Grundlagen der Zellulären Biochemie

Transkript

1 Grundlagen der Zellulären Biochemie DNA und Chromatin Vorlesung zum Modul BCB P07 im Bachelor-Studiengang Biochemie Hannover Prof. J. Alves, Institut für Biophysikalische Chemie, MHH

2 Zeittafel der relevanten Entdeckungen zur DNA 1869 entdeckt Friedrich Miescher eine saure Substanz in Zellkernen, die er Nuclein nannte. Später fand er, dass sie aus Protein und einer zweiten Komponente bestand, der Nukleinsäure findet Frederick Griffith eine Substanz in hitzedenaturierten Bakterien, die lebende Bakterien weitervererbbar verändert, und nennt das Phänomen Transformation identifizieren Oswald Avery, Colin MacLeod und Maclyn McCarty die Desoxyribonukleinsäure (DNA) als das transformierende Prinzip von Griffith bestimmt Erwin Chargaff die Basenzusammensetzung der DNA verschiedener Spezies. Das Verhältnis von Adenin zu Thymin und Guanin zu Cytosin ist immer nahe 1, während alle anderen Verhältnisse sehr unterschiedlich sein können finden Al Hershey und Martha Chase, dass die DNA aber kaum Protein eines Virus in Bakterienzellen eindringt und von den Virusnachkommen isoliert werden kann interpretieren James Watson und Francis Crick die Röntgenbeugungsmuster der B-DNA von Rosalind Franklin.

3 Röntgenaufnahmen der DNA A-Form Maurice Wilkins B-Form Rosalind Franklin

4 RNA Chemische Struktur der Nukleinsäuren DNA Adenin N-glykosidische Bindung Thymin Cytosin Guanin Phosphodiester Guanin Base + Zucker = Nukleosid Cytosin Unterschied Uracil - Thymin Unterschied Ribose - Desoxyribose Uracil Nukleosid + Phosphat = Nukleotid Adenin In den Nukleinsäuren sind die Nukleotide über ihre 5 - und 3 -OH-Gruppen am Zucker durch Phosphodiester zu langen Einzelsträngen verknüpft. Dies bedingt auch die Leserichtung in einem Einzelstrang (hier von oben nach unten).

5 T A Watson-Crick- Basenpaarung Die originäre Leistung von James Watson und Francis Crick war, die Struktur der Basenpaare zu entdecken und sie innen in die gleichförmige DNA-Helix einzupassen. C G Diese Basenpaarung führt dazu, dass die Geometrie der Basenpaare in der DNA unabhängig von der Sequenz ist.

6 Originalmodell der DNA von Watson und Crick Der Aufbau von molekularen Modellen war essentiell für das Verständnis der Struktur der DNA.

7 Nature 171, 737 (1953)

8 Verschiedene Formen der DNA-Doppelhelix B-DNA A-DNA Z-DNA Animation

9 Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in Blotting-Verfahren Denaturieren mit NaOH, Blotten auf dünne Folie Southern Blotting = Nachweis von DNA-Fragmenten Northern Blotting = Nachweis von mrnas Hybridisieren mit markierter Sonde Herauswaschen der ungebundenen Sondenmoleküle, Färbung Die Fixierung der Nukleinsäuren auf einer dünnen Folie erlaubt die Hybridisierung mit geeigneten DNA-Sonden und ein Herauswaschen ungebundener Sonden, ohne die Position nach der Elektrophorese zu verändern. Die Position entspricht der Größe der detektierten Nukleinsäure.

10 Transkriptomanalyse mit Microarrays Die Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten cdnas mit vielen kurzen Sonden eindeutiger Sequenz erlaubt die Identifizierung gerade exprimierter Gene (oft auch im Vergleich z. B. gesund - krank).

11 Proteomanalyse 2. Größe ( SDS-PAGE) Die in einer Zelle vorhandenen Proteine lassen sich in einer zweidimensionalen Gelelektrophorese auftrennen und anschließend identifizieren. 1. Ladung (Isoelektrische Fokussierung) Nach einem Blot auf eine PVDF(Polyvinylidenfluorid)-Membran können einzelne Flecken ausgestanzt und in der Massenspektroskopie einem Protein zugeordnet werden.

12 Der menschliche Protein-Atlas Fagerberg et al. J. Proteome Res., 2013, 12 (6), pp We estimate that there is good evidence for protein existence for 69% (n = 13985) of the human protein-coding genes, while 23% have only evidence on the RNA level and 7% still lack experimental evidence. Analysis of the expression patterns shows few tissue-specific proteins and approximately half of the genes expressed in all the analyzed cells. In Schweden wurde begonnen, für alle menschlichen Gene die dort kodierten Proteine nachzuweisen. Dazu wurden Antikörper gegen Signatursequenzen der Proteine hergestellt und mit ihnen Normalund Tumorgewebe und auch Zelllinien über Immunfluoreszenz auf das Vorhandensein der Proteine getestet. Außerdem wurde das Transkriptom durch mrna-sequenzierung ermittelt. Hier zeigt sich auch, welche Spleißvariante des Gens exprimiert ist. Auf der Webseite kann man für jedes Gen detaillierte Informationen und Bilder seiner Expression ansehen.

13 Human Genome Project Das ursprünglich sequenzierte Referenzgenom ist aus Primärproben gemischt von anonymen Donatoren aus vielen ethnischen Gruppen. Inzwischen gibt es neben einigen veröffentlichten Sequenzen definierter Individuen (Greg Venter und James Watson) das 1000 Genome Projekt, das großen Aufschluss über die Variabilität unseres Genoms gibt. Ende 2013 wurde die letzte Version (38) der Sequenz des menschlichen Genoms in Datenbanken aufgenommen. Sie enthält 99% der genkodierenden Bereiche und nur noch 349 kleine Lücken. Die Sequenz ist zu 99,999% genau. Das humane Genom enthält ca. 3.2 Milliarden Nukleotide. Ein durchschnittliches Gen enthält 3000 Nukleotide. Es gibt aber beträchtliche Varianz: das größte bekannte menschliche Gen, das Dystrophingen, enthält 2.2 Millionen, das kleinste für Histon H1 nur 781 Nukleotide. Die Anordnung fast aller Nukleotide (99.9%) ist bei allen Personen exakt gleich. Die Gesamtzahl der Gene liegt jetzt bei gut 22,000, wovon gut 2000 vorhergesagt und noch nicht strikt nachgewiesen sind. Dies ist viel weniger als frühere Hochrechnungen von 80,000 bis 140,000 vermuten ließen. Die Annotation der Sequenzen, d. h. die Zuordnung zu funktionellen Bereichen, geht aber immer noch weiter.

14 Spreu und Weizen Weniger als 2% des Genoms kodiert Proteine. Repetitive Sequenzen die keine Proteine kodieren ("junk DNA") machen mindestens 50% des Genoms aus. Viele der repetitiven Sequenzen haben (noch?) keine direkten Funktionen. Chromosomenstruktur und Dynamik: Im Laufe der Evolution haben diese repetitiven Sequenzen das Genom umstrukturiert, wobei völlig neue Gene entstanden oder bestehende Gene verändert oder neu verteilt wurden.

15 Sequenzierung großer Genome Tiere: 68 Stand: Bos taurus (Rind) Branchiostoma floridae (Lanzettfischchen) Homo sapiens (Mensch, viele individuelle Genome) Canis familiaris (Hund) Ciona intestinales (Seescheide) Danio rerio (Zebrafisch) Equus caballus (Pferd) Gallus gallus (Huhn) Macac mulatta (Rhesusaffe) Monodelphis domestica (Beutelratte) Mus musculus (Maus) Nematoden 6 ssp (Fadenwürmer) Nematostella vectensis (Seeanemone) Ornythohynchos anatinus (Schnabeltier) Pan troglodytes (Schimpanse) Rattus norvegicus (Ratte) Sus scrofa (Schwein) Tetraodon 2ssp (Kugelfische) Trichoplax adhaerens (Scheibentier) Insekten: 55 Aedes aegypti (Gelbfiebermücke) Anopheles gambiae (Stechmücke) Apis mellifera (Honigbiene) Bombyx mori (Seidenspinner) Drosophila 10 ssp (Fruchtfliege) Modellorganismen Tribolium castaneum (Mehlkäfer) Pflanzen: 39 Einzeller: 30 Spezies 32 Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) Pilze und Hefen: 32 Spezies 53 Oryza sativa 3 ssp (Reis) Physcomitrella patens (Kleines Blasenmützenmoos) Bakterien: 884 Spezies Populus trichocarpa (Pappel) Sorghum bicolor (Mohrenhirse) Archaea: 65 Spezies 289 Vitis vinifera 2 ssp (Weinrebe) Stand: März 2015 ( J. Watson

16 Homologe Gene im Genomvergleich Das Auffinden von Genen in den Genomsequenzen und die Zuordnung der Gene zu einer Funktion wird durch den Vergleich mit anderen Genomen erleichtert. Gene mit homologen Sequenzen und ähnlicher Funktion in verschiedenen Arten nennt man orthologe Gene. Solche Gene in einer Art nennt man paraloge Gene. Xenologe Gene sind durch horizontalen Gentransfer entstanden, der aber hauptsächlich bei Bakterien eine Rolle spielt. In der Genetik werden Phänotypen (Erbkrankheit) einem Genort zugeordnet und so das ursächliche Gen gefunden. Mensch Huhn Kugelfisch In der Reversen Genetik schaltet man orthologe Gene in Modellorganismen aus, um ihre Funktion zu untersuchen.

17 Möglichkeiten für direkte Kontakte zu den Basen in der DNA Große Furche: eindeutige Identifizierung der einzelnen Basenpaare möglich Kleine Furche: nur Unterscheidung von AT gegenüber GC-Basenpaare Wasserstoffdonator Wasserstoffakzeptor Hydrophobe Gruppe

18 -Helices und DNA A perfect fit! Ein häufiges Merkmal DNA-bindender Proteine sind -helikale Abschnitte, die direkt in die große Furche der B-DNA passen. Dimensionen: Der Durchmesser der -Helix beträgt 1.2 nm. Die große Furche der DNA ist etwa 1.2 nm breit und 0.6 bis 0.8 nm tief. Von der -Helix aus können sequenzspezifische Kontakte zu den Basen der DNA ausgebildet werden. Zur eindeutigen Unterscheidung der vier möglichen Basenpaare an einer Position gegenüber der -Helix reichen zwei Kontakte zu einem Basenpaar in der großen Furche aus. Die Abfolge der Kontakte definiert dann eindeutig die DNA-Sequenz. In der kleinen Furche kann nur zwischen AT- und GC-Basenpaaren unterschieden werden.

19 Sequenzspezifische Kontakte zu Basen in der DNA Beispiele für Interaktionen von Aminosäuren mit Basen in der großen Furche. T A C G Glutamin Arginin Glutamin und Arginin sind durch zwei Kontakte zu einem Purin in der Lage, ein Basenpaar eindeutig zu erkennen.

20 Chromatinstruktur Chromatin ist das durch basische Farbstoffe anfärbbare Material im Zellkern. Es besteht aus der DNA und hauptsächlich den sie verpackenden, in der Länge kondensierenden Proteinen: den Histonen. Man unterscheidet Euchromatin und Heterochromatin. Euchromatin ist während der Interphase dekondensiert, transkriptionsaktiv und wird früh in der S-Phase repliziert. Heterochromatin bleibt kondensiert, transkriptionsinaktiv und wird spät repliziert. Man unterscheidet konstitutives Heterochromatin (an Zentromeren und Telomeren) von fakultativem Heterochromatin (z.b. ein X-Chromosom bei weiblichen Zellen).

21 Histone Reich an Arginin (R) und Lysin (K) => Basische = positiv geladene Proteine H3 H3 H2A H2B H4 H4 Evolutionär hochgradig konservierte Proteine H4 des Menschen unterscheidet sich von dem der Erbse nur in einer Aminosäure

22 Nukleosomenstruktur aus je 2 H2A, H2B, H3 und H4 und 147 Bp langer DNA Animation

23 Komplexe aus Histonen (ohne H1) und DNA bei niedriger Salzkonzentration In vitro lassen sich die Nukleosomen auf der DNA rekonstituieren. Sie bilden dann Perlen auf einer Kette, die zickzackförmig angeordnet sind.

24 Komplexe aus Histonen und DNA bei höheren Salzkonzentration bzw. mit H1 Diese Perlen können sich bei höheren Salzkonzentrationen zu 30 nm dicken Fasern zusammenlagern.

25 Aufbau einer höheren Ordnung Proteine bilden ein Rückgrat, an das die DNA über spezifische DNA-Sequenzen MAR (Matrix assoziierte Regionen) bzw. SAR (Scaffold assoziierte Regionen) gebunden wird. Die Sequenzen zwischen den MAR(SAR) ragen in Schleifen nach außen. Diese Schleifen können dann unabhängig voneinander reguliert und z. B. für die Transkription dekondensiert werden.

26 Chromatinstruktur (b) 30 nm fiber Die Schleifen sind wahrscheinlich radial, helikal um die Achse des Chromosoms angeordnet (eine Scheibe = dünnste Giemsa färbbare Bande).

27 Histonmodifikationen H1 Acetylierung Methylierung (197) Phosphorylierung Ubiquitylierung Vor allem an den N-terminal ungeordneten Armen können Histone vielfältig modifiziert werden. Diese Modifikationen werden von spezifischen Enzymen eingeführt und in der Regel von anderen Proteinen spezifisch erkannt.

28 Histonacetylierung und deacetylierung zur Steuerung der Zugänglichkeit des Chromatins Histonacetyltransferasen (HAT) werden durch sequenzspezifische DNA-Bindungsproteine (Transkriptionsaktivatoren) an das Chromatin gebracht und acetylieren Histone der umgebenden Nukleosomen. Im Gegensatz zum normalen Lysin ist ein acetyliertes Lysin ungeladen, sodass in hyperacetyliertem Chromatin die DNA weniger eng verpackt ist (keine 30 nm Faser möglich). Die Acetylierung der Histone kann durch Histondeacetylasen (HDAC), die von Repressoren an die DNA herangebracht werden, wieder rückgängig gemacht werden.

29 Histonmethylierung Die Methylierung von Histonen an Lysin- und Argininresten erfolgt stellenspezifisch und wird individuell von Proteinen erkannt, die dann unterschiedliche Folgereaktionen auslösen. Durch die Methylierung von Lysin 9 im Histon H3 wird eine Bindungsstelle für das Heterochromatinprotein 1 (HP1) geschaffen. HP1 bindet wiederum die H3K9-Methyltransferase Su(var)3-9 und HDACs an diesen Chromatinbereich, sodass diese inaktivierte Chromatindomäne weiter ausgedehnt wird. Die Methylierung von Lysin 4 im Histon H3 ist charakteristisch für Promotorbereiche aktiv transkribierter Gene. Die Methylierung der Lysinreste der Histone kann durch spezifische Demethylasen rückgängig gemacht werden, sodass die durch sie ausgelösten Regulationen reversibel sind.

30 DNA-Methylierung Eine weitere Form der Induktion transkriptionsinaktiven Chromatins stellt die DNA-Methylierung dar. Sie kommt in unseren Zellen nur in der kurzen palindromen Sequenz CpG vor. In dieser kann das Cytosin methyliert werden: Methylierung Demethylierung Die Methylierung kann zum einen die direkte Sequenzerkennung durch Transkriptionsfaktoren verhindern. Vor allem aber führt sie zu einer Anlagerung von methylierungsspezifischen Proteinen und zur Induktion von Heterochromatin. Die Methylierung der DNA steht im Zusammenhang mit den Modifikationen der Histone, sodass diese verschiedenen Regulationsmechanismen sich gegenseitig beeinflussen und zum Teil synergistisch wirken. Das DNA-Methylierungsmuster und auch die Modifikationen der Histone können vererbt werden: Epigenetik