Vom Gen zum Naturstoff!

Transkript

1 Pierre Stallforth // HKI Jena Vom Gen zum Naturstoff Sequenzierung: Wie erhalte ich genomische Informationen eines Organismus Genetische Knockouts, (CRISPR-Cas9) Veränderung: Bioinformatik: Datenbanken, Genclustersuche... MatabolitanalysenNMR, LCMS, HRMS, Bioassays... Differential Metabolomics

2 Pierre Stallforth // HKI Jena Einige Begriffe DNA komplementäre Stränge: ATCTTACTCGAAATAGTACGCCGGTATGCACGCCGGTATGC TAGAATGAGCTTTATCATGCGGCCATACGTGCGGCCATACG Codons codieren für eine Aminosäure CAG: codiert die Aminosäure Glutamin Start und Stop Codon Anfang und Ende eines Gens

3 Einige Begriffe Pierre Stallforth // HKI Jena

4 Pierre Stallforth // HKI Jena Einige Begriffe ATG TAC CAT CCG TTA GAC CCC ATG ACC ATC TAG TAC ATG GTA GGC AAT CTG GGG TAC TGG TAG ATC Start Tyr His Arg Leu Asp Pro Met Thr Ile Stop

5 Pierre Stallforth // HKI Jena Einige Begriffe Biosynthesegencluster: Mehrere Gene, die im Genom nah beieinander liegen und für die Biosynthese eines Naturstoffs verantwortlich sind.

6 Pierre Stallforth // HKI Jena PCR Reaktion Amplifikation von DNA DNA Template, Primer, Replikation Polymerase, dntps DNA Polymerase DNA

7 Pierre Stallforth // HKI Jena PCR Reaktion Amplifikation von DNA DNA Template, Primer, Replikation Polymerase, dntps DNA Polymerase DNA

8 Pierre Stallforth // HKI Jena Genomsequenzierung Sanger Sequencing: Klassische Methode ca. 1000bp NextGen Sequencing: Illumina PacBio

9 Genomassemblierung Pierre Stallforth // HKI Jena

10 Pierre Stallforth // HKI Jena Next Generation Sequencing Illumina, PacBio, 454,... Ermöglichen die automatisierte Sequenzierung von ganzen Genomen. Je nach Technik bekommt man Fragmente von Bp Länge, die assembliert werden müssen Contigs Ideal: 1 Contig pro Chromosom. Realität: Contigs pro Organismus (Illumina) PacBio: große Sequnezlängen (höhere Fehlerrate)

11 Pierre Stallforth // HKI Jena Genomanalysen Annotierung des Genoms: Wo befinden sich die Gene (Rohdaten). Sequenzhomologien: Vergleich mit Genen anderer Organismen (BLAST) NCB, 2015, 11, 639

12 Pierre Stallforth // HKI Jena Genomanalysen Gendatenbanken NCBI National Center for Biotechnology Information ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ - Bacteria - Fasta file xxx.fna herunterladen Rohdaten

13 Pierre Stallforth // HKI Jena Genomanalysen

14 Pierre Stallforth // HKI Jena Genomanalysen Einzelne Gene: NCBI National Center for Biotechnology Information Genes

15 Pierre Stallforth // HKI Jena Genomanalysen

16 Pierre Stallforth // HKI Jena Informationen aus Sequenzierung Was mache ich, wenn ich ein unbekanntes Gen sequenziert habe? BLAST

17 Pierre Stallforth // HKI Jena BLAST Basic Local Alignment Search Tool Datenbank für genomische Sequenzen und Proteinsequenzen Blastn Nukleotidsequenzen Blastp Proteinsequenzen Genom Gene Blast Informationen über potentielle Genfunktion

18 Pierre Stallforth // HKI Jena BLASTN

19 Pierre Stallforth // HKI Jena BLASTN

20 BLASTN Pierre Stallforth // HKI Jena

21 BLASTN Pierre Stallforth // HKI Jena

22 Pierre Stallforth // HKI Jena BLASTN

23 Pierre Stallforth // HKI Jena BLASTP

24 Pierre Stallforth // HKI Jena Kurze Zusammenfassung 1.) Genome können sequenziert werden (kommerziell) 2.) DNA Abschnitte (z. B. Gene) können amplifiziert werden 3.) Es gibt mittlerweile riesige und unglaublich gute Datenbanken mittels derer potentielle Genfunktionen ermittelt werden können oder ähnliche Gene in anderen Organismen ermittelt werden können.

25 Pierre Stallforth // HKI Jena Biosynthesegen-Sequenzanalysen Datenbanken für genomische Sequenzen von Biosynthesegenen Ganze Genome oder Genomabschnitte werden auf die Gegenwart von Biosynthesegenen überprüft AntiSMASH, ClusterFinder, MIBiG repository...

26 Pierre Stallforth // HKI Jena Antismash antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell

27 Pierre Stallforth // HKI Jena Antismash

28 Pierre Stallforth // HKI Jena Antismash

29 Antismash Pierre Stallforth // HKI Jena

30 Pierre Stallforth // HKI Jena Identifikation von Naturstoffen Differentieller Metabolismus

31 Pierre Stallforth // HKI Jena Beispiel Pyrrolnitrin Nat. Prod. Rep, 2000, 17, 157

32 Pierre Stallforth // HKI Jena Beispiel Pyrrolnitrin X Nat. Prod. Rep, 2000, 17, 157

33 Pierre Stallforth // HKI Jena Beispiel Pyrrolnitrin X X X X Nat. Prod. Rep, 2000, 17, 157

34 Geninaktivierung Pierre Stallforth // HKI Jena

35 Pierre Stallforth // HKI Jena Geninaktivierung Plasmide: Mobile genetische Elemente, die von Bakterien aufgenommen werden können und/oder in andere Organismen übertragen werden. Selektion: Selektive Bedingungen unter denen ein Organismus wachsen bzw. nicht wachsen kann

36 Pierre Stallforth // HKI Jena Vektoren - Plasmide genomsiche DNA Plasmid

37 Pierre Stallforth // HKI Jena Plasmide - Vektoren Plasmide: treten natürlich in Bakterien auf, beherbergen oftmals mobile Elemente (AB Resistenzen, Biosynthesegene...) Vektoren: Plasmide können in der Molekularbiologie als Vektoren verwendet werden, um genetisches Material in einen Organismus zu transportieren.

38 Pierre Stallforth // HKI Jena Vektoren - Plasmide KpnI Acc65I EcoRI SacI Eco53kI XhoI PspXI XmaI SmaI BamHI XbaI SalI PstI HindIII StuI MscI PacI AseI FspAI FspI EcoO109I PpuMI BbsI BspEI Eco47III DYH BpmI XmnI PfoI BmrI BstAPI NdeI SapI PsiI SnaBI Gen X 4000 pexg2.seq 5084 bps Origin of Replication 1000 BssSI BseYI GsaI AlwNI SacII NheI BmtI GentamicinRes MreI SgrAI EagI EcoRV BseRI BsrDI BglII AhdI BspHI

39 Pierre Stallforth // HKI Jena Vektoren Beispiele: Fluoreszenzmarkierungen. Wichtig: Plasmide sind nicht stabil im Organismus, sie können verloren gehen Selektionskriterium Meistens verwendet man AB Resistenzmarker.

40 Homologe Rekombination Pierre Stallforth // HKI Jena

41 Homologe Rekombination Pierre Stallforth // HKI Jena

42 Homologe Rekombination Pierre Stallforth // HKI Jena

43 Homologe Rekombination Pierre Stallforth // HKI Jena

44 Homologe Rekombination Pierre Stallforth // HKI Jena

45 Homologe Rekombination Pierre Stallforth // HKI Jena

46 Pierre Stallforth // HKI Jena Homologe Rekombination B A C

47 Pierre Stallforth // HKI Jena Homologe Rekombination C B A

48 Pierre Stallforth // HKI Jena Homologe Rekombination Resistenzgen

49 Homologe Rekombination Pierre Stallforth // HKI Jena

50 Pierre Stallforth // HKI Jena Selektion - Suiziplasmid Def: Ein Plasmid, das nicht im Wirt (Empfänger) repliziert werden kann (Origin of Replication wird nicht erkannt) Resultat: Nur wenn das Plasmid integriert wurde können die Gene auf dem Plasmid abgelesen werden.

51 Pierre Stallforth // HKI Jena Wie erstellt man Plasmide oder Vektoren? Genetisches Material muss in einen Vektor integriert werden oder auch selektiv wieder entfernt werden können. Genetisches Material kann z. B. ein Gen sein, das mittels PCR Reaktion vervielfältigt wurde.

52 Pierre Stallforth // HKI Jena Klonierung Mittels PCR werden die Homolgiearme aus dem Genom vervielfältigt. Die PCR Fragmente werden dann in ein Plasmid integriert. Man verwendet dabei klassisch Restriktionsenzyme und Ligasen

53 Klonierung Pierre Stallforth // HKI Jena

54 Klonierung Pierre Stallforth // HKI Jena

55 Klonierung Pierre Stallforth // HKI Jena

56 Klonierung Pierre Stallforth // HKI Jena

57 Klonierung Pierre Stallforth // HKI Jena

58 Klonierung Pierre Stallforth // HKI Jena

59 Klonierung Pierre Stallforth // HKI Jena

60 Pierre Stallforth // HKI Jena Wie bekommt man Plasmide in den Empfänger? Kompetenz: Die Fähigkeit genetisches Material aufnehmen zu können Elektroporation: Das Plasmid wird mittels Elektroshock in die Zelle eingebracht. Conjugation: Auch mating genannt, eine Zelle mit dem Plasmid transferiert das Plasmid in eine andere Zelle (durch Sexpili).

61 Pierre Stallforth // HKI Jena Vektoren - Plasmide KpnI Acc65I EcoRI SacI Eco53kI XhoI PspXI XmaI SmaI BamHI XbaI SalI PstI HindIII StuI MscI LA PacI AseI FspAI FspI EcoO109I PpuMI BbsI BspEI Eco47III 5000 BpmI XmnI PfoI BmrI BstAPI NdeI SapI PsiI SnaBI AmpR 4000 pexg2.seq 5084 bps Origin of Replication 1000 BssSI BseYI GsaI AlwNI SacII RA NheI BmtI GentamicinRes MreI SgrAI EagI EcoRV BseRI BsrDI BglII AhdI BspHI

62 Pierre Stallforth // HKI Jena Vektoren - Plasmide PacI AseI FspAI FspI EcoO109I PpuMI BbsI BspEI Eco47III KpnI Acc65I EcoRI SacI Eco53kI XhoI PspXI XmaI SmaI BamHI XbaI SalI PstI HindIII StuI MscI 1000 pexg2.seq 5084 bps BpmI XmnI PfoI BmrI BstAPI NdeI SapI 5000 BssSI Origin of Replication BseYI GsaI AlwNI BspHI AhdI MreI SgrAI EagI EcoRV BseRI BsrDI BglII PsiI SnaBI SacII LA AmpR NheI BmtI GentamicinRes RA

63 Pierre Stallforth // HKI Jena Vektoren - Plasmide Resistenz

64 Pierre Stallforth // HKI Jena Vektoren - Plasmide Resistenz

65 Pierre Stallforth // HKI Jena Vektoren - Plasmide PacI AseI FspAI FspI EcoO109I PpuMI BbsI BspEI Eco47III KpnI Acc65I EcoRI SacI Eco53kI XhoI PspXI XmaI SmaI BamHI XbaI SalI PstI HindIII StuI MscI 1000 pexg2.seq 5084 bps BpmI XmnI PfoI BmrI BstAPI NdeI SapI 5000 BssSI Origin of Replication BseYI GsaI AlwNI BspHI AhdI MreI SgrAI EagI EcoRV BseRI BsrDI BglII PsiI SnaBI SacII LA AmpR NheI BmtI GentamicinRes RA

66 Pierre Stallforth // HKI Jena Zusammenfassung Sequenzierung: Bakterielle Genome können heutzutage kommerziell sequenziert werden (Next Gen Seq) Bioinformatik: Antismash Vorhersage von Biosyntheseclustern BLAST Homolge Sequenzen in anderen Organismen

67 Pierre Stallforth // HKI Jena Zusammenfassung Diff. Metabol. : Welche Metabolite werden vom Wildtyp, welche von Mutanten hergestellt? Mol. Bio.: Gendeletionen, etc...

68 Pierre Stallforth // HKI Jena Was gibt es noch an Möglichkeiten? Transposons: Mobile gen. Elemente, die willkürlich in das Genom integriert werden. (Random Transposon Mutagenesis) CRISPR-Cas9: Cutting-edge...