 Probematerial Von April bis Oktober 2011 wurden ungesogene I. ricinus-zecken in zehn verschiedenen Grünanlagen im Stadtgebiet der Freien und Hanseatischen Stadt Hamburg mittels der Flaggmethode gesammelt. Im Norden der Stadt lagen die Sammelorte Raakmoor und Volksdorfer Wald, im Westen Gosslers Park und Altonaer Volkspark, im Süden Neugrabener Heide und Schwarzenberg, im Osten Bergedorfer Gehölz und Öjendorfer Park und im Zentrum Alster und Stadtpark Winterhude. Es wurden zwanzig Zecken pro Sammelort und Monat untersucht, was in insgesamt 1400 Zecken resultierte. Diese wurden ausschließlich als I. ricinus identifiziert, unterteilt in 141 Adulte (81 männliche und 60 weibliche Individuen) sowie 1259 Nymphen. 3.2 Detektion von A. phagocytophilum in I. ricinus Die Proben wurden mittels Sonden-basierter quantitativer real-time PCR (qpcr) auf A. phagocytophilum untersucht, wobei das 16S rrna-gen die Zielgensequenz darstellte (SIRIGIREDDY u. GANTA 2005). Die Gesamtinfektionsrate für A. phagocytophilum betrug 3,6 % (51/1400 Zecken). Insgesamt waren 2,1 % (3/141) der adulten Zecken positiv, untereilt in 2,5 % (2/81) männliche und 1,7 % (1/60) weibliche Zecken. Der Prozentsatz infizierter Nymphen betrug 3,8 % (48/1259). Der statistische Vergleich der Entwicklungsstadien zeigte keine signifikanten Unterschiede. Bezüglich der saisonalen Verteilung variierten die Zeckeninfektionsraten von minimal 2,0 % (4/200) im August bis maximal 6,5 % (13/200) im Juni, jedoch waren diese Unterschiede nicht statistisch signifikant. In Abbildung 1 sind detaillierte Informationen über die monatliche Verteilung von A. phagocytophilum-positiven Zecken aufgeführt. Die Analyse der lokalen Verteilung zeigte, dass die höchste lokale A. phagocytophilum-infektionsrate von 12,1 % (17/140) am Standort Stadtpark Winterhude" vorlag. Statistisch signifikant niedrigere Infektionsraten wurden an den Sammelorten Schwarzenberg" [0,7 % (1/140)] bzw. Altonaer Volkspark" und Volksdorfer Wald" [beide jeweils 1,4 % (2/140)] nachgewiesen. Eine detaillierte Übersicht über die lokale Verteilung von A. phagocytophilum in I. ricinus inklusive p-werte und adjustierte α-werte ist in Abbildung 2 enthalten.

14 Prävalenz (%) 8 Zusammenfassung der Ergebnisse 70 p 0,001; α=0,0025 p 0,001; α=0,0026 p 0,001; α=0,0028 p 0,001; α=0,0029 p 0,001; α=0,0031 p 0,001; α=0,0033 p 0,001; α=0,0036 p 0,001; α=0,0038 p 0,001; α=0,0042 p 0,001; α=0, ,5 60,0 64,5 61, , ,5 29, ,0 6,5 2,5 3,0 2,0 3,0 2,5 April May Juni Juli August September Oktober A. phagocytophilum Rickettsia spp. Abb. 1: Saisonale Verteilung von A. phagocytophilum- und Rickettsia spp.-infektionsraten in I. ricinus

15 Zusammenfassung der Ergebnisse Detektion von Rickettsia spp. in I. ricinus Das Citrat-Synthase (glta)-gen diente als Rickettsia spp.-zielsequenz und wurde mittels einer Primer-Sonden-Kombination nach STENOS et al. (2005) detektiert. Anhand der Rickettsia spp.- spezifischen qpcr wurden 52,5 % (735/1400) positive Zecken ermittelt. Insgesamt wurden 56,0 % (79/141) aller Adulten positiv getestet. Davon waren 61,7 % (37/60) weiblich und 51,9 % (42/81) männlich. Dahingegen waren 52,1 % (656/1259) der Nymphen mit Rickettsia spp. infiziert. Die Infektionsraten zwischen den Stadien und Geschlechtern zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede. In den Frühjahrsmonaten lag die Prävalenz bei 36,5 % (73/200; April) bzw. 29,5 % (59/200; Mai). Von Juni an waren zwischen 55,0 % (110/200) und 64,5 % (129/200) der untersuchten Zecken mit Rickettsia spp. infiziert, wodurch sich statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Frühjahrsmonaten und den darauffolgenden Monaten ergaben. Detaillierte Daten über die saisonale Verteilung von Rickettsia spp.-positiven Zecken sind in Abbildung 1 aufgeführt. An der Sammelstelle Schwarzenberg" wurde mit 44,3 % (62/140) die niedrigste lokale Infektionsrate nachgewiesen, während der maximale Prozentsatz infizierter Zecken [63,6 % (89/140)] an der Sammelstelle Alster ermittelt wurde. Dennoch waren die Unterschiede zwischen den Sammelorten nicht statistisch signifikant. Weitere Informationen bezüglich der Rickettsia spp.-infektionsraten in I. ricinus an verschiedenen Sammelorten sind in Abbildung 2 enthalten.

16 Prävalenz (%) 10 Zusammenfassung der Ergebnisse 70 p 0,001; α=0, p 0,001; α=0, p 0,001; α=0, ,6 60, ,0 46,4 52,9 44,3 47,9 48,6 51,4 54, , ,7 1,4 2,1 0,7 5,7 2,9 1,4 2,1 2,1 Rickettsia spp.. A. phagocytophilum Abb. 2: A. phagocytophilum- und Rickettsia spp.-infektionsraten in I. ricinus-zecken an den verschiedenen Sammelorten

17 Zusammenfassung der Ergebnisse Speziesbestimmung von Rickettsia spp. Die zunächst durchgeführte konventionelle PCR konnte bei 25,6 % (188/735) der Rickettsia spp.-positiven Zeckenproben das glta-gen der Rickettsien erfolgreich amplifizieren. Die anschließende real-time Pyrosequenzierung-Technologie identifizierte R. helvetica in allen 188 Zeckenproben. Proben im Bereich von 10 3 bis 10 5 glta-kopien in der qpcr konnten zu 100 % identifiziert werden (10 3 Kopien: 49/49; 10 4 Kopien: 69/69; 10 5 Kopien: 2/2). Im Bereich von hundert (10 2 ) glta-kopien betrug die Detektionsrate 85,7 % (12/14) und im zweistelligen Kopien-Bereich (10 1 ) 15,8 % (6/38), während bei weniger als zehn qpcr-detektierten glta- Kopien lediglich eine Differenzierungsrate von 8,9 % (50/563) erreicht wurde. 3.5 Detektion von B. burgdorferi s.l. in I. ricinus Die zur Detektion von B. burgdorferi s.l. durchgeführte qpcr basierte auf der TaqMan TM - minor groove binder (MGB) Sonden-Technologie, welche die 5S-23S intergenic spacer (IGS)-Region detektierte (STRUBE et al. 2010). Die Gesamtprävalenz von B. burgdorferi s.l. in I. ricinus- Zecken lag bei 34,1 % (477/1400). Insgesamt wurden 30,0 % (43/141) der adulten positiv getestet, unterteilt in 36,7 % (22/60) weibliche und 26,0 % (21/81) männliche Zecken. Nymphen waren zu 34,4 % (434/1259) infiziert. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich der Infektionsraten zwischen Entwicklungsstadien und Geschlechtern beobachtet. Die untersuchten Zecken waren im April [13,5 % (27/200)] im Vergleich zu den Monaten Juni bis Oktober [35,5 % (71/200)-48,0 % (96/200)] und im Mai [25,0 % (50/200)] im Vergleich zu August [42,5 % (85/200)] und Oktober [48,0 % (96/200)] signifikant weniger häufig infiziert (p 0,001). Die lokale Zeckeninfektionsrate von 21,4 % (30/140) am Standort Schwarzenberg" war statistisch signifikant niedriger (p 0,001) als an den Probeorten Stadtpark Winterhude" [41,4 % (58/140)] bzw. Raakmoor" [43,6 % (61/140)]. Eine ausführliche Darstellung der saisonalen und geographischen Verteilung von B. burgdorferi s.l. in I. ricinus Zecken ist in Tabelle 1 dargestellt.

18 12 Zusammenfassung der Ergebnisse Tabelle 1: Saisonale und geographische Verteilung von B. burgdorferi s.l. in I. ricinus-zecken [Positive/Gesamt (%)] Sammelorte April Mai Juni Juli August September Oktober Gesamt (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) Raakmoor 3/20 6/20 8/20 7/20 17/20 3/20 17/20 61/140 (15,0) (30,0) (40,0) (35,0) (85,0) (15,0) (85,0) (43,6) Volksdorfer 0/20 10/20 1/20 7/20 14/20 5/20 9/20 46/140 Wald (0,0) (50,0) (5,0) (35,0) (70,0) (25,0) (45,0) (32,9) Neugrabener 3/20 2/20 2/20 17/20 10/20 10/20 2/20 46/140 Heide (15,0) (10,0) (10,0) (85,0) (50,0) (50,0) (10,0) (32,9) Schwarzen- 2/20 4/20 7/20 6/20 4/20 4/20 3/20 30/140 berg (10,0) (20,0) (35,0) (30,0) (20,0) (20,0) (15,0) (21,4) Bergedorfer 4/20 11/20 4/20 11/20 7/20 6/20 3/20 46/140 Gehoelz (20,0) (55,0) (20,0) (55,0) (35,0) (30,0) (15,0) (32,9) Gosslers Park 5/20 5/20 7/20 5/20 8/20 8/20 8/20 46/140 (25,0) (25,0) (35,0) (25,0) (40,0) (40,0) (40,0) (32,9) Altonaer 3/20 2/20 6/20 10/20 3/20 8/20 13/20 45/140 Volkspark (15,0) (10,0) (30,0) (50,0) (15,0) (40,0) (65,0) (32,1) Alster 2/20 1/20 12/20 5/20 4/20 8/20 18/20 50/140 (10,0) (0,5) (60,0) (25,0) (20,0) (40,0) (90,0) (35,7) Stadtpark 3/20 9/20 14/20 4/20 7/20 6/20 15/20 58/140 Winterhude (15,0) (45,0) (70,0) (20,0) (35,0) (30,0) (75,0) (41,4) Oejendorfer 2/20 0/20 10/20 5/20 11/20 13/20 8/20 49/140 Park (10,0) (0,0) (50,0) (25,0) (55,0) (65,0) (40,0) (35,0) Gesamt 27/200 * 50/200 ** 71/200 77/200 85/200 71/200 96/ /1400 (13,5) (25,0) (35,5) (38,0) (42,5) (35,5) (48,0) (34,1) * statistisch signifikant niedrigere Zeckeninfektionsrate verglichen mit Juni-Oktober (p 0,001) ** statistisch signifikant niedrigere Zeckeninfektionsrate verglichen mit August und Oktober (p 0,001) statistisch signifikant niedrigere Zeckeninfektionsrate verglichen mit den Probeorten Raakmoor" und Stadtpark Winterhude" (p 0,001)

19 Zusammenfassung der Ergebnisse Genospeziesidentifizierung von B. burgdorferi s.l. Die Differenzierung der B. burgdorferi s.l.-genospezies wurde mittels Reverse Line Blots (RLB) erreicht, der eine Identifikation der Genospezies B. afzelii, B. garinii/b. bavariensis, B. bissettii, B. burgdorferi s.s., B. lusitaniae, B. spielmanii und B. valaisiana ermöglicht. Diese Untersuchungen wurden im Zuge einer Masterarbeit durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse flossen in die Veröffentlichung Borrelia burgdorferi sensu lato and coinfections with Anaplasma phagocytophilum and Rickettsia spp. in Ixodes ricinus in Hamburg, Germany (MAY et al. 2015) mit ein. B. burgdorferi s.l.-genospezies wurden bei 43,6 % (208/477) der positiven Proben identifiziert. Bei positiven Zeckenproben, die 10 Zielkopien pro qpcr- Reaktion enthielten, betrug die Differenzierungsrate 32,4 % (106/327), wohingegen Zecken mit 10 Zielkopien zu einem Prozentsatz von 79,3 % (119/150) differenziert wurden. Der am häufigsten ermittelte Genotyp war B. garinii/b. bavariensis (84/208; 40,4 %), gefolgt von B. afzelii (70/208; 33,7 %) und B. valaisiana (45/208; 21,6 %). B. burgdorferi s.s. wurde bei 11,1 % (23/208) der Individuen detektiert und 10,0 % (21/208) der Zecken waren mit B. spielmanii infiziert. B. bissettii wurde bei 3,4 % (7/208) der Proben identifiziert, wohingegen B. lusitaniae bei nur 0,5 % (1/208) der Zecken nachgewiesen wurde. Da eine Differenzierung zwischen B. garinii und B. bavariensis mittels des RLBs nicht möglich war, wurde weiterführend eine Sanger-Sequenzierung zur Differenzierung dieser beiden Genospezies durchgeführt, welche bei 33,3 % (28/84) der B. garinii/b. bavariensis-positiven Proben erfolgreich war. Von diesen wurden 81,1 % (23/28) als B. garinii und 17,9 % (5/28) als B. bavariensis identifiziert. Insgesamt waren 82,2 % (171/208) der Zecken monoinfiziert und ein Prozentsatz von 15,4 % (32/208) der Individuen war mit zwei Genospezies infiziert. Vier Proben (1,9 %) zeigten eine Dreifachinfektion und eine Zecke (0,5 %) war mit vier verschiedenen Genospezies infiziert. In Tabelle 2 wird eine detaillierte Übersicht über die Verteilung von B. burgdorferi s.l.- Genospezies in positiven I. ricinus-zecken dargestellt.

20 14 Zusammenfassung der Ergebnisse Tabelle 2: Verteilung von B. burgdorferi s.l.-genospezies in positiven I. ricinus-zecken Baf: B. afzelii, Bbi: B. bissettii, Bss: B. burgdorferi s.s., Bga/Bba: B. garinii/b. bavariensis, Blu: B. lusitaniae, Bsp: B. spielmanii, Bva: B. valaisiana, kgb: Keine Genospezies bestimmbar, N: Anzahl infizierter Zecken Mono- Infektionen N (%) Doppel- Infektionen N (%) Dreifach- und Vierfachinfektionen N (%) Baf 45 (9,4 %) Baf+ Bbi 2 (0,4 %) Baf+ Bga/Bba+ Bsp 1 (0,2 %) Bbi 2 (0,4 %) Baf+ Bga/Bba 7 (1,5 %) Baf+ Bga/Bba+ Bva 3 (0,6 %) Bss 16 (3,4 %) Baf+ Bsp 5 (1,0 %) Baf+ Bga/Bba+ Bbi+ Bss 1 (0,2 %) Bga/Bba 62 (13,0 %) Baf+ Bss 4 (0,8 %) Blu 1 (0,2 %) Baf+ Bva 2 (0,4 %) Bsp 12 (2,5 %) Bga/Bba+ Bbi 1 (0,2 %) Bva 33 (6,9 %) Bga/Bba+Bsp 2 (0,4 %) kgb 269 (56,4 %) Bga/Bba+ Bss 1 (0,2 %) Bga/Bba+ Bva 6 (1,3 %) Bsp+ Bva 1 (0,2 %) Bss+ Bbi 1 (0,2 %)

21 Zusammenfassung der Ergebnisse Koinfektionen mit B. burgdorferi s.l. und Rickettsiales Die Gesamtkoinfektionsrate mit B. burgdorferi s.l. und Rickettsiales war mit 25,8 % (361/1400) signifikant höher als der kalkulierte Erwartungswert von 18,5 %. Von den adulten Zecken waren 19,1 % (27/141) mit Rickettsiales koinfiziert [16/60 Weibchen (26,7 %); 11/80 Männchen (13,6 %)], von den Nymphen 26,5 % (334/1259). Koinfektionen mit B. burgdorferi s.l. und Rickettsia spp. wurden bei 22,9 % (320/1400) der Zecken nachgewiesen. Dieser Prozentsatz setzt sich aus 17,7 % (25/141) infizierter Adulte, unterteilt in 23,3 % (14/60) weibliche und 13,6 % (11/81) männliche Adulte sowie 23,4 % (295/1259) infizierter Nymphen zusammen. B. burgdorferi s.l.- und A. phagocytophilum-koinfektionen wurden bei 1,7 % (24/1400) der Zecken detektiert. Von den adulten Zecken waren 0,7 % (1/141) mit diesen beiden Pathogenen koinfiziert, repräsentiert durch ein infiziertes weibliches Individuum [1,7 % der Weibchen, (1/60)]. Von den Nymphen waren 1,8 % (23/1259) mit A. phagocytophilum koinfiziert. Koinfektionen mit allen drei Pathogenen wurden bei 1,2 % (17/1400) der Zecken ermittelt. Erneut waren adulte Zecken zu einem Prozentsatz von 0,7 % (1/141) koinfiziert, repräsentiert durch eine weibliche Zecke [1,7 % der Weibchen, (1/60)], während 1,3 % der Nymphen (16/1259) positiv auf alle drei Pathogene getestet wurden. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Zeckenstadien und Geschlechtern ermittelt. In Tabelle 3 findet sich eine Übersicht über alle Koinfektionen mit B. burgdorferi s.l. und Rickettsiales in I. ricinus.

22 16 Zusammenfassung der Ergebnisse Tabelle 3: Koinfektionen mit B. burgdorferi s.l. und Rickettsiales in I. ricinus Anzahl B. burgdorferi s.l.- Koinfektion mit Koinfektion mit Koinfektion mit A. Koinfektion mit aller positive Zecken Rickettsiales Rickettsia spp. phagocytophilum Rickettsia spp. und gesammelten Anzahl (%) Anzahl (%) Anzahl (%) Anzahl (%) A. phagocytophilum Zecken Anzahl (%) Adulte (30,0 %) 27 (19,1 %) 25 (17,7 %) 1 (0,7 %) 1 (0,7 %) Männlich (26,0 %) 11 (13,6 %) 11 (13,6 %) 0 (0 %) 0 (0 %) Weiblich (36,7 %) 16 (26,7 %) 14 (23,3 %) 1 (1,7 %) 1 (1,7 %) Nymphen (34,5 %) 334 (26,5 %) 295 (23,4 %) 23 (1,8 %) 16 (1,3 %) Alle Stadien (34,1 %) 361 (25,8 %) 320 (22,9 %) 24 (1,7 %) 17 (1,2 %)

23 Übergreifende Diskussion 17 4 Übergreifende Diskussion Die Schildzecke I. ricinus dient als Vektor für eine Vielzahl von Mikroorganismen, wie Rickettsia spp. und A. phagocytophilum sowie Genospezies des B. burgdorferi s.l.- Komplexes. In Europa variiert die Prävalenz von A. phagocytophilum zwischen 0,3 % in Frankreich und 17,5 % im Westen der Türkei (COTTE et al. 2010; SEN et al. 2011). Aktuellen Studien zufolge liegt die A. phagocytophilum-zeckeninfektionsrate bei 2,3 % in Norwegen (SOLENG u. KJIELLAND 2013), 11,5 % in Schweden (SEVERINSSON et al. 2010), 1,5 % in Frankreich (REIS et al. 2011) und 8,2 % in Italien (AURELI et al. 2012). In Deutschland variieren die vorliegenden A. phagocytophilum-infektionsraten zwischen 0 % in Mitteldeutschland (FRANKE et al. 2010) und 8,7 % in Ostdeutschland (SILAGHI et al. 2012). Die vorliegende Studie, welche in der nordwestdeutschen Stadt Hamburg durchgeführt wurde, resultierte in eine Gesamtinfektionsrate von 3,6 % in den untersuchten Zecken, was mit 3,2 % A. phagocytophilum-infizierten Zecken in der norddeutschen Stadt Hannover (SCHICHT et al. 2011) vergleichbar ist. Interessanterweise waren in der vorliegenden Studie Nymphen tendenziell häufiger infiziert [3,8 % (48/1259)] als Adulte [2,1 % (3/141)]. Dies steht im Widerspruch zur transstadialen Übertragung von A. phagocytophilum in I. ricinus (MACLEOD u. GORDON 1933; TELFORD et al. 1996; OGDEN et al. 1998; OGDEN et al. 2002). Da es bislang keine Anhaltspunkte für eine transovariale Übertragung von A. phagocytophilum in I. ricinus gibt, ist die Blutmahlzeit an kompetenten Erregerwirten sowie die transstadiale Übertragung zur Aufrechterhaltung des Lebenszyklus von A. phagocytophilum notwendig. Demzufolge könnte eine mögliche Erklärung eine niedrigere A. phagocytophilum-infektionsrate der Reservoirwirte im Jahr 2010 sein, die als Wirte für die Nymphen fungierten. Folglich waren die im Jahr 2011 gesammelten Adulten, die sich aus den Nymphen des Vorjahres entwickelt haben, weniger häufig infiziert. Der Prozentsatz von 52,2 % Rickettsia spp.-infizierten I. ricinus-zecken im Stadtgebiet Hamburg stellt die bislang höchste Prävalenz in Deutschland dar. Auch in Hannover sind mit 26,2 % und 33,3 % vergleichsweise hohe Zeckeninfektionsraten beschrieben (SCHICHT et al. 2012; TAPPE u. STRUBE 2013;). Neben verschiedenen biotischen und abiotischen Faktoren, welche die Rickettsia spp.-infektionsrate in Zecken beeinflussen, könnte die Sensitivität der verwendeten qpcr-methode zu den hohen Prävalenzraten in nordwestdeutschen Städten beigetragen haben, da diese bis zu eine Genkopie in der qpcr-reaktion detektiert (SCHICHT et al. 2012). Bei Studien, die in Nordost-, Mittel- und Süddeutschland mittels der konventionellen PCR durchgeführt wurden, lagen die Rickettsia spp.-infektionsraten zwischen 4,1 % und 14,7 % (PICHON et al. 2006; WÖLFEL et al. 2006; SILAGHI et al.

24 18 Übergreifende Diskussion 2008; FRANKE et al. 2010; HILDEBRANDT et al. 2010; FRANKE et al. 2011). Bei der Rickettsia-Speziesidentifizierung mittels der real-time Pyrosequenzierung wurde R. helvetica als alleinige Spezies detektiert. Jedoch war die Sequenzierung nur bei 25,6 % (188/735) aller infizierten Zecken erfolgreich. Obwohl die real-time Pyrosequenzierung sensitiver als die Sanger-Sequenzierung ist, hängt die Sensitivität des Verfahrens von der Anzahl der glta- Genkopien ab (JANECEK et al. 2012). Da bei der Mehrheit der Zecken (601/735 positive Zecken) weniger als 10 2 Kopien per qpcr-reaktion detektiert wurden und nur bei höheren Kopienzahlen ( Genkopien) fast 100% der Proben (132/134; 98,5 %) differenziert wurden, war die niedrige Identifizierungsrate zu erwarten. Die Analyse der Verteilung saisonaler und lokaler Rickettsia spp.-infektionsraten zeigte signifikant niedrigere Prävalenzen bei im Frühjahr gesammelten Zecken im Vergleich zu Sommer und Herbst, während hingegen keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Prozentsatzes Rickettsia spp.-positiver Zecken an den einzelnen Sammelorten nachgewiesen wurden. Im Gegensatz dazu wiesen die A. phagocytophilum-zeckeninfektionsraten keine saisonalen Fluktuationen auf, jedoch variierte die Anzahl infizierter Zecken pro Sammelstelle signifikant. Die niedrigste A. phagocytophilum-prävalenz (0,7 % infizierte Zecken) wurde am Sammelort Schwarzenberg", einer Grünanlage in der Nähe der technischen Universität Hamburg, nachgewiesen, während die höchste Prävalenz am Standort Stadtpark Winterhude" (12,1 %) festgestellt wurde. Dieser Park ist das größte Erholungsgebiet in Hamburg und wird von sämtlichen Bevölkerungsschichten besucht. Saisonale und lokale Unterschiede bezüglich Rickettsiales-Infektionen in innerstädtischen Zecken wurden ebenfalls von anderen Autoren beobachtet (SILAGHI et al. 2008; SCHICHT et al. 2011; SCHORN et al. 2011; TAPPE u. STRUBE 2013) und sind möglicherweise auf verschiedene ökologische Bedingungen wie mikroklimatische Faktoren, Vegetation, Verfügbarkeit von geeigneten Habitaten und Wirten sowie die Zeckendichte zurückzuführen (CHRISTOVA et al. 2003; HILDEBRANDT et al. 2003). Die Prävalenz von B. burgdorferi s.l. in I. ricinus, dem Hauptvektor für Genospezies des B. burgdorferi s.l.-komplexes in Europa, variiert in Süddeutschland zwischen 9,5 % und 36,2 % (FINGERLE et al. 1999; BINGSOHN et al. 2013) und in Mittel- und Norddeutschland zwischen 3,1 % und 24,3 % (STRUBE et al. 2010; FRANKE et al. 2011). In der vorliegenden Studie waren 34,1 % aller Zecken mit B. burgdorferi s.l. infiziert, was die bislang höchste nachgewiesene Prävalenz in Norddeutschland darstellt. Dies könnte, wie bereits erwähnt, mit der Sensitivität der verwendeten PCR zusammenhängen: Generell ist die Sensitivität der Sonden-basierten qpcr der auf interkalierenden Farbstoffen basierenden qpcr sowie der konventionellen PCR

25 Übergreifende Diskussion 19 überlegen. Die in dieser Studie genutzte Sonden-basierte qpcr kann bis zu einer Genkopie pro qpcr-reaktion detektieren (STRUBE et al. 2010). Interessanterweise wurden Nymphen (34,4 %) und Adulte (30,5 %) gleichermaßen häufig positiv getestet. Eine mögliche Erklärung könnte auch hier eine niedrigere B. burgdorferi s.l.-infektionsrate der Reservoirwirte sein, die von Nymphen im Jahr 2010 als Wirte genutzt wurden. Somit wurde im darauffolgenden Jahr bei diesen nun adulten Zecken eine ähnlich hohe Anzahl positiver Individuen ermittelt wie bei den Nymphen. Die Anzahl infizierter Zecken pro Sammelort variierte signifikant zwischen 21,4 % am Standort Schwarzenberg" und 41,4 % am Standort Stadtpark Winterhude" bzw. 43,6 % am Standort Raakmoor". Im Frühjahr war der Prozentsatz der B. burgdorferi s.l.-positiven Zecken mit 13,5 % im April und 25,0 % im Mai signifikant niedriger als im August (42,5 %) und Oktober (48,0 %). Auch in anderen norddeutschen Studien wurden diese räumlichen und zeitlichen Unterschiede bezüglich der Zeckeninfektionen mit pathogenen Mikroorganismen beschrieben (TAPPE u. STRUBE 2013; TAPPE et al. 2014) und könnten ebenfalls aus verschiedenen abiotischen und biotischen Bedingungen wie mikroklimatische Faktoren, Verfügbarkeit geeigneter Reservoirwirte, Zeckendichte, Habitattypen und Vegetation oder aus einer späten erhöhten saisonalen Zeckenaktivität aufgrund höherer Durchschnittstemperaturen während der Sommermonate resultieren. Zum Beispiel beeinflusst die Zeckendichte selbst die lokale Zeckeninfektionsrate, da I. ricinus eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des Lebenszyklus des Bakteriums darstellt (CHRISTOVA et al. 2003), indem die Zecke als Vektor für B. burgdorferi s.l. zwischen den Wirbeltierwirten fungiert. Die am häufigsten identifizierte Genospezies des B. burgdorferi s.l.-komplexes waren B. garinii/b. bavariensis bei etwa 40,0 % der Zecken und B. afzelii bei rund einem Drittel aller identifizierbaren Zeckenproben. Auch in Hannover wurden B. garinii und B. afzelii als die häufigsten Genospezies in I. ricinus beschrieben (STRUBE et al. 2010; TAPPE et al. 2014). Die Sanger-Sequenzierung wurde erfolgreich bei 28 von 84 B. garinii/b. bavariensispositiven Zecken durchgeführt und von diesen konnten fünf als B. bavariensis und 23 als B. garinii identifiziert werden. Da zwei Drittel der B. garinii/b. bavariensis-positiven Proben nicht erfolgreich differenziert werden konnten, wäre die Entwicklung einer RLB-Sonde, die zwischen beiden Genospezies differenziert, wünschenswert. Andere regelmäßig detektierten Genospezies in I. ricinus waren B. valaisiana bei 21,7 %, B. burgdorferi s.s. bei 11,1 %, B. spielmanii bei 6,7 % und B. bissettii bei 3,4 % der identifizierbaren Proben. Diese Verteilung ergibt sich aus der Assoziation der Borrelia-Genospezies mit der Reservoirwirt- Population. So sind B. afzelii, B. bavariensis, B. bissettii und B. spielmanii mit Kleinsäugern

26 20 Übergreifende Diskussion assoziiert während Vögel kompetente Reservoirwirte für B. garinii und B. valaisiana darstellen. B. burgdorferi s.s. kommt sowohl in Vögeln als auch in Kleinsäugern vor. B. lusitaniae, dessen Zyklus durch Eidechsen als Reservoirwirte aufrechterhalten wird, wurde lediglich in einer von 477 positiven Zecken bestimmt. Aus der vorliegenden Borrelia- Genospezies-Verteilung kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass bei der Mehrheit der gesammelten Zecken vermutlich mindestens eine Blutmahlzeit an Vögeln erfolgte. Bei 37 von 477 positiven Zecken wurde eine Infektion mit mindestens zwei Genospezies festgestellt. Die Kombination B. afzelii und B. garinii/b. bavariensis, welche in 12 Zecken gefunden wurde (sieben doppelt-infizierte, vier dreifach-infizierte und eine vierfach-infizierte) und B. garinii/b. bavariensis mit B. valaisiana, die in neun Proben identifiziert wurde (sechs doppelt-infizierte, drei dreifach-infizierte), waren die am häufigsten nachgewiesenen Genospezies-Kombinationen. Zecken könnten multiple Infektionen durch ein sog. co-feeding erlangt haben oder sie könnten sich mit verschiedenen Borrelia-Genospezies durch Blutmahlzeiten, die sie entweder auf verschiedenen Wirten während ihrer Entwicklung oder auf einem multiplen infizierten Wirt zu sich genommen haben, infiziert haben. Insgesamt waren 25,8 % der Borrelia-positiven Zecken mit Rickettsiales koinfiziert. Von diesen waren 1,7 % mit A. phagocytophilum koinfiziert, unterteilt in 0,7 % infizierte Adulte und 1,8 % infizierte Nymphen. Die Koinfektionsrate von Weibchen (1,7 %) und Nymphen (1,8 %) reflektierte ein ähnliches Muster wie die Borrelia burgdorferi s.l.-infektionsrate weiblicher Adulte (36,7 %) und Nymphen (34,5 %). Da keine männliche Zecke mit A. phagocytophilum koinfiziert war, fiel die Koinfektionsrate der Adulten niedriger als erwartet aus. Fast ein Viertel aller untersuchten Proben war mit Rickettsia spp. koinfiziert. Hierbei waren weibliche Adulte (23,3 %) und Nymphen (23,4 %) erneut fast genauso häufig koinfiziert, während die Koinfektionsrate männlicher Zecken zweifach niedriger ausfiel (13,6 %). Insgesamt waren 1,2 % aller Zecken mit B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum und Rickettsia spp. infiziert. Dies ist mit Daten aus dem Stadtgebiet Hannover vergleichbar, wo im Jahr 2005 eine Dreifachkoinfektionsrate von 1,3 % festgestellt wurde (SCHICHT et al. 2012). Hingegen wurden in Hannover im Jahr 2010 alle drei Pathogene bei nur 0,1 % der untersuchten Zecken nachgewiesen (TAPPE et al. 2014). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Zeckeninfektionsrate mit A. phagocytophilum in der norddeutschen Stadt Hamburg mit anderen Daten aus Deutschland vergleichbar ist, wohingegen die Rickettsia spp.-infektionsrate von 52,5 % die bislang höchste ermittelte Prävalenz in Deutschland darstellt. R. helvetica wurde als einzige Rickettsia-Spezies detektiert. Jede dritte Zecke in Hamburg war mit B. burgdorferi s.l. infiziert. Etwa ein Viertel

27 Übergreifende Diskussion 21 aller Borrelia-positiven Zecken waren mit Rickettsia spp. koinfiziert, 1,7 % der Individuen waren mit A. phagocytophilum koinfiziert und 1,2 % der Zeckenproben wurden positiv auf alle drei Pathogene getestet. Diese Resultate tragen dazu bei, die Datenlücke der von Zecken übertragenden Krankheitserregern in Norddeutschland zu schließen. Da die Stadt Hamburg 1,8 Millionen Einwohner besitzt und jährlich Millionen von Touristen anzieht, sollte das potentielle Gesundheitsrisiko von durch Zecken übertragenen Pathogenen im Stadtgebiet Hamburgs nicht unterschätzt werden.

28 22 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Kathrin May (2015) Prävalenz von Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum und Rickettsia spp. in Zecken aus dem Stadtgebiet Hamburg Die Schildzecke Ixodes ricinus stellt einen Vektor für diverse Mikroorganismen von human- und veterinärmedizinischer Bedeutung dar. Bislang sind Studien über das Vorkommen von durch Zecken übertragenen Krankheitserregern in urbanen Gebieten Norddeutschlands nur aus Hannover verfügbar. Somit war das Ziel der vorliegenden Arbeit, erste Informationen über die Prävalenz von A. phagocytophilum, Rickettsia spp. und B. burgdorferi s.l. in aus Hamburg stammenden Zecken zu erhalten. Daher wurden 1400 I. ricinus-zecken mittels der Flaggmethode an zehn verschiedenen innerstädtischen Grünanlagen von April bis Oktober 2011 gesammelt und mittels Sonden-basierter quantitativer real-time PCR (qpcr) untersucht. Insgesamt wurden 3,6 % der Individuen positiv auf A. phagocytophilum getestet, unterteilt in 2,1 % adulte Zecken (1,7 % Weibchen und 2,5% Männchen) und 3,8 % Nymphen. Die lokale Zeckeninfektionsrate variierte statistisch signifikant zwischen 0,7 % und 12,1 %. Rickettsia spp. wurden in 52,2 % der Proben detektiert. Die Rickettsia spp.-infektionsrate der Adulten lag bei 56,0 % (weibliche positive: 61,7 %, männliche positive: 51,9 %), während 52,1 % der Nymphen infiziert waren. R. helvetica wurde als einzige Rickettsia-Spezies nachgewiesen. Der Prozentsatz Rickettsia spp.-infizierter Zecken war im April (36,5 %) und Mai (29,5 %) signifikant niedriger als in den Sommer- und Herbstmonaten (55,0-64,5 %). B. burgdorferi s.l. war bei 34,1 % aller Proben prävalent. 36,7 % weibliche und 26,0 % männliche Zecken waren infiziert, was in einer Gesamtinfektionsrate von 30,0 % bei adulten Zecken resultierte. Des Weiteren wurde bei 34,5 % der Nymphen B. burgdorferi s.l. nachgewiesen. Es wurden signifikante Unterschiede zwischen lokalen und saisonalen Zeckeninfektionsraten detektiert. Bei 43,6 % der Borrelia-positiven Zecken konnte eine Genospezies-Identifizierung erfolgreich durchgeführt werden. Bei 40,4 % aller differenzierbaren Proben wurde B. garinii/b. bavariensis, bei 33,7 % B. afzelii und bei 21,6 % B. valaisiana identifiziert. B. burgdorferi sensu stricto wurde bei 11,5 %, B. spielmanii bei 6,7 %, B. bissettii bei 3,4 % und B. lusitaniae bei 0,5 % aller identifizierbarer Proben nachgewiesen. Koinfektionen mit B. burgdorferi s.l. und Rickettsiales wurden bei 361 von 1400 Individuen festgestellt. Von diesen waren 22,9 % mit Rickettsia spp. koinfiziert, Koinfektionen mit A. phagocytophilum waren in 1,7 % der Proben prävalent und 1,2 % der Zecken waren mit allen drei Pathogenen infiziert.

29 Zusammenfassung 23 Diese Ergebnisse liefern ergänzende Daten über durch Zecken übertragene Pathogene in Norddeutschland. Da die Stadt Hamburg 1,8 Millionen Einwohner besitzt und jedes Jahr Millionen von Touristen anzieht, sollte das potentielle Gesundheitsrisiko für Besucher öffentlicher Grünanlagen nicht unterschätzt werden.

30 24 Summary 6 Summary Kathrin May (2015) Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum and Rickettsia spp. in hard ticks in the city of Hamburg The castor bean tick Ixodes ricinus serves as a vector for multiple microorganisms of human and veterinary importance. So far, studies on occurrence of tick-borne pathogens in urban Northern Germany were only available for the city of Hanover. Therefore, the aim of the present study was to gain first information on the prevalence of A. phagocytophilum, Rickettsia spp. and B. burgdorferi sensu lato (s.l.) in ticks originating from the Free and Hanseatic city of Hamburg. A total of 1,400 questing I. ricinus ticks was collected by the flagging-method at ten different inner-city public green areas from April until October 2011 and examined using probe-based quantitative real-time PCR (qpcr). A total of 3.6% individuals were tested positive for A. phagocytophilum, divided into 2.1% adults (1.7% females and 2.5% males) and 3.8% nymphs. Local tick infection rates varied significantly between 0.7% and 12.1%. Rickettsia spp. was detected in 52.5% of all samples. In adult ticks, Rickettsia spp. infection rate was 56.0% (61.7% positive females and 51.9% positive males), whereas 52.1% nymphs were infected. R. helvetica was the only Rickettsia species identified. The percentage of Rickettsia spp.-infected ticks was significantly lower in April (36.5%) and May (29.5%) compared to the summer and fall months ( %). B. burgdorferi s.l. was prevalent in 34.1% of all samples. A percentage of 36.7% females and 26.0% males were infected, resulting in a total adult infection rate of 30.0%. Nymph infection rate with with B. burgdorferi s.l. was 34.5%. Significant differences in spatial and seasonal tick infection rates were observed. Borrelia genospecies identification was successful in 43.6% of B. burgdorferi s.l.-positive ticks. Out of all differentiable samples, 40.4% were identified as B. garinii/b. bavariensis, 33.7% as B. afzelii and 21.6% as B. valaisiana. B. burgdorferi sensu stricto was determined in 11.5%, B. spielmanii in 6.7%, B. bissettii in 3.4% and B. lusitaniae in 0.5% of all identifiable samples. Coinfections with B. burgdorferi s.l. and Rickettsiales were found in 361 out of 1,400 individuals. In detail, 22.9% were coinfected with Rickettsia spp., 1.7% with A. phagocytophilum and 1.2% of ticks contained all three pathogens. These results contribute to closing the gap of missing knowledge on tick-borne pathogens in Northern Germany. As the city of Hamburg has 1.8 million inhabitants and attracts millions

31 Summary 25 of tourists every year, the potential health risk for visitors of recreation areas should not be underestimated.

32 26 Literaturverzeichnis 7 Literaturverzeichnis AURELI, S., J. E. FOLEY, R. GALUPPI, D. REJMANEK, C. BONOLI u. M. P. TAMPIERI (2012): Anaplasma phagocytophilum in ticks from parks in the Emilia-Romagna region of northern Italy. Vet. Ital. 48, BAUMANN D., N. PUSTERLA, O. PETER, F. GRIMM, P. E. FOURNIER, G. SCHAR, W. BOSSART, H. LUTZ u. R. WEBER (2003): Fever after a tick bite: clinical manifestations and diagnosis of acute tick bite-associated infections in northeastern Switzerland. Dtsch. Med. Wochenschr. 128, BINGSOHN, L, A. BECKERT, R. ZEHNER, U. KUCH, R. OEHME, P. KRAICZY u. J. AMENDT (2013): Prevalences of tick-borne encephalitis virus and Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus populations of the Rhine-Main region, Germany. Ticks Tick Borne Dis. 4, CHRISTOVA I., J. VAN DE POL, S. YAZAR, E. VELO u. L. SCHOULS (2003): Identification of Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma and Ehrlichia species, and spotted fever group Rickettsiae in ticks from Southeastern Europe. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 22, COTTE, V., S. BONNET, M. COTE u. M. VAYSSIER-TAUSSAT (2010): Prevalence of five pathogenic agents in questing Ixodes ricinus ticks from western France. Vector Borne Zoonotic Dis. 10, CROWDER, C. D., H. E. CAROLAN, M. A. ROUNDS, V. HONIG, B. MOTHES, H. HAAG, O. NOLTE, B. J. LUFT, L. GRUBHOFFER, D. J. ECKER, S. E. SCHUTZER u. M. W. ESHOO (2014): Prevalence of Borrelia miyamotoi in Ixodes ticks in Europe and the United States. Emerg. Infect. Dis. 20,

33 Literaturverzeichnis 27 DOBLER, G. u. R. WÖLFEL (2009): Typhus and other rickettsioses: emerging infections in Germany. Dtsch. Arztebl. Int. 106, FINGERLE, V., U. G. MUNDERLOH, G. LIEGL u. B. WILSKE (1999): Coexistence of ehrlichiae of the phagocytophila group with Borrelia burgdorferi in Ixodes ricinus from Southern Germany. Med. Microbiol. Immunol. 188, FORNIER, P. E., F. GRUNNENBERGER, B. JAULAC, G. GASTINGER u. D. RAOULT (2000): Evidence of Rickettsia helvetica infection in humans, eastern France. Emerg. Infect. Dis. 6, FRANKE, J., J. FRITZSCH, H. TOMASO, E. STRAUBE, W. DORN u. A. HILDEBRANDT (2010): Coexistence of pathogens in host-seeking and feeding ticks within a single natural habitat in Central Germany. Appl. Environ. Microbiol. 76, FRANKE, J., A. HILDEBRANDT, F. MEIER, E. STRAUBE u. W. DORN (2011): Prevalence of Lyme disease agents and several emerging pathogens in questing ticks from the German Baltic coast. J. Med. Entomol. 48, GHERA P., Y. KASIRYE, M. W. CHOUDHRY, G. R. SHAW u. V. S. EJERCITO (2011): Acute transient sensorineural hearing loss due to Anaplasma phagocytophilum. WMJ 110, GRAY, J. S., H. DAUTEL, A. ESTRADA-PENA, O. KAHL u. E. LINDGREN (2009): Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdiscip. Perspect. Infect. Dis.,