Erstes Massenspektrometer 1897 durch J.J. Thomson

Transkript

1 1 Massenspektrometrie Wie schwer ist ein Molekül? Wie viel?

2 Erstes Massenspektrometer 1897 durch J.J. Thomson Thomson J.J. On the Masses of the Ions in Gases at Low Pressures Philosophical Magazine, 1899, 48:95, p

3 3 Aufbau eines Massenspektrometers Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Analysator Detektor Tiegeleinlaß Gaschromatograph GC Schleifeneinlass Nanospray HPLC Matrixpräparation u.v.a Elektronenstoß EI Chemische Ionisation CI Elektrospray ESI APCI Laserdesorption/ ionisationldi MALDI Feldionisation Sektorfeld-MS Quadrupol-MS Flugzeit-MS Ionenfalle ICR-FT-MS Sekundärelektronenvervielfacher SEV Faraday Käfig u.v.a

4 Substanzeinlass 4 Direkteinlass, Schubstange, Tiegeleinlass, direct inlet Für alle Substanzen geeignet, die unzersetzt ins Hochvakuum verdampft werden können.

5 Substanzeinlass 5 Gaschromatograph, GC-MS-Kopplung MS GC Für alle Substanzen und Substanzgemische geeignet, die unzersetzt den Gaschromatographen passieren.

6 Ionenquelle 6 Elektronenstoßionenquelle, electron impact ion source +3000V 0V Für alle Substanzen geeignet, die gasförmig in den Quellenraum gebracht werden können. Es muss mit Fragmentierungen gerechnet werden. Einfache Ionenquelle CH7A

7 Analysator 7 Doppeltfokussierendes Sektorfeldmassenspektrometer Magnetfeld m/z höhere größer Geschwindigkeit Elektrisches Feld m/z kleiner Ionenbahn Eintrittsspalt Ionenquelle Austrittsspalt Detektor

8 Detektor 8 Sekundärelektronenvervielfacher SEV, secondary electron multiplier SEM Ionen Elektronen V 100V Hoher Verstärkungsfaktor >10 6 geringes Eigenrauschen, schnell.

9 Detektor 9 Das Detektorsignal liefert dreickes- oder gaussförmige Peaks. Diese werden (meist) in der anschließenden Datenverarbeitung zu m/z - Intensitäts Paaren reduziert. STUDER KM 80RP-P 1 (0.35) Scan ES+ 1.7e7 Gemessenes Spektrum Rohdaten % STUDER KM 80RP-P 1 (0.35) Cn (Cen,3, 90.00, Ht); Sm (SG, x0.60) e7 Strichspektrum % m/z

10 Isotopie 1 0 Viele Elemente bestehen aus mehreren Isotopen Die Masseneinheit ist Dalton Da (Amu) und entspricht 1/1 der Masse von 1 C 1 C 98,9% 35 Cl 75,7% 79 Br 50,7% 81 Br 49,3% 3 S 95% 37 Cl 4,3% 13 C 1,1% 34 S 4,% Kohlenstoff Chlor Brom Schwefel Das stöchiometrische Atomgewicht (average mass) ist das gewichtete Mittel der Isotopeneinzelgewichte 1,011 35,46 79,9 3,06 Auch die Massen der reinen Isotope sind nicht ganzzahlig (Ausnahme 1 C) 1, , , , ,0081 3, , , ,9673

11 Massenbegriffe Definitionen 1 1 Molekulargewichtsdefinitionen (nach IUPAC) Das stöchiometrisches Molekulargewicht (average mass) ist die Summe der Atomgewichte. Darin sind die mit ihrer Häufigkeit gewichteten Isotope enthalten. Das nominale Molekulargewicht ist die Summe der gerundeten Isotopenmassen (der häufigsten Isotope). Das monoisotopische Ion ist die Kombination der häufigsten Isotope. Es ist nicht notwendigerweise der intensivste Peak eines Isotopenclusters. Eine Massenangabe wird als exakte Masse bezeichnet, wenn sie mit einer Präzision von +-5ppm (oder +-5mDa) bestimmt oder berechnet wurde. STUDER MRB 458-Y-D3 1 (0.394) Cn (Cen,3, 90.00, Ar); Cu (0.40); Is ( e1 Beispiel: CHCl 3 % mass Stöchiometrische Masse 1,01 + 1,01 + 3x35,46 = 119,39 Da Monoisotopische Masse 1,00 + 1, ,9683 = 117,91438 Da Nominalmasse (des 1. Peaks) x35 = 118 Da

12 Isotopie 1 Berechnungsbeispiele für die Intensitätsverteilung von mehratomigen Ionen. (Zur Vereinfachung werden hier Nominalmassen verwendet): C 10 H 0 O 3 N Die Elemente H, O, N bestehen im Wesentlichen aus einem Isotop, lediglich der Kohlenstoff besitzt zwei Isotope. Monoisotopischer Peak: 10*1 + 0*1 + 3*16 + *14 = Isotopenpeak 9*1 + 1*13 +0*1 + 3*16 + *14 = 17 Für jedes einzelne C-Atom besteht die Wahrscheinlichkeit von 1,1% dass es 13C ist, die Intensität des 1.Isotopenpeaks (m/z 17) ist also 10*1,1 = 11% des Peaks bei m/z Unregistered 1 C 10 H 0 O 3 N C 9 13 C 1 H 0 O 3 N

13 Isotopie 1 3 Berechnungsbeispiele für die Intensitätsverteilung von mehratomigen Ionen. (Zur Vereinfachung werden hier Nominalmassen und gerundete Intensitäten verwendet): CHCl 3 Unter Berücksichtigung der C und Cl Isotope besteht der Isotopencluster aus den Massen: 1*1 + 1*1 + 3*35 = 118 1*13 + 1*1 + 3*35 = 119 1*1 + 1*1 + *35 + 1*37 = 10 1*13 + 1*1 + *35 + 1*37 = 11 1*1 + 1*1 + 1*35 + *37 = 1 1*13 + 1*1 + 1*35 + *37 = 13 1*1 + 1*1 + 3*37 = 14 1*13 + 1*1 + 3*37 = Unregistered Die Intensitätsverteilung die durch die Cl Isotopie entsteht, kann über eine Binominalformel errechnet werden. Das 35Cl/37Cl Verhältnis ist etwa 7,6/,4 (a=7,6; b=,4). Die Glieder der Formel entsprechen den Intensitäten. (a+b)^3 =a^3 + 3*a^ *b + 3*a*b^ + b^3 = 7,5^3 + 3*7,6^ *,4 + 3*7,6*,4^ +,4^3 = wenn man auf 438 = 100% normiert ergibt sich als Intensitätsverteilung. Die Peaks die durch die 13 C Isotope hervorgerufen werden besitzen jeweils 1*1,1 der Intensität des 1 C Peaks.

14 Isotopie 1 4 Für die Isotopenclusterberechnung gibt es verschiedene Computerprogramme, u.a. das Program IsoPro, welches als Freeware aus dem Netz erhältlich ist. Mit der Molekülgröße wächst auch die Wahrscheinlichkeit für seltene Isotope. Bei 100 C-Atomen ist der 13 C Peak bereits größer als der monoisotopische Peak. (100*1,1 = 110%) Unregistered C 100 H

15 Massenangaben 1 5 Rundungsproblematik bei m/z > 400 Gemessene m/z Werte als Ganzzahl (Nominal) anzugeben, macht nur bis ca. m/z 400 Sinn. Ab diesem Massenbereich kann es zu Rundungsproblemen kommen, wie das Beipiel zeigt. Formel gemessen gerundet Nominal(ber.) C8H C18H C38H C6Br

16 Auflösungsvermögen 1 6 Das Maß für die Fähigkeit benachbarte Peaks zu trennen, wird als Auflösung(svermögen) bezeichnet. Zwei Definitionen sind verbreitet: 1. Die 10% Tal Definition Sind zwei Peaks durch ein Tal von 10% der mittleren Peakhöhe getrennt, so ist die Auflösung das Verhältnis des Massenabstands zur mittleren Masse. m=1 R 10%Tal = m/ m = % 1.09 m=1093

17 Auflösungsvermögen 1 7. Die FWHM (full width half mass) Definition Die Auflösung (FWHM) ist der Quotient aus Masse und Peakhalbwertsbreite m=0,5 R FWHM = m/ m = 198/0,5 = m=198

18 Auflösungsvermögen 1 8 Das Auflösungsvermögen, mit dem ein Spektrum gemessen wurde, entscheidet, welche Massendefinition verwendet werden muss. Beziehen sich die Massenangaben auf einzelne Linien des Isotopenclusters, so sind die reinen Nuklide als die Berechnungsgrundlage zu verwenden. Verschmelzen die Isotopenpeaks durch mangelnde Auflösung, ist die stöchiometrische Massenberechnung zu verwenden Unregistered C 100 H 00 Br Unregistered C 100 H 00 Br ausreichende Einzelmassenauflösung Isotopencluster nicht aufgelöst

19 Auflösungsvermögen 1 9 Hochauflösung Befinden sich auf der gleichen Nominalmasse zwei oder mehr Ionen verschiedener Elementarzusammensetzung, so muß die Auflösung des Massenspektrometers besonders erhöht werden, um diese unabhängig voneinander bestimmen zu können. Bei Werten von R 10%Tal > spricht man von Hochauflösung Unregistered C 19 H 36 O C 0 H 40 m/z m/z Massenunterschied 0,037Da notwendige Auflösung 80/0,037= 7500

20 Ionisationsverfahren 0 Bei der Elektronenstoßionisation (EI) wird die Substanz im Vakuum mit 70eV Elektronen beschossen. Der größte Teil der Energie wird nicht auf das Molekül übertragen. Lediglich 6-10eV dienen zur Ionisation nach dem Schema: M + e - M +. + e - 1eV = 96kJ/Mol Darüber hinaus werden noch -10eV Energie (sog. Überschußenergie) auf das Molekül übertragen. Das führt zur Anregung des Moleküls und zur Fragmentierung. Ein EI-Spektrum ist die Auftragung der Häufigkeit der im Zeitraum von 10-8 s gebildeten Ionen gegen ihren m/z Wert (bei z=1 entspricht das der Masse). M +. - R. - N F +. F1 + - R. - N - R. - N F'1 + F' + F'

21 Elektronenstoßionisation EI, electron impact ionization 1 R 1 R +. CH 3 +. H 3 C - - R. R 1. CH 3 R + 1 R + - CH 3 - H 3 C CH CH 3 H 3 C CH + H C + CH3 CH 3 Das energetisch günstigere Kation entsteht bevorzugt. m/z 85 m/z 43 Das energetisch günstigere Radikal wird abgespalten

22 Elektronenstoßionisation EI, electron impact ionization α-spaltung +. R 1 R X R H 3 C O CH R 1 R X R - C - H 3 CH CH 3 R 1. + R X R C H + O CH 3 H 3 C O + CH m/z 59 m/z 87 Radikalisch induzierte Spaltung ausgehend von einem Heteroatom.

23 Elektronenstoßionisation EI, electron impact ionization 3 α-spaltung

24 Stickstoff- und Doppelbindungsregel 4 Stickstoffsregel Ist das Molekülion geradzahlig, so enthält das Molekül keinen Stickstoff oder eine gerade Anzahl von N-Atomen. Ist das Molekülion ungeradzahlig enthält es eine ungerade Zahl von N-Atomen Doppelbindungsregel nc, nh, nn = Anzahl der Atome Die Zahl der Doppelbindungen und/oder Ringe lässt sich mit berechnen: DBE = nc * + nh Wenn Stickstoff anwesend ist, muss das berücksichtigt werden: DBE = nc * + + nn nh

25 Elektronenstoßionisation EI, electron impact ionization 5 α-spaltung O +. α-spaltung ausgehend von einer Ketogruppe. H 3 C CH 3 Das größere Radikal wird bevorzugt abgespalten. - CH H 3 C - C H CH 3 H 3 C O + O + CH 3 m/z 71 m/z 57

26 Elektronenstoßionisation EI, electron impact ionization 6 Benzylspaltung Die Benzylspaltung führt zu dem sehr gut stabilisierten Benzylkation, das mit dem Tropyliumkation im Gleichgewicht steht. m/z 134 CH H C CH 3 CH + CH + m/z 91

27 Elektronenstoßionisation EI, electron impact ionization 7 Eine häufige Fragmentierungsart ist die Abspaltung stabiler Neutralteilchen. Differenz Struktur (Da) 18 H O OH M+. - H O 0 HF 7 HCN 8 CO, C H 4 m/z CH 3 OH C H 3 m/z 14 CH3 -CH4 -C3H6 Es gibt bei Alkylionen keine Abspaltung von Methylen (=14Da).

28 Elektronenstoßionisation EI, electron impact ionization 8 McLafferty-Umlagerung Die McLaffertyumlagerung erfordert die Anwesenheit eines Wasserstoffs in γ-position H 3 C H O +. Sie kann u.a. durch Doppelbindungen, Aromaten, Carbonyl- und Estergruppen ausgelöst werden. m/z 114 CH 3 H 3 C - CH +. OH CH 3 H C m/z 7

29 Elektronenstoßionisation EI, electron impact ionization 9 Säure+1 Spaltung H 3 C O Doppelte Wasserstoffübertragung führt zum Säure+1 Peak. m/z 00 O +. H CH 3 Diese Fragmentierung findet auch bei Phosphorsäureestern und Ethern statt. H 3 C O H O + HC CH 3 * H - H C CH CH 3 H 3 C OH m/z 117 H O + * Der Wasserstoff kann aus verschiedenen Positionen übertragen werden.

30 MALDI, matrix assisted laser desorption ionization 3 0 MALDI* Die Probe wird, mir einer Matrixsubstanz (1:50 bis 1:10000) gemischt, gemeinsam auf einen Probenträger gegeben, und ins Vakuum eingeschleust. Durch einen kurzen Laserpuls (3ns, 337nm) wird die Matrix verdampft und nimmt dabei Probenmoleküle mit. Probenträger mit Matrixspots In dieser Verdampfungswolke entstehen Ionen, die im anschließenden Analysator getrennt werden. Typische Matrixsubstanzen O OH O O N HO OH HO N H OH 3 C O HO H 3 C O OH H 3 C H 3 C CH 3 CH 3 N DHB 4-HCCA SA DCTB * Diese Methode wurde 1988 in Münster durch M.Karas und F.Hillenkamp entwickelt.

31 MALDI, matrix assisted laser desorption ionization 3 1 Eigenschaften des MALDI Prozesses Bei der Ionisation werden im Gegensatz zur Elektronenstoßionisation keine Radikalkationen erzeugt, sondern es entstehen Ionen mit gerader Elektronenzahl. positiv negativ [M+H]+ [M-H]- M [M+Na]+ M [M+Cl]- [M+K]+ Weil der gefundene m/z Wert nicht gleich dem Molekulargewicht ist, spricht man von Pseudomolekularionen. Die Überschußenergie ist wesentlich geringer, s.d. man überwiegend intakte Pseudomolekularionen beobachtet. Die Ionisation ist hervorragend für große Moleküle geeignet (Peptide, Proteine DNA, RNA Fragmente, Oligomere)

32 MALDI, matrix assisted laser desorption ionization 3 Flugzeitmassenspektrometer, time of flight ms TOF Wegen der impulsartigen Ionenproduktion eignet sich für die MALDI ein Flugzeitmassenspektrometer als Analysator besonders gut. Laserimpuls Flugrohr (Länge l) Detektor Gitter auf 0V Probe auf Hochspannung (U) ca. 0kV Intensität E pot e * = U 1 1 E = kin * mv e * U = * mv t v = * e * U m t = l* m * e* U

33 MALDI, matrix assisted laser desorption ionization 3 3 TOF Elektronik Digitalisierer Ionenquelle Probe Schubstange Detektor Flugrohr Laser optische Bank Lazarus IIIDE

34 MALDI, matrix assisted laser desorption ionization 3 4 MALDI Spektrum einer basischen Verbindung C 30 H 43 NO Matrix=DHB LAZARUS III DE HOPPE_WBZ547_B 1 (0.100) Sb (,1.00 ) Nov-004 Scan EI+ 3.15e3 MW % m/z Als Matrix wurde,5-dihyroxybenzoesäure verwendet. Unter günstigen Umständen (wie diesen) sieht man nur den Pseudomolekularpeak der Probe.

35 MALDI, matrix assisted laser desorption ionization 3 5 MALDI für hohes Probenaufkommen Die Messung eines MALDI Spektrums ist in wenigen Sekunden möglich. Durch die Verwendung von Targets mit vielen Probenpositionen kann eine grosse Zahl von Substanzen in kurzer Zeit gemessen werden. Das macht man sich vor allem bei der Untersuchung von Proteinen und Peptidgemischen zu Nutze. Target mit 16x4 = 384 Probenpositionen

36 MALDI, matrix assisted laser desorption ionization 3 6 MALDI Spektrum eines Polymers LAZARUS IIIDE M atrix= DH B Q u a ttro L C 1 -N ov -004 T E S T 1 ( ) S m (S G, x.0 0 ); S b (,1.0 0 ) S ca n E I e Jeder Peak ist das Pseudomolekularion eines Oligomerbestandteils (im abgebildeten Bereich ca. 100 verschiedene MWs) % m /z Matrix= DHB Quattro LC LAZARUS IIIDE 1-Nov-004 Aus dem Spektrum kann man die Verteilung und die Masse der Polymereinheit und der Endgruppen ermitteln. TEST 1 (0.100) Sm (SG, x.00); Sb (,1.00 ) % Scan EI e m/z

37 ES(I) Elektrospray (ionisation) 3 7 Elektrosprayprozess schematisch Tröpfchen mit positiver Überschußladung Kapillare 1-4kV Gegenelektrode 0V Lösung ml/min Ionen negativ Ionen positiv Oxidationsprozess Lösungsmittel und entladene Ionen zum Analysator 1 bar 0.1 mbar

38 ES(I) Elektrospray (ionisation) 3 8 Elektrosprayionenquelle

39 ES(I) Elektrospray (ionisation) 3 9 Elektrosprayionenquelle geöffnet

40 ES(I) Elektrospray (ionisation) 4 0 Für kleine Substanzmengen ist das Nanosprayverfahren vorteilhaft. 1cm Sehr feine Spitze Kontaktierung (0.6-kV) Kapillare mit 10ul Probenlösung Für eine automatische Probenzuführung eignet sich die HPLC-MS-Kopplung HPLC- Pumpe Autosampler Dosierventil Trennsäule ESI-MS

41 ES(I) Elektrospray (ionisation) 4 1 ESI Spektrum einer basischen Verbindung (Probe in MeOH gelöst, Schleifeneinlass) Es sind nur die Pseudomolekularionen bei m/z [M+H] + m/z [M+Na] + sichtbar, es entstehen meist keine Fragmente. C 30 H 43 NO MW Intens. x10 6 +MS, 0.6min #(14) m/z

42 ES(I) Elektrospray (ionisation) 4 ESI Spektrum eines Methylierungsprodukts O N OH NaH THF O N O CH3 CH3I Monoisotopic Mass = Da Monoisotopic Mass = Da Intens. x [M+Na] + +MS, Profile, min #(14-16) Die milden Bedingungen der ES-Ionisation führen dazu, dass auch Komplexe wie [n*m+na] + bestehen bleiben (sog. Coulomboligomere). 4 0 [M+H] + [M +Na] [M+Na] + [M+M +Na] m/z

43 ES(I) Elektrospray (ionisation) 4 3 ESI Spektrum von Cytochrom C MW > Es bilden sich die mehrfach protonierten Pseudomolekularionen Große Moleküle können viele Ladungen an sich binden, so dass man Serien von vielfach geladenen Spezies beobachtet. Beachte, daß die x-achse m/z ist. Ist z=,3,4...so erscheint der Peak der Masse M bei dem 1/, 1/3, 1/4... m/z Wert. Intens. x MS, 1.8min # m/z

44 ES(I) Elektrospray (ionisation) 4 4 ESI Spektrum von Cytochrom C MW 1358 Das Problem ist, dass man die Ladungsmultiplizität zunächst nicht kennt. Man kann sie wie folgt berechnen (bei Protonierung): m1 = (M + n)/n m = (M + n + 1)/(n + 1) durch Einsetzen folgt n = (m - 1)/(m1 - m) und M = n*(m1-1) m1, m sind m/z Werte benachbarter Peaks, M ist das ungeladene Molekül Intens. x MS, 1.8min # m/z

45 Datenerfassung und Darstellung 4 5 Bei MS-Messdaten kann man verschiedene Typen unterscheiden: 1. Einzelspektren - sie fallen typischerweise bei MALDI und ESI-Messungen von Einzelsubstanzen an.. Spektrenserien - hierbei erfolgt die Aufnahme cylisch und alle Spektren werden gespeichert. Das wird bei chromatographischen Einlaß (GC oder HPLC) eingesetzt. Auch beim Schubstangeneinlass werden Serien gemessen, um den zeitlichen Verlauf der Verdampfung rekonstruieren zu können. 3. Chromatographische Daten von Einzelmassen oder Massenbereichen - hierbei werden nicht die gesamten Massenspektren aufgenommen, sondern man beschränkt sich auf einzelne m/z-werte (oder Bereiche). Dies verbessert die Empfindlichkeit, denn man verbringt nur Zeit auf den vorher ausgewählten nützlichen Ionen. Diese Daten können auch aus Spektrenserien rekonstruiert werden, dann hat man allerdings keinen Empfindlichkeitsgewinn.

46 Datenerfassung und Darstellung 4 6 Beispiel für ein Einzelspektrum Probe in MEOH/CHCL3 LUFTMANN HLU MCD-A 1 (0.605) 100 QUATTRO LCZ Nov-004 Scan ES+ 5.17e6 % m/z Einlass: Ionisation: Analysator: Nanospray Elektrosprayionisation Quadrupol

47 Datenerfassung und Darstellung 4 7 Beispiel für eine Spektrenserie (GC-MS) Sajitz 5m HP uL 1:40 W uerthw ein M S M E 08_GCT 100 Q U ATTRO LCZ 9. TO F M S EI+ TIC 1.84e4 % Scan Sajitz 5m HP uL 1:40 Q U ATTRO LCZ 15-Dec-004 W uerthw ein M S M E 08_GCT 351 (9.16) TOF M S EI+ 5.69e3 % m /z Einlass: Ionisation: Analysator: Gaschromatograph Elektronenstoss Flugzeit

48 Datenerfassung und Darstellung 4 8 Chromatographische Daten Einlass: Schleifeneinlass (HPLC-Autosampler) Ionisation: Elektrospray Analysator: Flugzeit Darstellung: Die chromatographischen Kurven sind aus der Spektrenserie rekonstruiert. Intens. x x x spuel-pos_tray1-1_01_7509.d: TIC +All MS TIC = Summe aller Signale spuel-pos_tray1-1_01_7509.d: EIC All MS m/z 7 spuel-pos_tray1-1_01_7509.d: EIC All MS m/z Time [min] Intens. x MS, min #(3-6) 1 0 x MS, min #(14-16) m/z

49 Seminar zum Einführungskurs Massenspektrometrie Quadrupolanalysator 4 9 Lineares Quadrupolmassenspektrometer D Frontansicht Seitenansicht

50 Seminar zum Einführungskurs Massenspektrometrie Quadrupolanalysator 5 0 Normal(scan)betrieb eines Triplequads Ionenquelle Quadrupol 1 Stosskammer Quadrupol Detektor Tochterionenmodus Ionenquelle Quadrupol 1 Stosskammer Quadrupol Detektor Nur ein m/z Fragmentierung

51 Seminar zum Einführungskurs Massenspektrometrie Tochterionensprktrum 5 1 Intens. x O Luftmann_KD78_0.d: +MS, 138.3min (#) Monoisotopic Mass = Da m/z 130 O CH 3 3 HN H m/z 104 C H 3 NH O 1 0 x H m/z 14 Luftmann_KD78_03.d: +MS(343.4), min (#) Tochterionenspektrum von m/z 343, m/z

52 Literaturhinweise 5 Interpretation von Massenspektren F. W. McLafferty, F. Turecek, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Mass Spectrometry - A Textbook Jürgen H. Gross, Springer Berlin, Heidelberg NY 004. Electrospray Ionization Mass Spectrometry Richard B. Cole, John Wiley & Sons, Inc. NY, Weinheim MALDI-TOF Mass Spectrometry of Synthetic Polymers H. Pasch und W. Schrepp, Springer Berlin, Heidelberg, NY 003. Practical Implications of some recent Studies in Electrospray Ionization Fundamentals Nadja B. Cech and Christie G. Enke, Mass Spectrometry Reviews (001) 0, Isopro Programm