Softwarewerkzeuge der Bioinformatik

Transkript

1 Bioinformatik Wintersemester 2006/2007 Tutorial 2: paarweise Sequenzaligments BLAST Tutorial 2: BLAST 1/22

2 Alignment Ausrichten zweier oder mehrerer Sequenzen, um: ihre Ähnlichkeit quantitativ zu erfassen einzelne Bausteine zuzuordnen Gesetzmäßigkeiten der Konservierung und Variabilität zu beobachten Rückschlüsse auf entwicklungsgeschichtliche Verwandschaftsverhältnisse zu ziehen Struktur und Funktion zuordnen zu können in Datenbanken ähnliche Sequenzen zu suchen Gap = Indel = Insertion oder Deletion Tutorial 2: BLAST 2/22

3 Gleichheit, Ähnlichkeit, Homologie Identität (identity) Verhältnis der Anzahl identischer Aminosäuren zur Gesamtzahl der Aminosäuren; objektiv Ähnlichkeit (similarity) Verhältnis ähnlicher Aminosäuren (Austauschmatrizen) Maß der Ähnlichkeit ist modellbehaftet Homologie (homology) Sequenzen haben eine gemeinsame Vorläufersequenz nur möglich durch Vergleich vieler Sequenzen: was sind signifikante gemeinsame Merkmale? "bewertete Ähnlichkeit": Maß der Homologie ist modellbehaftet, kann nicht in % angegeben werden! Tutorial 2: BLAST 3/22

4 verschiedene Arten von Homologie Organismus X A Organismus # Ħ Organismus Y A B Organismus Z a Ħ A-a: Orthologe Gene in unterschiedlichen Organismen gleiche Funktion entstanden durch Artenbildung (speciation) A-B: Paraloge Gene im gleichen Organismus können unterschiedliche Funktion haben entstanden durch Genduplikation Ħ-Ħ: Xenologe Gene durch horizontalen Gentransfer erworben Bsp.: Resistenzgene auf Plasmiden B-Ħ: Analoge Gene: nicht homologe Sequenz, sondern zufällige Ähnlichkeit, entstanden durch Konvergenz; gleiche/ähnliche Funktion Tutorial 2: BLAST 4/22

5 Bewertung von Ähnlichkeit DNA oft nur Unterscheidung identisch/nicht identisch Substitutionen sind unterschiedlich wahrscheinlich: Transition (häufig) Purin-Purin (A-G) Pyrimidin-Pyrimidin (C-T), besonders bei 5-Methyl-Cytosin Transversion (selten) NH Purin-Pyrimidin (A-C, A-T, G-C, G-T) 2 CH N 3 Gaps = Indels im codierenden Bereich : O N Leserahmenverschiebung! H Proteine Codon-basiert: "zurückrechnen" auf DNA-Ebene. Nicht jede AS kann direkt zu jeder anderen werden, evtl. Umweg nötig chemische Ähnlichkeit der Aminosäuren (Substitutions- = Austauschmatrizen) verschiedene Gap-Kosten Tutorial 2: BLAST 5/22

6 Aminosäuren-Substitutionsmatrizen zur Bewertung der Qualität eines Alignments Score ist die Summe aller Bewertungen für die Paare an allen Positionen des Alignments einige Aminosäuren (meist kleine) weisen grundsätzlich hohe Mutationsraten auf: "unwichtig" für Funktion und Struktur Aminosäure ändert sich, die chemischen Eigenschaften aber bleiben gleich: geringe Strafe Funktion und/oder Faltung eines Proteins ändern sich bei Austausch von His (H), Trp (W), Pro (P), Cys (C): hohe Scores für die Erhaltung solcher Residuen Austausch von ähnlichen Residuen, z. B. Ile (I)-Leu (L) ist wahrscheinlicher (hat einen höheren Score) als der von unterschiedlichen, z.b. I-Asp(D) Ausnahme: korrelierte Mutationen interagierender Residuen (Lys (K)-Glu (E) in einem Protein, E-K in dessen Komplexpartner) Tutorial 2: BLAST 6/22

7 PAM und BLOSUM BLOSUM62 Default-Austauschmatrix in BLAST, entspricht etwa PAM120 hydrophil hydrophil Iminosäure hydrophob sauer, basisch, + hydrophob aromatisch C S T P A G N D E Q H R K M I L V F Y W C S T P A G N D E Q H R K M I L V F Y W enge Verwandtschaft: niedrige PAM(1), hohe BLOSUM(80) entfernte Verwandtschaft: hohe PAM (250), niedrige BLOSUM(45) Tutorial 2: BLAST 7/22

8 Alignment-Methoden N&W paarweise Alignments dynamische Algorithmen S&W FASTA heuristische Algorithmen BLAST Alignment wird in Subalignments (einzelne Residuen) zerlegt Subalignments sind schneller zu handhaben schließlich werden die besten Ergebnisse ausgegeben -Abschätzungen, um annähernd genaue Ergebnisse zu erzielen Kenntnisse über Sequenzen und Alignment-Statistiken werden benutzt Alignment wird bei geringem Genauigkeitsverlust stark beschleunigt Tutorial 2: BLAST 8/22

9 dynamische Alignments globales Alignment (Needleman & Wunsch) N N evolutionäre Verwandtschaftsbeziehungen C C lokales Alignment (Smith & Waterman) N N C C N N C C Funktionsgemeinsamkeiten (Domänen) Implementierungen z.b. unter Tutorial 2: BLAST 9/22

10 heuristische Alignments dynamische Alignments sind zwar optimal, aber langsam heuristische Alignments sehr viel schneller als dynamische Einsatzgebiet: vor allem Datenbankensuchen mit der Akzeptanz einer geringen Fehlerrate kann der Suchraum stark verkleinert und das Alignment beschleunigt werden schließlich findet ein detailliertes Alignment statt das beste Alignment wird bei gegebenem Model nur mit hoher Wahrscheinlichkeit gefunden BLAST ( FASTA ( Tutorial 2: BLAST 10/22

11 Literatur zu BLAST Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990): "Basic Local Alignment Search Tool", J. Mol. Biol. 215: Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: Schäffer AA, Aravind L, Madden TL, Shavirin S, Spouge JL, Wolf YI, Koonin EV, Altschul SF (2001): "Improving the accuracy of PSI-BLAST protein database searches with compositionbased statistics and other refinements", Nucleic Acids Res. 29: Hilfeseiten und Tutorials bei NCBI ( Tutorial 2: BLAST 11/22

12 Algorithmus von BLAST zerlege die Suchsequenz in überlappende Wörter erzeuge für jedes dieser Wörter eine Liste aller ähnlichen Wörter (w-mers), deren Score > Schwellenwert ist suche die w-mers in der Datenbank verwende in der Datenbank aufgefundene w-mers als "Saat" verlängere Treffer beiderseits durch Hinzunehmen von Residuenpaaren (ohne Gaps), solange ein bestimmter Score nicht unterschritten wird > HSPs (high scoring segment pairs) behalte die besten HSPs (Diagonalen) kombiniere diese HSPs mit dynamischer Programmierung (mit Gaps) zu Alignments Tutorial 2: BLAST 12/22

13 BLAST-Programme Name Abfragesequenz Datenbank Bemerkung blastp Protein Protein blastn Nukleotid Nukleotid blastx Nukleotid Protein tblastn Protein Nukleotid tblastx Nukleotid Nukleotid Abfragesequenz wird in alle 6 Leserahmen übersetzt Datenbank wird in alle 6 Leseramen übersetzt Abfragesequenz und Datenbank werden in alle 6 Leserahmen übersetzt weitere: blast2sequences, Megablast, Psi- und Phi-Blast Tutorial 2: BLAST 13/22

14 Signifikanz des Alignments E-Wert (Erwartungswert) E = P * Anzahl der Sequenzen in Datenbank P-Wert: Wahrscheinlichkeit, mit der der Score eines Alignments zufällig zustande kommen kann E entspricht der Anzahl an Alignments eines bestimmten Scores, die man zufällig in einer Sequenz-Datenbank dieser Größe erwartet Treffer werden in BLAST nur ausgegeben, wenn der E-Wert unterhalb einer einstellbaren Schranke liegt E 0,02: Sequenzen vermutlich homolog 0,02 < E 1: Homologie ist nicht auszuschließen E 1: gute Übereinstimmung kann zufällig sein Tutorial 2: BLAST 14/22

15 PSI-BLAST Position Specific Iterated BLAST Idee: entfernte Verwandtschaften lassen sich besser durch Motivoder Profil-Suchen entdecken als durch paarweise Vergleiche PSI-BLAST führt zunächst eine BLAST-Suche mit Austauschmatrix und Gaps durch verwendet die Information jedes signifikanten Alignments, um mittels eines multiplen Alignments eine positionsspezifische Substitionsmatrix zu konstruieren diese wird in der nächsten Runde der Datenbank-Suche verwendet (anstelle von Sequenz und Matrix) kann iterativ verwendet werden, bis keine neuen signifikanten Treffer mehr gefunden werden (Konvergenz) Tutorial 2: BLAST 15/22

16 Profilerstellung (hier für DNA) multiples Alignment Pos Sq1 CACCACGTG Sq2 GACCACGTG Sq3 TAGCACGTG Sq4 GAACACGTG Sq5 AACCACGTG Sq6 CACC-CGTG Sq7 GGCCACGTG Sq8 GTCCACGTG Sq9 TACCACGTG Sq10 -CCCACGTG Alignmentmatrix = Positionsfrequenzmatix (PFM) N A C G T bei Proteinsequenzen ensprechend 21 Zeilen PSI-Blast: -Sequenzen dürfen nicht zu ähnlich sein -PSSM ist ASCII-codiert Tutorial 2: BLAST 16/22

17 BLAST bei NCBI Eingabe Sequenz im Fasta- Format Grenze für E-Values Länge der w-mers Tutorial 2: BLAST 17/22

18 BLAST Formatseite CD Search: Scannen der Query mit PSSMs für konservierte Domänen andere Option: PSSM (ab 2. Iteration) für PSI-BLAST aktivieren Tutorial 2: BLAST 18/22

19 BLAST graphische Alignmentansicht beste Treffer je 2 getrennte Treffer auf derselben Sequenz quergestrichelte Region dazwischen paßt nicht zur Query Eingabesequenz (Query) Tutorial 2: BLAST 19/22

20 BLAST Trefferliste (a) gi-nummer Datenbank Accession-Nummer Locusname der Sequenz - sp swissprot = UniProtKB/Swiss-Prot (b) Beschreibung der Sequenz (Art, Funktion, Organismus) (c) Bit-Scores sind normalisiert und daher zwischen verschiedenen Suchen auch in verschiedenen Datenbanken vergleichbar (d) je kleiner der E-Value, desto signifikanter der Treffer Tutorial 2: BLAST 20/22

21 BLAST Alignment raw Score (unnormiert) Query: Eingabesequenz Sbjct: Treffer X: maskierte low complexity-region Tutorial 2: BLAST 21/22

22 alternative Alignmentprogramme für DNA ganze Chromosomen/Genome Genreihenfolge, Phylogenie, Evolution, Konservierung nichtcodierende Bereiche des Genoms Transkriptionsfaktor-Bindestellen und andere Elemente für Genregulation lokales Alignment FASTA BLASTZ BLAT mindestens 95 % Sequenzähnlichkeit auch für Proteine (mind. 80 % Ähnlichkeit) globales Alignment AVID LAGAN meist werden multiple Alignments verwendet Tutorial 2: BLAST 22/22