E MOLEKULARBIOLOGIE ZELLULÄRE METHODEN. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998

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1 ZELLULÄRE METHODEN E MOLEKULARBIOLOGIE 98

2 E - 1 CLAUDIA MEENZEN, SANDRA REICHSTETTER UND RALF WASSMUTH E DNA-Extraktion im großen Maßstab E Phenolextraktion Ref.: Modifiziert nach: Maniatis T, Sambrook J, Fritsch EF in : Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) E Reagenzien und Lösungen Saccharose-Puffer 0,32 M Saccharose - 109,5 g 10 mm Tris-HCl - 10 ml (1 M, ph 7,4) 5 mm MgCl 2-5 ml (1 M) 1 % Triton X ml ad 1000 ml H 2 O bidest., dann sterilfiltrieren bei 4 C aufbewahren Lysis-Puffer I 0,25 M Saccharose - 85,6 g 10 mm Tris-HCl - 10 ml (1 M, ph 7,4) 2 mm CaCl 2-20 ml (0,1 M) 30 mm NaCl - 6 ml (5 M) 0,1 % Triton X ml ad 1000 ml H 2 O bidest., dann sterilfiltrieren bei 4 C aufbewahren Suspensions-Puffer 10 mm Tris-HCl - 5 ml (1 M, ph 8,0) 2 mm EDTA - 2 ml (0,5 M, ph 8,0) 10 mm NaCl - 1 ml (5 M) ad 500 ml H 2 O bidest., dann sterilfiltrieren Proteinase K, 2 % (20 mg/ml) Proteinase K mg 50 mm Tris-HCl µl (1 M, ph 8,0) 1 mm CaCl 2-10 µl (1 M) ad 10 ml H 2 O bidest, dann sterilfiltrieren bei 4 C aufbewahren Stammlösungen Chloroform/Isoamyl- Ethanol, 99,5 % Ethanol, 80 % Alkohol (24:1) NaAc, 3 M Phenol [ph 8,0] TE-Puffer, 10 x [ph 7,4] 99

3 E Durchführung 1) Heparin- oder Citratblut (20 ml) in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführen und mit eiskaltem Saccharose-Puffer auf 50 ml auffüllen; bei 4 C und 1000 x g 10 min zentrifugieren. 2) Überstand verwerfen und Pellet in 40 ml eiskaltem Saccharose-Puffer resuspendieren; Ansatz erneut bei 4 C und 1000 x g 10 min zentrifugieren. 3) Überstand verwerfen, Pellet in 5 ml eiskaltem Lysis-Puffer I resuspendieren und mit dem selben Puffer auf 50 ml auffüllen; Ansatz 10 min bei 4 C (auf Eis) inkubieren und nochmal 10 min bei 4 C und 1000 x g zentrifugieren. 4) Überstand verwerfen; die kernhaltigen Pellets können längere Zeit bei -20 C/-80 C aufbewahrt werden. 5) Pellet in ein 3 ml Reaktionsgefäß überführen und in 800 µl Suspensionspuffer resuspendieren. 6) 50 µl Proteinase K-Lösung zugeben und Ansatz unter Schütteln 3 h bei 55 C im Wasserbad inkubieren. 7) Gleiches Volumen Phenol [ph 8,0] zugeben, gut schütteln und 10 min bei RT rotierend inkubieren; anschließend 10 min bei RT bei 1000 x g zentrifugieren. 8) Überstand (wäßrige Phase) in ein neues 3 ml Reaktionsgefäß überpipettieren und die Phenolextraktion so oft wiederholen, bis keine weißliche Interphase mehr sichtbar ist. 9) Zum Überstand das gleiche Volumen Chloroform/Isoamylalkohol zugeben, gut schütteln und 10 min bei RT bei 1000 x g zentrifugieren. 10) Überstand abnehmen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. 11) Ein Zehntel des Volumens an kaltem 3 M NaAcetat und das 2-3fache Volumen an eiskaltem 99,5 % Ethanol zugeben, gut mischen und 10 min auf Eis inkubieren. 12) Die präzipitierte DNA mit einer Pipettenspitze in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 1000 µl eiskaltem 80 % Ethanol überführen und die DNA 15 min bei 4 C und x g pelletieren. 13) Überstand abnehmen und Pellet an der Luft trocknen lassen oder in der Vakuumzentrifuge trocknen. 14) Pellet in 200 µl TE-Puffer [ph 7,4] lösen und bei 4 C/-20 C/-80 C aufbewahren. 100

4 E Aussalz-Protokoll (I) Ref.: Modifiziert nach: Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F.: A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research 16: (1988) E Reagenzien und Lösungen 2 M Tris-HCl (ph 7.6) 121 g Tris ad 500 ml H 2 O dest ph 7.6 mit HCl einstellen, autoklavieren 1 M Tris-HCl (ph 8.0) 60,5 g Tris ad 500 ml H 2 O dest ph 8.0 mit HCl einstellen, autoklavieren 5 M Mg Cl 2 102,6 g MgCl 2 x 6H 2 O ad 100 ml H 2 O dest., autoklavieren 3 M NaCl 87,66 g NaCl ad 500 ml H 2 O dest., autoklavieren 6 M NaCl 175,32 g NaCl ad 500 ml H 2 O dest., autoklavieren 0,4 M EDTA 14,9 g EDTA ad 100 ml H 2 O dest., autoklavieren 10 % SDS-Lösung 50 g SDS ad 500 ml H 2 O dest. 10x SLR-Puffer (Red Cell Lysis Buffer) 100 mm Tris ph ml 2 M Tris (ph 7.6) 50 mm MgCl 2 5 ml 5 M MgCl mm NaCl 16,6 ml 3 M NaCl ad 500 ml H 2 O dest., autoklavieren NLB-Puffer ( Nuclei Lysis Buffer) 10 mm Tris ph ml 1 M Tris (ph 8.0) 400 mm NaCl 13,3 ml 3 M NaCl 2 mm EDTA 500 µl 0,4 M EDTA ad 100 ml H 2 O dest., autoklavieren PSB (Proteinase Stock Buffer) 1% SDS 0,5 ml 10% SDS 2 mm EDTA ph µl 0,4 M EDTA ad 50 ml H 2 O dest., sterilfiltrieren Proteinase K-Lösung 100 mg Proteinase K (Boehringer Mannheim) in 50 ml PBs Tris-Puffer 1 mm Tris ph µl 1 M Tris (ph 8.0) ad 500 ml H 2 O dest., autoklavieren Stammlösungen Ethanol 100% Ethanol 70% E Durchführung 1) EDTA- oder Heparin-Blut (2-10 ml) in sterile Röhrchen (15 ml oder 50 ml) überführen und 10 min bei 450 x g zentrifugieren, anschließend Überstand verwerfen. 2) Pellet in 50 ml (bzw. 15 ml) 1 x SLR resuspendieren. 101

5 3) Ansatz erneut 10 min bei 450 x g zentrifugieren, anschließend Überstand verwerfen. 4) Die beiden letzten Schritte wiederholen bis das Pellet weiß ist. 5) Pellet in 3 ml NLB resuspendieren, 600 µl PSB+Proteinase K-Lsg. und 200 µl 10% SDS zugeben, über Nacht bei 37 C inkubieren (Schüttelwasserbad) oder bei -20 C einfrieren (Weiterverarbeitung nach 4 Wochen noch möglich). 6) Danach 750 µl 6 M NaCl zugeben und gut mischen. 7) Anschließend 20 min bei 4 C inkubieren und anschließend 25 min bei 1800 x g zentrifugieren. 8) Überstand in ein steriles 15 ml Röhrchen überführen. 9) Im Verhältnis 2:1 eiskalten 100%igen Ethanol zugeben und so lange schwenken, bis die DNA ausfällt. 10) Die ausgefallene DNA mit einer Pasteurpipette in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführen und 2 x mit eiskaltem 70%igem Ethanol waschen. 11) DNA an Luft trocknen lassen und anschließend in Tris-Puffer (ph 8.0) aufnehmen. 12) Die gelöste DNA bei -20 C aufbewahren. 102

6 E NaCl-Aussalz-Protokoll für hochmolekulare DNA Ref. Modifiziert nach: Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F.: A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research 16: (1988) E Reagenzien Erythrozyten-Lyse-Puffer, 5 x 1,6 M Saccharose 5 % (v/v) Triton X mm MgCl 2 6 H 2 O 60 mm Tris-HCl [ph 7,5] Proteinase K-Puffer, 5 x 0,375 M NaCl 0,12 M EDTA [ph 8,0] sterilfiltrieren (0,45 µm) Tris-Puffer 10 mm Tris-HCl [ph 7,4] Proteinase K-Lösung 10 mg/ml Proteinase K in H 2 O dest. sterilfitrieren (0,2 µm) Stammlösungen Ethanol, 99,5 % Ethanol, 70 % SDS, 20% NaCl, 6M E Durchführung 1) EDTA-, ACD- oder Heparin-Blut (20 ml) in einem 50 ml Röhrchen mit 40 ml Erythrozyten-Lyse-Puffer gut vermischen. 2) Anschließend 10 min bei RT mit 1200 x g zentrifugieren. 3) Überstand verwerfen und Pellet in 20 ml Erythrozyten-Lyse-Puffer resuspendieren. 4) Erneut 10 min bei RT mit 1200 x g zentrifugieren. 5) Überstand verwerfen, Röhrchen ca. 1 min auf dem Kopf stehen lassen. 6) Pellet in 160 µl 5 x Proteinase K-Puffer resuspendieren. 7) Ansatz in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 40 µl Proteinase K, 40 µl 20 % SDS und 300 µl H 2 O dest. zugeben (Endvolumen mit Pellet: 800 µl). 8) Ansatz unter leichtem Schütteln bei 37 C über Nacht oder bei 55 C für 2-4 h inkubieren; im zweiten Fall nach 1 h nochmal 20 µl Proteinase K zugeben; anschließend auf RT abkühlen lassen. 9) Danach 200 µl 5 M NaCl zugeben, gut schütteln und die präzipitierten Proteine 10 min bei x g pelletieren; anschließend den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen und nochmal 5 min bei x g zentrifugieren. 103

7 10) Den Überstand auf 2 Mikrozentrifugenröhrchen verteilen (ca. 450 µl/röhrchen) und bei RT 900 µl 100 % Ethanol zugeben und mischen; die DNA maximal 2 min präzipitieren lassen (DNA fällt als Knäuel aus). 11) Die beiden präzipitierten DNA-Knäuels in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 µl 70 % Ethanol enthält, vereinigen und die DNA 5 min bei x g abzentrifugieren; anschließend Ethanol abgießen und das DNA-Pellet an der Luft trocknen lassen. 12) Pellet anschließend in Tris-Puffer lösen und bei 4 C aufbewahren (nicht in TE, TE inhibiert Taq-Polymerase!). 104

8 E CTAB/DTAB-Protokoll Ref.: Gustincich S., Manfiolett G., Del Sal G., Schneider C., Carnici P.: A fast method for high quality genomic DNA extraction from whole human blood. Bio Techniques 11: (1991) E Reagenzien und Lösungen CTAB-Lösung, 5 % 5 % Cetyltrimethylammonium-Bromid 0,4 M NaCl bei RT aufbewahren DTAB-Lösung, 12% 12 % Dodecyltrimethylammonium-Bromid 2,25 M NaCl 150 mm Tris-HCl [ph 8,6] 75 mm EDTA bei RT aufbewahren Stammlösungen Chloroform Ethanol, 99,5 % Ethanol, 70 % NaCl, 1,2 M E Durchführung 1) EDTA- oder ACD-Blut (450 µl) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 450 µl 12 % DTAB-Lösung mischen. 2) Ansatz 5 min bei 68 C im Wasserbad inkubieren. 3) Anschließend 900 µl Chloroform zugeben, Ansatz gut schütteln und 2 min bei x g zentrifugieren. 4) Überstand (wäßrige Phase) in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen, das 100 µl 5% CTAB-Lösung und 900 µl H 2 O dest. enthält. 5) Ansatz durch Umkippen mischen bis ein DNA-CTAB-Präzipitat ausfällt, dann das Präzipitat 2 min bei x g abzentrifugieren 6) Überstand verwerfen und das DNA-CTAB-Pellet in 300 µl 1,2 M NaCl lösen 7) DNA durch Zugabe von 750 µl 99,5 % Ethanol ausfällen und 2 min bei x g abzentrifugieren 8) Überstand verwerfen, DNA-Pellet in 500 µl 70 % Ethanol resuspendieren und 2 min bei x g abzentrifugieren 9) Ethanol vorsichtig abpipettieren und Pellet an der Luft trocknen lassen oder in der Vakuumzentrifuge trocknen 10) Pellet in µl H 2 O dest. lösen und bei 4 C aufbewahren 105

9 E DNA Extraktion im kleinen Maßstab E IHWC Protokoll E Reagenzien und Lösungen Erythrozyten-Lyse-Puffer, 5 x 1,6 M Saccharose 5 % (v/v) Triton X mm MgCl 2 6 H 2 O 60 mm Tris-HCl [ph 7,5] Stammlösungen EDTA-Lösung, 5 % E Durchführung 1) Vollblut (200 µl; z.b. aus der Fingerkuppe) in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 µl 5 % EDTA-Lösung mischen und 5 sec bei x g zentrifugieren. 2) Überstand verwerfen, Zellpellet in 500 µl Erythrozyten-Lyse-Puffer resuspendieren und 5 sec bei x g zentrifugieren (= Waschschritt). 3) Überstand verwerfen und den Waschschritt mindestens zweimal wiederholen um das EDTA vollständig zu entfernen. 4) Pellet in 100 µl H 2 O dest. resuspendieren und Ansatz 5 min im kochenden Wasserbad inkubieren um Zellen und Kerne zu lysieren. 5) Ansatz 5 min bei x g zentrifugieren um Zell- und Kerntrümmer zu pelletieren. 6) Vom Überstand 2-5 µl zur DNA-Amplifikation einsetzen. 106

10 E NaCl-Aussalz-Protokoll Ref.: Olerup O., Zetterquist H.: HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens 39 (5): (1992) E Reagenzien und Lösungen Erythrozyten-Lyse-Puffer 0,32 M Saccharose 1 % (v/v) Triton X mm MgCl 2 (6 H 2 O) 12 mm Tris-HCl [ph 7,5] Proteinase-K-Puffer, 5 x 0,375 M NaCl 0,12 M EDTA [ph 8,0] Proteinase-K-Lösung 10 mg/ml Proteinase-K Stammlösungen SDS, 20 % Ethanol, 99,5% NaCl, 6 M E Durchführung 1) EDTA-Blut (500 µl) in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml Erythrozyten-Lyse- Puffer mischen und Ansatz 1 min bei x g zentrifugieren. 2) Überstand verwerfen, Pellet in 1 ml H 2 O dest. resuspendieren und Ansatz 1 min bei x g zentrifugieren; anschließend Überstand verwerfen. 3) Pellet in 80 µl 5 x Proteinase-K-Puffer, 30 µl Proteinase-K-Lösung, 20 µl 20 % SDS und 240 µl H 2 O dest. resuspendieren und Ansatz unter Schütteln 10 min bei 55 C inkubieren. 4) Anschließend 100 µl 6 M NaCl zugeben, Ansatz 15 sec schütteln und die ausgefällten Proteine 5 min bei x g abzentrifugieren. 5) Überstand in ein neues Mikrozentrfugenröhrchen überführen und 1 ml eiskaltes 99,5 % Ethanol zugeben (Ausfällen der DNA). 6) Präzipitierte DNA in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, das 100 µl H 2 O dest. enthält, überführen und DNA durch Vortexen (30 sec) lösen. 107

11 E Proteinase-K-Protokoll Ref.: Modifiziert nach : Higuchi R.: Rapid, efficient DNA extraction for PCR from cells or blood. Amplifications (2) Perkin Elmer Cetus (1989) E Reagenzien und Lösungen Saccharose-Puffer 0,32 M Saccharose - 9,5 g 10 mm Tris-HCl - 10 ml (1 M, ph 7,4) 5 mm MgCl 2-5 ml (1 M) 1 % Triton X ml ad 1000 ml H 2 O bidest., sterilfiltrieren bei 4 C aufbewahren PCR-TPK-Puffer 10 mm Tris-HCl - 1 ml (1 M, ph 8,3) 2,5 mm MgCl µl (1 M) 50 mm KCl - 5 ml (1 M) 0,1 mg/ml Gelatine - 10 mg 0,45 % Nonidet P-40-4,5 ml (10 %) 0,45 % Tween 20-4,5 ml (10 %) ad 100 ml H 2 O dest., ph 7,4 mit HCl einstellen und autoklavieren bei 4 C aufbewahren Proteinase K-Lösung, 2 % Proteinase K mg 50 mm Tris-HCl µl (1 M, ph 8,0) 1 mm CaCl 2-10 µl (1 M) ad 10 ml H2O dest., sterilfiltrieren bei 4 C aufbewahren E Durchführung 1) In einem Mikrozentrifugenröhrchen 500 µl Vollblut mit 500 µl Saccharose-Puffer mischen und 1 min bei x g zentrifugieren. 2) Überstand verwerfen, Pellet in 1 ml Saccharose-Puffer resuspendieren und zentrifugieren wie oben; diesen Lysisschritt so oft wiederholen, bis das Pellet kein Hämoglobin mehr enthält (weißes Pellet). 3) Pellet in 500 µl PCR-TPK-Puffer resuspendieren, 3 µl Proteinase K-Lösung zugeben und Ansatz gut mischen. 4) Ansatz 20 min bei 56 C inkubieren. 5) Ansatz 10 min bei 94 C inkubieren (Inaktivierung der Proteinase K). 6) Ansatz 5 min bei x g zentrifugieren (Abtrennung ungelöster Zellbestandteile). 7) DNA-haltigen Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei - 20 C/-80 C aufbewahren. 108

12 E Chelex-Protokoll Ref.: Singer-Sam J., Tanquay R.: Use of Chelex to improve the PCR signal from a small number of cells. Amplifications, A forum for PCR users (3), September 1989 E Reagenzien und Lösungen 5 % Chelex 5 g Chelex ad 100 ml H 2 O dest.in die Suspension einen Magnetrührfisch geben und immer unter Rühren pipettieren um eine gleichmäßige Verteilung der Chelex-Kügelchen zu gewährleisten E Durchführung 1) Vollblut (10-50 µl; 35 µl werden empfohlen) in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem H 2 O dest. mischen. 2) Ansatz 30 min bei RT inkubieren und während dieser Zeit einige Male schütteln oder leicht vortexen (= Lyse der Erythrozyten). 3) Ansatz 2-3 min bei x g zentrifugieren. 4) Überstand verwerfen, Zellpellet in 500 µl 1 x PBS-Puffer resuspendieren und erneut bei x g zentrifugieren. 5) Überstand bis auf µl abnehmen und die Zellen nochmal mit 500 µl 1 x PBS waschen und 2-3 min bei x g zentrifugieren. 6) Überstand bis auf µl abnehmen und das Zellpellet darin resuspendieren. 7) Volumen mit 5 %iger Chelex-Lösung auf ein Volumen von 200 µl auffüllen und gut mischen. 8) Ansatz 30 min bei 56 C inkubieren und anschließend 5-10 sec stark vortexen. 9) Ansatz 8 min bei 94 C inkubieren und anschließend 5-10 sec stark vortexen. 10) Ansatz 3 min bei x g zentrifugieren. 11) Bei 4 C aufbewahren; es ist empfehlenswert 25 µl des Überstandes für die PCR einzusetzen. 109

13 E Kommerzielle DNA-Extraktionssysteme E Selektive Lyse / Präzipitation E Prinizp Durch selektive Lyse der Erythrozyten und Leukozyten werden zunächst intakte Nuklei von PBMCs isoliert. Durch Zusatz chaotroper Substanzen und / oder Detergenzien werden die Proteine denaturiert und gefällt. Die jeweilige Protein-denaturierende Chemikalie ist von Hersteller zu Hersteller unterschiedlich. Alle unten aufgeführten Hersteller verzichten jedoch auf die Verwendung von Phenol und Chloroform. Bei manchen Systemen wird die anschließende Ethanolfällung der DNA durch die Bindung an eine Trägermatrix erleichtert. Dadurch wird die DNA-Ausbeute erhöht. Danach wird die DNA durch verschiedene Waschschritte gereinigt. E Kommerzielle Systeme und Hersteller* DESWAB, DEMIKRO und DEMAKRO medipro medizinische diagnostische produkte gmbh, Schwetzingen DNA Isolation kit for Mammalian Blood Boehringer Mannheim, Mannheim DNA MicroExtraktion Kit und DNA Extraktion Kit Stratagene GmbH, Heidelberg GenomeClean AGS Angewandte Gentechnik Systeme, Heidelberg InViSorb Genomischer DNA Kit PAN Systems GmbH, Aidenbach RapidPrep Genomic DNA Isolation Kits for Blood Pharmacia Biotech, Freiburg Wizard Genomic DNA Purification Boehringer Ingelheim, Heidelberg * Diese Liste ist eine Übersicht und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit E Affinitätschromatographie E Prinizp Nach der Lyse der Zellen des Ausgangsmaterials wird die DNA entweder an eine feste Matrix gebunden oder mit Ethanol ausgefällt. Anschließend wird diese unlösliche DNA auf eine 110

14 Chromatographiesäule aufgetragen, wo sie durch wiederholte Wasch- und Zentrifugationsschritte gereinigt wird. Durch Zugabe eines Elutionspuffers wird die DNA mittels Zentrifugation von der Säule gewaschen. E Kommerzielle Systeme und Hersteller* GlassMAX DNA Zentrifugationssäulen-Mikroisolierungs-System Life Technologies, Eggenstein QIAamp blood Kit QIAGEN GmbH, Hilden Micromix 200 und Micromix 660 Talent srl, Italien, in Deutschland vertrieben von LTF Labortechnik GmbH & Co.KG, Wasserburg * Diese Liste ist eine Übersicht und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit 111

15 E Magnetische Trennung E Prinizp Nach Lyse der Zellen des Ausgangsmaterials wird die DNA an die Oberfläche von paramagnetischen Polymerpartikeln gebunden. Mit Hilfe eines Magneten können die Partikel für sequentielle Waschschritte immobilisiert werden. Die DNA löst sich durch Zugabe eines Resupensionspuffers von der Oberfläche der Partikel. Sie kann entweder mit den magnetischen Partikeln in die PCR eingesetzt werden, oder diese werden zuvor mittels Magneten abgetrennt. E Kommerzielle Systeme und Hersteller* Dynabeads DNA DIRECT system II Deutsche Dynal GmbH, Hamburg Diese Liste ist eine Übersicht und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit 112