4.2 DNA und Chromatin DNA-Struktur Die DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist eine Doppelstrangstruktur,

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1 4.2 DNA und Chromatin DNA-Struktur Die DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist eine Doppelstrangstruktur, die aus zwei antiparallel verlaufenden Einzelsträngen, die jeweils aus sehr vielen, kovalent miteinander verknüpften Nukleotiden bestehen, aufgebaut ist. Ein Nukleotid besteht aus der Desoxyribose, an die über die N-glykosidische Bindung eine von vier möglichen aromatischen Basen, Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin, geknüpft ist. Über Phosphodiesterbrücken sind die 5 - und die 3 -Positionen der Desoxyribosen zu langen Strängen verbunden. Die beiden Einzelstränge werden über die komplementäre Basenpaarung der sich jeweils gegenüber stehenden Nukleotide in einem Doppelstrang zusammengehalten. Dabei passen jeweils Guanosin und Cytidin sowie Adenosin und Thymidin optimal zueinander. Andere Paare von Basen können zwar auch einzelne Wasserstoffbrücken ausbilden, dazu sind aber Verschiebungen und Deformationen des Zuckerphosphatrückgrats der Einzelstränge notwendig, die die Gesamtstruktur stören. Deshalb sind Doppelstränge mit Basenfehlpaarungen weniger stabil. Abb. 3: DNA-Struktur Der DNA-Doppelstrang ist zu einer rechtsgängigen Helix verdrillt. Dadurch können die flachen Ringstrukturen der Basenpaare direkt aufeinander liegen und miteinander Stapelwechselwirkungen eingehen. Diese Anziehungskräfte aufgrund statischer und flukturierender gegensinniger Ladungen in den π-elektronensystemen der aromatischen Basen tragen den Hauptbeitrag zur Stabilisierung - 1 -

2 eines DNA-Doppelstrangs bei. Die resultierende B-DNA wendet die stark negativ geladenen Zuckerphosphatrückgrate der beiden Einzelstränge nach außen dem Wasser zu. Zwischen ihnen bilden sich eine große und eine kleine Furche aus, in denen Proteine Kontakt zu den Basen aufnehmen können. So sind sequenzspezifische, also nur mit einer definierten Abfolge von Basen realisierbare, Wechselwirkungen möglich, während die Zuckerphosphatrückgrate Kontaktpunkte für sequenzunabhängige Wechselwirkungen bieten. Chromatin Nach den letzten Ergebnissen der Sequenzierungen des menschlichen Genoms umfasst der haploide Chromosomensatz 3,1 Milliarden Basenpaare. Das ergibt linear ausgezogen einen DNA-Doppelstrang von gut einem Meter Länge. Die DNA eines durchschnittlichen Chromosoms ist also 1/23 = 4,6 cm lang. Da ein Zellkern nur einen Durchmesser von 5 µm hat, muss ein solches DNA-Molekül um einen Faktor von ungefähr verkürzt werden. Dabei muss weiterhin auf Funktionsfähigkeit und Zugänglichkeit geachtet werden, es wird also eine geordnete Kondensation der DNA benötigt, die auch ihrer stark negativen Ladung Rechnung trägt. Abb. 4: Schematische Darstellung der Histonmoleküle in den stabilen Komplexen eines Tetramers aus H3 und H4, das zuerst an die DNA gelagert wird, und eines Dimers aus H2A und H2B, von dem anschließend zwei an den Tetramer-DNA-Komplex angelagert werden. K und R stehen für die positiv geladenen Lysin- und Argininreste in den Armen. In der Evolution haben sich dafür die Histone entwickelt (Abb. 4). Dies sind kleine basische Proteine, bei denen die positiven Überschussladungen in N- und C-terminalen, weitgehend unstrukturierten Armbereichen liegen. Diese Arme sind für eine dichte Verpackung unter - 2 -

3 Neutralisation der negativen Ladungen der gebundenen DNA verantwortlich. Die globulären zentralen Anteile der Histone sind ähnlich strukturiert und fördern das Aneinanderlagern von letztendlich 8 Histonmolekülen (je zweimal H2A, H2B, H3 und H4) zu einem Nukleosomcore, das in der Form einem Eishockeypuck ähnelt. In der niedrigsten Verpackungseinheit, dem Nukleosom (10 nm Durchmesser), sind 145 Basenpaare DNA in 1 2/3 Windungen um dieses Core gewunden. Das letzte Drittel Windung wird durch das außen angelagerte Histon H1 stabilisiert, das auch eine weitere Kondensation der Nukleosomen zu einer 30 nm dicken, helikalen Faser stabilisiert (Abb. 5). Ungefähr alle bis Basenpaare liegen Anheftungssequenzen für bisher eher schlecht charakterisierte Matrixproteine. Sie organisieren so die DNA in Schleifen, von denen man annimmt, dass sie unabhängig voneinander reguliert werden können. Diese Schleifen sind wahrscheinlich ringförmig um die Matrix angeordnet. So ergibt sich ein weiterer Kondensationsfaktor von ungefähr 10 bis 20. Eine so enge Verpackung, wie wir sie in Abb. 5: Verschiedene Stufen der Kondensation der DNA durch die Chromatinstruktur den im Lichtmikroskop sichtbaren Chromosomen während der Zellteilung vorfinden, ist natürlich weitgehend transkriptionsinaktiv. Allerdings ist sie nicht vollständig gleichförmig, wie das typische Bandenmuster mit unterschiedlichen Färbemethoden zeigt (Abb. 6). Anhand dieses Musters können Chromosomen identifiziert werden (Cytogenetik). Es liefert auch Anhaltspunkte für Chromosomenaberrationen, wenn große Bereiche von Chromosomen deletiert oder auf andere Chromosomen übertragen worden sind

4 Prinzipiell muss diese Verpackung in der Chromatinstruktur in den Bereichen gelockert werden, in denen transkribiert werden soll. Dazu sind Bindungsstellen im Promotorbereich eines Genes für Transkriptionsfaktoren notwendig, die zugängig bleiben, weil sie zum Beispiel an der Oberfläche eines Nukleosoms nach außen Abb. 6: Metaphasechromosomen von einem Mann nach weisen. Der Transkriptionsfaktor bindet dann weitere Proteine unter denen Histonacetyltransferasen sind (Abb. 7). Giemsa-Färbung. Diese acetylieren Lysinreste in den Armen der Histone. Ein Acetyl-Lysinrest ist nicht mehr positiv geladen sondern neutral. Die starke Wechselwirkung mit der DNA wird deshalb gelockert und damit wird auch die enge Verpackung in der 30nm-Faser unmöglich. Parallel dazu dissoziiert H1 ab. In diesem aufgelockerten Chromatin können Nukleasen leichter die DNA angreifen. Es entstehen so DNAse sensitive Bereiche (Die Behandlung des Chromatins mit Nukleasen ist eine klassische Untersuchungsmethode, die transkriptionsaktive Bereiche aus dem Chromatin herauslöst). Hier können weitere Transkriptionsfaktoren binden und Chromatin-Remodeling Komplexe heranführen, die durch das Verschieben noch vorhandener Nukleosomen wei- Abb. 7: Veränderungen der Chromatinstruktur durch Acetylierung und Deacetylierung von Histonen

5 tere Bindungsstellen auf der DNA freimachen können. Die DNA wird dadurch hypersensitiv für Nukleasen und der Promotorbereich von Genen wird zugänglich. Die gebundenen Transkriptionsfaktoren haben in der Regel auch eine hohe Affinität für RNA-Polymerasen, deren Bindung an den Promotor und deren Bereitschaft, mit der Transkription zu beginnen, gesteigert werden können. Die entsprechende Genaktivität steigt. Prinzipiell kann die Lockerung des Chromatins rückgängig gemacht werden, indem über Transkriptionsfaktoren, die zum Teil die gleichen Sequenzen im Promotorbereich binden wie die Genaktivatoren, die RNA-Polymerase inaktiviert wird und Histondeacetylasen herangelockt werden. Die Chromatinstruktur wird stabilisiert und der Genbereich wieder fester verpackt. Eine noch festere Verpackung, bei der auch einzelne Bindungssequenzen für Transkriptionsfaktoren nicht mehr zugänglich sind, kann Bereiche der Chromosomen in Abhängigkeit von der Zellart auch dauerhaft verpacken. Dabei wird diskutiert, ob solche Bereiche durch ihre Lokalisation an der Kernlamina in dem verpackten, transkriptionsinaktiven Zustand gehalten werden. Nachweis von DNA-Sequenzen Die DNA ist Träger der Erbinformation. Diese liegt in der Abfolge der Nukleotide (und damit der Basen), die in der 5 3 -Richtung gelesen wird. So wird sowohl bei der Replikation ein neuer DNA-Einzelstrang als auch bei der Transkription ein RNA-Einzelstrang synthetisiert. In beiden Fällen wird durch eine Polymerase der gegenüber liegende DNA-Einzelstrang als Vorlage genommen und das passende Nukleotid eingebaut. Die Ablesung der Erbinformation erfolgt also ausschließlich durch korrekte Basenpaarung. Dieses Prinzip der Komplementarität kann man sich auch experimentell nutzbar machen. So kann mit einem kurzen DNA-Einzelstrang als Sonde eine DNA mit entsprechender komplementärer Sequenz identifiziert werden. Dazu muss natürlich die Doppelhelixstruktur aufgebrochen werden. Um dies experimentell umzusetzen, kann man entweder die Lösung stark alkalisch machen oder die Temperatur deutlich erhöhen, wobei jeweils die beiden Einzelstränge auseinander fallen. Je länger der doppelsträngige Bereich ist, umso stabiler ist er und umso höher ist die Denaturierungstemperatur. Nach dem Neutralisieren oder dem Abkühlen der Lösung finden sich komplementäre Einzelstränge spontan wieder zu Doppelsträngen zusammen. Man nennt diesen Vorgang Hybridisieren. Dazu muss nur ein kurzer passender Anfangsbereich gefunden werden, von dem aus der Doppelstrang wie bei einem Reißverschluss wieder geschlossen werden kann. Das Finden des ersten Anfangsbereiches ist natürlich von der Konzentration der beteiligten Einzelstränge abhängig. Je höher die Konzentration desto größer die Wahrscheinlichkeit, dass zwei passende Sequenzen einander treffen. So kann - 5 -

6 auch eine kürzere Sonde, die einen nicht so stabilen Doppelstrang ergibt, an einen Einzelstrang gebunden werden, obwohl der lange komplementäre Gegenstrang mit ihr konkurriert, wenn sie in höherer Konzentration vorliegt. Es gibt verschiedene experimentelle Anordnungen, in denen die Hybridisierung zur Identifikation von Nukleinsäuresequenzen genutzt wird. 1. Der Southernblot: Hierbei wird die zu untersuchende DNA durch sequenzspezifische Endonukleasen (Restriktionsendonukleasen, siehe Vortrag zu 4.3) in definierte Fragmente zerlegt. Das können bei großen Genomen, die auf das Vorkommen einer Sequenz hin untersucht werden sollen, Millionen verschiedener Fragmente sein. Diese unterscheiden sich in ihrer Größe. Deshalb trennt man sie in einer Gelelektrophorese nach ihrer Größe auf, denaturiert sie alkalisch und fixiert sie dann anschließend auf einer Membran. Dieser Vorgang wird als Blotten bezeichnet und konserviert die Trennung auch in den darauf folgenden Waschschritten. Eine Sonde, die so markiert ist, dass sie einfach und empfindlich nachgewiesen werden kann, wird dann hinzugegeben, sodass sie mit einem Fragment mit komplementärer Sequenz hybridisieren kann. Dabei wird die Temperatur so eingestellt, dass nur eine vollständige Komplementarität über die volle Sondenlänge zu einer stabilen Bindung führt. Alle überschüssigen Sondenmoleküle werden abgewaschen. So kann die Position und damit die Größe des Fragmentes bestimmt werden, dass die Abb. 8: Ablauf eines Southernblots komplentäre Sequenz aufweist. Verschiedene Restriktionsenzyme führen zu unterschiedlich großen Fragmenten mit dieser Sequenz. Verschiedene Sonden färben unterschiedliche Sequenzen und weisen damit unterschiedliche Genabschnitte nach. Die Kombination von Restriktionsenzym und Sonde entscheidet also über das Ergebnis des Southernblots. Es geht bei diesen Nachweisreaktionen nicht so sehr um die Fragestellung, ob ein Gen überhaupt im Genom vorhanden ist, sondern eher darum, ob ein bestimmtes Allel zum Beispiel mit einem für eine Erbkrankheit verantwortlichen mutierten Gen im Genom vor

7 kommt. Gerade in früheren Jahren war dabei weder die eigentliche Gensequenz noch die Position der zur Sonde komplementären Sequenz bekannt. Es reichen für eine Diagnose statistische Aussagen aus, die eine bestimmte Bandenposition im Southernblot mit dem Auftreten der Erbkrankheit verknüpfen. Oftmals war dabei die Sondenposition noch Millionen Basenpaare vom mutierten Gen entfernt. Das ist in Bezug auf die langsame Veränderung unseres Genoms immer noch nah, sodass eine Trennung der Sondenposition vom Gen durch ein Rekombinationsereignis während der Meiose sehr selten ist. 2. Der Northernblot: Das experimentelle Vorgehen ist sehr ähnlich dem Southernblot. Allerdings geht man von der RNA einer Zelle aus. Da die verschiedenen mrnas unterschiedliche Länge haben, braucht man keine Spaltung mit Endonukleasen vornehmen, sondern kann die isolierte RNA direkt in einer Gelelektrophorese nach Größe auftrennen. Die Sonde weist somit das Auftreten und auch die Menge an mrna mit der getesteten Sequenz nach und erlaubt so Aussagen über das Ausmaß der Transkription eines Gens in einer Zellart. 3. Der Mikroarray: In den neuerdings angewandten Mikroarrays dreht man die Verhältnisse quasi um. Die Sonden werden auf einer Glas- oder Polymeroberfläche immobilisiert, sodass an einem gegebenen Punkt eine bekannte Sequenz angeboten wird. Dazu können Oligonukleotide direkt an der Oberfläche synthetisiert oder auch längere Sonden nachträglich kovalent gebunden werden Gene in Hefezellen, die mit Glucose (grün) oder mit Abb. 9: Mikroarray zum Vergleich der Transkription aller Die zu probenden DNAs Galactose (rot) als Kohlenstoffquelle angezogen wurden. oder RNAs werden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und auf dem Mikroarray hybridisiert. Bleibt nach dem Waschen Fluoreszenz an einem Punkt detektierbar, so war in dem angebotenen Gemisch die komplementäre Sequenz vorhanden. Der Vorteil der Mikroar

8 rays liegt vor allem darin, dass viele Sonden nebeneinander angeboten werden, so dass eine Vielzahl von Informationen aus einem Hybridisierungsexperiment gewonnen werden können. Ihre Schwierigkeit liegt in der Standardisierung, da schon kleine Unterschiede in der Probenvorbereitung und den Hybridisierungsbedingungen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Dies kann zum Teil dadurch umgangen werden, dass nach Markierung mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen zwei Proben in direkter Konkurrenz angeboten werden. So können graduelle Unterschiede zum Beispiel in der Transkriptionsstärke eines Gens direkt abgelesen werden. Grundlegende Literatur Löffler, Basiswissen Biochemie, 7. Auflage S Löffler Petrides Heinrich, Biochemie & Pathobiochemie, 8. Auflage S , , 250, Rassow Hauser Netzker Deutzmann, Biochemie, 3. Auflage S , , Themen, die im Vortrag angesprochen werden sollten: Struktur der DNA Nukleotide Einzelstränge Antiparallelität Komplementarität Strukturen der Histone Struktur der Nukleosomen Funktionen des Chromatins Hierarchische Organisation der Verpackung der Chromosomen Histonacetylierung Chromatin Remodeling Histondeacetylierung DNA-Hybridisierung DNA Denaturierung Renaturierung Sequenzidentifikationen durch Hybridisierung Southern-Blotting Sonden Northern-Blotting Mikroarrays Anwendungen - 8 -