Polyphenol content and profile in apples and its potential relevance to human health

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1 Research Collection Doctoral Thesis Polyphenol content and profile in apples and its potential relevance to human health Author(s): Ceymann, Maria Publication Date: 2013 Permanent Link: Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 DISS. ETH No Polyphenol content and profile in apples and its potential relevance to human health A dissertation submitted to ETH Zurich for the degree of Doctor of Science presented by MARIA CEYMANN Lebensmittelchemikerin, Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Germany born Krumbach (Schwaben), Germany accepted on the recommendation of Prof. Dr. Richard F. Hurrell, examiner Prof. Dr. Laura Nyström, co-examiner Eva Arrigoni, co-examiner 2013

3 SUMMARY Background Polyphenols are a diverse group of secondary plant metabolites which are present in all plant foods. Apple polyphenols belong to the groups of flavan-3-ols, phenolic acids, dihydrochalcones and flavonols. Their content and profile in apples vary widely depending on the cultivar. In addition, pre-harvest-factors such as light, rootstock, crop load, production method and growing season are reported to have an influence on the polyphenol content. During digestion, polyphenols are released from the apple matrix and become bioaccessible for absorption into the mucosal cells, where before the passage into the plasma, they are mainly metabolised to glucuronides, methylates and sulphates. Polyphenol compounds are bioactive, including their antioxidant properties. They are reported to be protective against chronic diseases such as cardiovascular diseases and various cancers, and they may modulate glucose absorption in the human body. Aims of this thesis The overall aim of this thesis was to evaluate the potential of apples to protect against chronic diseases by quantifying those polyphenols with reported health benefits in common and regional apple cultivars, and investigating the pre-harvest factors that could influence their levels in the fruits. The specific aims were to develop an analytical method to identify and quantify the 12 main apple polyphenols (PAPER 1); to screen the polyphenol content and profile of a broad range of apple cultivars (PAPER 2); to quantify and assess the influence of pre-harvest factors on polyphenol content and profile (PAPER 3), and to investigate the in vitro accessibility of polyphenols in apples (PAPER 4). Papers These aims were addressed by developing a method adapted to UHPLC-MS, by comparing polyphenol contents of apples grown under different conditions over a three year period, and by mimicking the digestion of fresh apples with an in vitro method simulating gastric and intestinal digestion. The UHPLC-MS method was used for quantifications of individual polyphenols in all studies. PAPER 1 For the development of the analytical method and measurement of the major polyphenols in four apple cultivars, apple slices were frozen in liquid nitrogen, ground to a fine powder and extracted with methanol containing formic acid (1 % v/v). After dilution and filtration, the filtrate was measured directly by UHPLC-MS and the total polyphenol content (TPC) by Folin-Ciocalteu was quantified. The analytical method developed was simple with a rapid extraction procedure and a single chromatographic run. The sample preparation was consumer adapted as it analysed polyphenols in apples with the skin but without the core area. 3

4 The 12 most important apple polyphenols were quantified. These were catechin, epicatechin, procyanidin B1 and B2, chlorogenic acid, coumaroylquinic acid, phloridzin, phloretinxyloglucoside, quercetin-galactoside/-glucoside, rutin, and quercetin rhamnoside. The TPC was analysed in the same extracts and showed 3-4 times higher polyphenol concentrations than the sum of individual polyphenols determined by UHPLC-MS. This difference was explained by dilution and filtration losses of oligomeric polyphenols during sample preparation for UHPLC-MS analysis. The oligomeric polyphenols are not expected to have major health benefits so that the losses appear negligible from a nutritional point of view. The individual polyphenols quantified in the cultivars Braeburn, Fuji, Gala Galaxy and Golden Reinders were comparable to published values. PAPER 2 For the screening of polyphenols in a wide range of apples, the UHPLC-MS method was used to quantify polyphenols in 104 European cultivars, mainly harvested in Switzerland. TPC by Folin-Ciocalteu and the antioxidant potential by Trolox equivalent antioxidant potential (TEAC) as well as ferric reducing antioxidant power (FRAP) were measured for comparison. For individual polyphenols, the amount of the different polyphenols in the 104 cultivars varied from below the limit of detection (<lod) to 70 mg/100 g FM. The highest concentrations were found for epicatechin, procyanidin B2 and chlorogenic acid and the individual apple polyphenols varied strongly between the different apple cultivars. Highest variability was obtained for phenolic acid values ranging from 1-70 mg/100 g for chlorogenic acid and from <lod to 18 mg/100 g edible fresh matter (FM) for coumaroylquinic acid. Flavan-3-ols showed a slightly smaller range (catechin: <lod-10 mg, epicatechin: mg, procyanidin B1: <lod-11 mg, procyanidin B2: mg/100 g FM). Dihydrochalcones (phloridzin: mg, phloretin xyloglucoside: mg/100 g FM) and flavonols (quercetin-galactoside/glucoside: mg, rutin: <lod-1 mg, quercetin-rhamnoside: mg/100 g FM) had more constant values with a smaller range. Based on their polyphenol profile, apple cultivars could be divided into flavan-3-ol dominated or phenolic acid dominated cultivars. The latter possess a flavan-3-ol to phenolic acid ratio 0.9, whereas the flavan-3-ol dominated cultivars show a ratio 1.1. In one serving size (150 g), a flavan-3-ol dominated cultivar such as cv. Topaz can contain an equal amount of epicatechin as a serving size of dark chocolate (20 g) and a phenolic acid dominated cultivar, for example. cv. Jonagold can reach the chlorogenic acid level of a cup of coffee (150 ml). Such quantities in cocoa and coffee are reported to have beneficial health effects in humans. When the 104 apple cultivars were screened for antioxidant potential, the TPC varied from 52 to 379 mg catechin equivalents/100 g FM. They were considerably higher than the sum of 4

5 individual polyphenols analysed by means of UHPLC-MS, but a reasonable correlation between the two measures was found. Moreover, similar correlations were observed for TEAC and FRAP. Therefore, these simple photometric methods can be considered as a good predictor for the polyphenol content in apples, but provide no information about the profile or potential effects on health. PAPER 3 The investigation of pre-harvest factors revealed that the main factor influencing the polyphenol content was the cultivar, which was also the only pre-harvest factor having an effect on the polyphenol profile. The mutant variety and growing year additionally had a small influence on the polyphenol content of apples. The influence of the rootstock, growing environment, crop load and production methods resulted in small but non-significant differences between treatments. If the apple grower wants to grow apples high in the polyphenols such as epicatechin or chlorogenic acid, which are reported to have health benefits, the best advice is to select the cultivar high in these specific polyphenols and to optimise the pre-harvest factors if possible. PAPER 4 For investigating the bioaccessibility of apple polyphenols, fresh apples and apple juices were digested with an in vitro method simulating gastric and intestinal digestion. Pure apple flavan-3-ols, six different apple cultivars and four apple juices were incubated with artificial gastric juice (1 h) and afterwards with artificial duodenal juice (2 h) at 37 C. The supernatants of the digested samples were freeze-dried and redissolved in methanolcontaining 1 % formic acid (v/v) for the determination of catechin, epicatechin, procyanidin B1 and B2 as well as chlorogenic acid by UHPLC-UV. The in vitro digestion of fresh apples indicated a relatively high bioaccessibility of apple polyphenols with nearly 50 % recovered after simulated gastric digestion and simulated duodenal digestion. The same values were found for apple juices. As the polyphenols of apple juice are expected to be 100 % accessible, the recovery values reflect mainly the destruction of the polyphenols during the simulated in vitro digestion but also include formation of monomers from oligomers and epimerisation of monomers as detected for isolated pure monomeric (60-70 % recovery) and dimeric flavan-3- ols (traces of recovery). As polyphenols from other foods are reported to arrive intact in the small intestine, the current in vitro method needs improvement to better predict bioaccessibility in humans. Conclusion The apple cultivar appeared to be the main factor for increasing the polyphenol content followed by some pre-harvest factors. Moreover, the polyphenol profile can only be modified by choosing a specific cultivar. Therefore, the choice of the apple cultivar appeared 5

6 to be the most important decision for the consumer but also for the producer. A flavan-3-ol dominated cultivar may have a beneficial effect on cardiovascular health mainly assigned to epicatechin. Two flavan-3-ol dominated apples would provide a level of epicatechin that has been shown to improve blood flow when consumed with cocoa. In contrast, the level of chlorogenic acid in the phenolic acid dominated apples is much lower than the levels used in intervention studies which were reported to improve the glucose metabolism and possibly be beneficial to weight control. Another health aspect could be obtained by one apple of a cultivar which contains sufficient dihydrochalcones to help prevent type 2 diabetes through the inhibition of glucose uptake. Furthermore, a reduced cancer risk could be associated with eating daily two apples with red skin through the inhibitory effect on cancer cell proliferation of quercetin-glycosides. Overall, the polyphenol profile of the apples commonly consumed in Switzerland would indicate that two or more apples per day would be necessary to help reduce the risk of common chronic diseases. The old saying should be adapted to Two apples a day keep the doctor away. In this context, an increase in apple consumption should be recommended to the Swiss population, even though the postulated health effects of apple polyphenols should be investigated in further human studies. 6

7 ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund Polyphenole sind eine vielfältige Gruppe von sekundären Pflanzenstoffen, die in allen pflanzlichen Lebensmitteln vorkommen. Polyphenole in Äpfeln gehören zu den Gruppen der Flavan-3-ole, phenolischen Säuren, Dihydrochalcone und Flavonole. Ihr Gehalt ist stark von der Sorte abhängig. Als weitere Einflussfaktoren auf den Polyphenolgehalt gelten Vorerntefaktoren wie Licht, Unterlage, Behang, Produktionsmethode und Produktionsjahr. Im Verdauungsprozess werden Polyphenole aus der Apfelmatrix freigesetzt. Dadurch werden sie für die Aufnahme in die Mukosazellen, wo sie hauptsächlich zu Glucuroniden, Methylaten und Sulfaten verstoffwechselt werden, biozugänglich. Polyphenole sind bioaktive Substanzen mit antioxidativen Eigenschaften. Ihnen wird einen schützender Effekt gegen chronische Erkrankungen, wie beispielsweise die Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen und verschiedener Krebsarten, zugeschrieben. Auch bei der Regulierung der Glucoseaufnahme im menschlichen Körper entfalten sie möglicherweise eine positive Wirkung. Ziele der Arbeit Das generelle Ziel dieser Arbeit war es das Potential von Äpfeln zum Schutz vor chronischen Krankheiten zu ermitteln. In gängigen Apfelsorten wurden dazu Polyphenole mit einem bekannten positiven Einfluss auf die Gesundheit quantifiziert und Vorerntefaktoren, die diese Gehalte beeinflussen können, untersucht. Die spezifischen Ziele dieser Arbeit waren die Entwicklung einer analytischen Methode zur Identifizierung und Quantifizierung der 12 wichtigsten Apfelpolyphenole (PAPER 1); die Untersuchung des Polyphenolgehalts und -profils eines breiten Sortiments an Apfelsorten (PAPER 2); die Bestimmung und Bewertung des Einflusses von Vorerntefaktoren auf Polyphenolgehalt und -profil (PAPER 3) sowie die Analyse der in vitro Zugänglichkeit von Polyphenolen in Äpfeln (PAPER 4). Paper Um die oben erwähnten Fragestellungen zu beantworten, wurde eine UHPLC-MS Methode entwickelt, welche es ermöglicht Polyphenolgehalt und -profil von Äpfeln, die im Zeitraum von drei Jahren unter verschiedenen Bedingungen angebaut wurden, zu untersuchen. Des Weiteren wurde die Zugänglichkeit von Polyphenolen aus frischen Äpfeln mit einer in vitro Verdauungsmethode ermittelt. Die UHPLC-MS Methode wurde in allen weiteren Analysen für die Quantifizierung einzelner Polyphenole verwendet. PAPER 1 Für die Entwicklung der analytischen Methode und Messung der wichtigsten Polyphenole in vier Apfelsorten wurden Apfelschnitze in flüssigem Sticksoff gefroren, zu feinen Pulver gemahlen und mit Ameisensäure-haltigem Methanol (1 % v/v) extrahiert. Nach 7

8 der Verdünnung und Filtrierung der Extrakte, wurden diese direkt mittels UHPLC-MS analysiert und zusätzlich der Gesamtpolyphenolgehalt (TPC) mittels Folin-Ciocalteu gemessen. Die entwickelte analytische Methode war auf Grund eines schnellen Extraktionsprotokolls sowie eines einzigen chromatographischen Laufs einfach durchführbar. Die Probenvorbereitung war an das Konsumentenverhalten angepasst, indem die Polyphenole im Apfel mit der Schale, aber ohne Kerngehäuse analysiert wurden. Die 12 wichtigsten Apfelpolyphenole wurden quantifiziert. Dies waren Catechin, Epicatechin, Procyanidin B1 und B2, Chlorogensäure, Cumaroylchinasäure, Phloridzin, Phloretinxyloglucosid, Quercetingalactosid/-glucosid, Rutin und Quercetinrhamnosid. Der in den gleichen Extrakten analysierte TPC zeigte drei- bis viermal höhere Polyphenolkonzentrationen als die Summe der einzelnen Polyphenole, die mittels UHPLC-MS gemessen wurden. Dieser Unterschied wurde mit Verdünnungs- und Filtrationsverlusten von oligomeren Polyphenolen während der Probenvorbereitung für die UHPLC-MS-Analysen erklärt. Da von den oligomeren Polyphenolen bislang keine wichtigen Gesundheitseffekte bekannt sind, erschienen die Verluste aus ernährungswissenschaftlicher Sicht vernachlässigbar. Die Quantifizierung der einzelnen Polyphenole in den Sorten Braeburn, Fuji, Gala Galaxy und Golden Reinders war mit publizierten Werten vergleichbar. PAPER 2 Für das Screening von Polyphenolen in Äpfeln wurden in 104 europäischen, hauptsächlich in der Schweiz geernteten Apfelsorten, die einzelnen Polyphenole mit UHPLC- MS quantifiziert. Zum Vergleich wurden TPC mittels Folin-Ciocalteu und das antioxidative Potential mittels Trolox equivalent antioxidative potential (TEAC) und ferric reducing antioxidant power (FRAP) bestimmt. Die verschiedenen Polyphenolgehalte der 104 Apfelsorten schwankten von unterhalb der Detektionsgrenze (<lod) bis zu 70 mg/100 g essbare Frischmasse (FM). Die höchsten Konzentrationen wurden für Epicatechin, Procyanidin B2 und Chlorogensäure detektiert. Dabei variierten die einzelnen Apfelpolyphenole stark zwischen den einzelnen Sorten. Die grössten Unterschiede wurden in den Gehalten von phenolischen Säuren gefunden, die zwischen 1-70 mg/100 g FM für Chlorogensäure und unterhalb des Detektionslimits und 18 mg/100g FM für Cumaroylchinasäure lagen. Flavon-3-ole zeigten etwas kleinere Unterschiede (Catechin: <lod-10 mg, Epicatechin: mg, Procyanidin B1: <lod-11 mg, Procyanidin B2: mg/100 g FM). Die Konzentrationen der Dihydrochalcone (Phloridzin: mg, Phloretinxyloglucosid: mg/100 g FM) und Flavonole (Quercetingalactosid/-glucosid: mg, Rutin: <lod-1 mg, Quercetinrhamnosid: mg/100 g FM) waren konstanter bei 8

9 kleinerer Variabilität. Auf Grund ihres Polyphenolprofils konnten die Apfelsorten in Flavan- 3-ol-dominierte und in phenolische Säuren-dominierte Sorten unterteilt werden. Letztere besitzen ein Verhältnis von Flavan-3-olen zu phenolischen Säuren von < 0.9, wohingegen die Flavan-3-ol-dominierten Sorten ein Verhältnis von > 1.1 aufweisen. Eine Portion (150 g) einer Flavan-3-ol-dominierten Apfelsorte, wie beispielsweise Topaz, verfügt über Epicatechingehalte vergleichbar mit einer Portion Schokolade (20 g). Eine Portion einer phenolische Säuren-dominierten Sorte wie Jonagold hingegen kann die Chlorogensäuregehalte einer Tasse Kaffee (150 ml) erreichen. Diesen Gehalten in Kakao und Kaffee werden gesundheitsfördernde Effekte beim Menschen nachgesagt. Das Screening des antioxidativen Potentials der 104 Apfelsorten zeigte TPC im Bereich von mg Catechinäquivalente/100 g FM. Diese lagen massgeblich höher als die ermittelte Summe der einzelnen Polyphenole, die mittels UPLC-MS analysiert wurden. Allerdings konnte eine ausreichende Korrelation zwischen beiden Messungen aufgedeckt werden. Zusätzlich konnten ähnlich ausgeprägte Zusammenhänge für die TEAC- und FRAP- Messungen gezeigt werden. In diesem Kontext können die einfachen photometrischen Messungen als gute Methoden zur Abschätzung der Polyphenolgehalte in Äpfeln angesehen werden, wobei keine Aussagen über das Polyphenolprofil möglich sind. Auch die postulierten Gesundheitseffekte der Einzelsubstanzen können somit nicht abgeschätzt werden. PAPER 3 Die Untersuchung der Vorerntefaktoren zeigte, dass der wichtigste Einflussfaktor auf den Polyphenolgehalt die Sorte war. Diese stellte auch den einzigen Vorerntefaktor dar, der einen Einfluss auf das Polyphenolprofil hatte. Zusätzlich hatten die Mutante und das Produktionsjahr einen marginalen Einfluss auf den Polyphenolgehalt von Äpfeln. Der Einfluss der Unterlage, des Standortes, des Behangs und der Produktionsmethode resultierte in kleinen, aber nicht signifikanten Unterschieden zwischen den Behandlungen. Wenn Apfelproduzenten Äpfel mit einem hohen Gehalt an Polyphenolen wie beispielsweise potentiell gesundheitsförderndem Epicatechin oder Chlorogensäure anbauen wollen, kann die entsprechende Wahl einer Apfelsorte mit hohen Gehalten dieser spezifischen Polyphenole sowie eine Optimierung der Vorerntefaktoren empfohlen werden. PAPER 4 Um die Biozugänglichkeit von Apfelpolyphenolen zu untersuchen, wurden frische Äpfel und Apfelsäfte mit einer in vitro Methode verdaut. Sechs verschiedene Apfelsorten und vier Apfelsäfte wurden mit künstlichem Magensaft (1 h) und anschliessend mit künstlichem Duodenalsaft (2 h) bei 37 C inkubiert. Die Überstände der verdauten Proben wurden 9

10 gefriergetrocknet und in Ameisensäure-haltigem Methanol (1 % v/v) gelöst, um die Konzentration an Catechin, Epicatechin, Procyanidin B1 und B2 sowie Chlorogensäure mittels UHPLC-UV zu bestimmen. Nach der in vitro Verdauung der Apfelproben zeigte sich eine relativ hohe Biozugänglichkeit der Apfelpolyphenole mit etwa 50 % Wiederfindung nach Versetzen mit Magensaft und genauso nach zusätzlichem Versetzen mit Duodenalsaft. Die gleichen Werte wurden für Apfelsäfte ermittelt. Da für Polyphenole aus Apfelsaft eine Zugänglichkeit von 100% erwartet wurde, zeigten die ermittelten Wiederfindungsraten einen Polyphenolabbau während der in vitro Verdauung. Zusätzlich beinhaltet diese Wiederfindung auch die Bildung von Monomeren aus Oligomeren sowie die Epimerisierung von Monomeren, wie es für isolierte Reinsubstanzen von monomeren (60-70% Wiederfindung) und dimeren Flavan-3-olen (Spuren in der Wiederfindung) analysiert wurde. Da gezeigt wurde, dass Polyphenole von anderen Lebensmitteln intakt den Dünndarm erreichen, ist eine Verbesserung der aktuellen in vitro Methode notwendig, um die Biozugänglichkeit im Menschen besser vorhersagen zu können. Schlussfolgerungen Es stellte sich heraus, dass die Sorte der Haupteinflussfaktor für den Polyphenolgehalt in Äpfeln ist, gefolgt von einzelnen Vorerntefaktoren. Ausserdem kann das Polyphenolprofil nur durch die Auswahl einer spezifischen Sorte modifiziert werden. Deswegen ist die Wahl der Apfelsorte die wichtigste Entscheidung für Konsumenten und Produzenten. Eine Flavan-3-ol-dominierte Sorte kann sich schützend auf die kardiovaskuläre Gesundheit auswirken, wobei diese Wirkung hauptsächlich Epicatechin zugesprochen wird. Zwei Flavan-3-ol-dominierte Äpfel können einen Epicatechingehalt liefern, von welchem gezeigt wurde, dass er verzehrt in Kakao den Blutfluss erhöhen kann. Im Gegensatz dazu sind die Chlorogensäuregehalte in phenolischen Säuren-dominierten Sorten niedriger als die Konzentration, die in Interventionsstudien eine Verbesserung im Glucosestoffwechsel und einen postulierten positiven Effekt bei der Gewichtskontrolle zeigten. Ein weiterer gesundheitsfördernder Aspekt könnte durch einen Apfel einer Sorte mit hohen Dihydrochalcongehalten erreicht werden, da dieser Polyphenolgruppe ein präventiver Effekt gegen Typ 2 Diabetes durch Hemmung der Glucoseaufnahme zugesprochen wird. Des Weiteren könnte der tägliche Verzehr von zwei rotschaligen Äpfeln mit einem geringeren Krebsrisiko assoziiert werden, da Quercetinglycoside die Krebszellenproliferation hemmen. Allgemein betrachtet weisen die Polyphenolprofile in gängig verzehrten Schweizer Apfelsorten darauf hin, dass täglich zwei oder mehr Äpfel konsumiert werden sollten, um das Risiko von chronischen Erkrankungen zu reduzieren. Das alte Sprichwort sollte diesbezüglich angepasst werden: Two apples a day keep the doctor away. In diesem Zusammenhang sollte 10

11 der Schweizer Bevölkerung ein gesteigerter Apfelkonsum empfohlen werden, wobei die Gesundheitseffekte der einzelnen Apfelpolyphenole in weiteren Humanstudien untersucht werden müsste. 11