RESOLUTION OENO 24/2004 NACHWEIS VON EIWEISSSTOFFEN PFLANZLICHER HERKUNFT IN WEIN UND MOST

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1 NACHWEIS VON EIWEISSSTOFFEN PFLANZLICHER HERKUNFT IN WEIN UND MOST DIE GENERALVERSAMMLUNG, unter Bezugnahme auf Artikel 2, Paragraf 2 IV des Gründungsübereinkommens vom 3. April 2001 der Internationalen Organisation für Rebe und Wein auf Vorschlag der Unterkommission für Analyse- und Bewertungsmethoden für Wein BESCHLIESST, den Anhang A des Sammelwerks der internationalen Analysemethoden für Wein und Most durch folgendes Typ-IV-Verfahren zu ergänzen: NACHWEIS VON EIWEISSSTOFFEN PFLANZLICHER HERKUNFT IN WEIN UND MOST Die im Folgenden beschriebene Technik dient zur Mengenbestimmung von Proteinen pflanzlicher Herkunft, die eventuell nach dem Abziehen noch in behandeltem Most und Wein zurückbleiben. 1 PRINZIP Die Proteine des Mosts bzw. Weins werden mit Trichloressigsäure ausgefällt und anschließend durch eine Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) getrennt. Durch die Zugabe von Coomassie-Blau werden die Proteine gefärbt. Mittels der Färbungsintensität lässt sich der Proteingehalt anhand einer vorab mithilfe von Proteinlösungen mit bekannter Konzentration erstellten Eichkurve ermitteln. Die allergene Wirkung der behandelten Moste und Weine wird durch einen Immunblot-Test geprüft. 2 PROTOKOLL 2.1 Konzentrieren der Proteine durch Fällung mit Trichloressigsäure (TCA) Reagenzien Reine Trichloressigsäure ,1 %ige TCA, ausgehend von zubereitet: 0,1 g in 100 ml Wasser %ige TCA, ausgehend von zubereitet: 100 g in 100 ml Wasser ,5 M Natriumhydroxid ,25 M Tris/HCl Puffer mit ph = 6,8 30,27 g Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan werden in 300 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der ph-wert wird mit konzentrierter Salzsäure für Analysezwecke auf 6,8 gebracht. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzt. Der Puffer wird bei 4 C aufbewahrt Reines Glycerin Reines Natriumdodecylsulfat (SDS) Reines 2-Mercaptoäthanol 1

2 Pufferlösung für die Proben Sie besteht aus 0,25 M Tris/HCl-Puffer, ph=6,8 ( ), 7,5 % reinem Glycerol ( ); 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) ( ) und 5 % reinem 2-Mercaptoethanol ( ). Die Prozentanteile und Molarität der einzelnen Reagenzien entsprechen der Endkonzentration in der Pufferlösung Vorgehensweise Es werden nacheinander 3 ml 100 %ige Trichloressigsäure ( ) und 24 ml Wein (behandelt bzw. nicht behandelt) in 50 ml Röhrchen zum Zentrifugieren gegeben. Die auf diese Weise erzielte Endkonzentration an Trichloressigsäure beträgt 11 %. Nach 30-minütiger Kühlung bei 4 C werden die Proben 30 Minuten lang bei 4 C und mit U/m zentrifugiert. Die Rückstände werden mit einer wässrigen 0,1 %igen TCA-Lösung ( ) gewaschen, erneut zentrifugiert und in 0,24 ml einer Mischung (1:1, v/v) aus 0,5 M Natriumhydroxid ( ) und Pufferlösung für die Proben ( ) resuspendiert. Anschließend werden die Proben 10 Minuten lang bei 100 C im Wasserbad erhitzt. 2.2 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von SDS Reagenzien ,5 M Tris/HCl-Puffer ph=8,8 Es werden 181,6 g Tris-(Hydroxymethyl)Aminomethan in 300 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der ph-wert wird mit konzentrierter Salzsäure für Analysezwecke auf 8,8 gebracht. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzt. Der Puffer wird bei 4 C aufbewahrt Acrylamid (30 %) Bis-Acrylamid (0,8 %) Glycerin (75 %)-Mischung Vorsichtig 300 g Acrylamid und 8 g Bis-Acrylamid zu 600 ml 75 %iger Glycerinlösung hinzufügen. Nach Auflösen das Volumen mit 75 %igem Glycerol auf 1 l ergänzen. Die Mischung wird im Dunkeln und bei Raumtemperatur aufbewahrt %iges SDS Es werden 10 g SDS in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Bei Raumtemperatur aufbewahren Reines N,N,N,N -Tetramethylendiamin (TEMED) %iges Ammoniumpersulfat Es wird 1 g Ammoniumpersulfat in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Bei 4 C aufbewahren Bromphenol-Blau-Lösung Es werden 10 mg Bromphenol-Blau für Elektrophorese in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst. 2

3 Lösung für das Trenngel (15 % Acrylamid) Lösung kurz vor der Anwendung zubereiten: - 1,5 ml 1,5 M Tris/HCl, ph=8,8 ( ), - 1,5 ml destilliertes Wasser, - 3 ml Acrylamid-Glycerin-Mischung ( ), - 50 µl 10 %iges SDS ( ), - 10 µl N,N,N,N -Tetramethylendiamin (TEMED) für Elektrophorese ( ), - 20 µl Ammoniumpersulfat ( ). - 1 Tropfen Bromphenol-Blau ( ) ,5 M Tris/HCl Puffer, ph=6,8 Es werden 60,4 g Tris-(Hydroxymethyl)Aminomethan in 400 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der ph-wert wird mit konzentrierter Salzsäure für Analysezwecke auf 6,8 gebracht. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzt. Der Puffer wird bei 4 C aufbewahrt Acrylamid (30 %) Bis-Acrylamid (0,8 %) Wasser-Mischung Vorsichtig zu 300 ml Wasser 300 g Acrylamid und 8 g Bis-Acrylamid hinzufügen. Nach dem Auflösen das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzen. Die Mischung wird im Dunkeln und bei Raumtemperatur aufbewahrt Konzentrationsgel mit 3,5 % Acrylamid Gel kurz vor der Anwendung zubereiten: - 0,5 ml 0,5 M Tris/HCl, ph=6,8 ( ), - 1,27 ml destilliertes Wasser, - 0,23 ml Acrylamid-Wasser-Mischung ( ), - 20 µl 10 %iges SDS ( ), - 5 µl N,N,N,N -Tetramethylendiamin (TEMED) für Elektrophorese ( ), - 25 µl Ammoniumpersulfat ( ), - 1 Tropfen Bromphenol-Blau ( ) Laufpuffer Es werden 30,27 g Tris-(Hydroxymethyl)Aminomethan, 144 g Glycin und 10 g SDS in 600 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der ph-wert muss bei 8,8 liegen. Er wird bei Bedarf mit konzentrierter Salzsäure für Analysezwecke angepasst. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzt. Der Puffer wird bei 4 C aufbewahrt. Zur Anwendung wird die Lösung 1/10 in destilliertem Wasser verdünnt Färbelösung Nacheinander werden gemischt: - 16 ml 5 %iges G-250 Coomassie-Blau, hochglänzend, extrarein (5 g in 100 ml destilliertem Wasser), ml aus 1 l Lösung, in der 100 g Ammoniumsulfat und 13,8 ml 85 %ige Orthophosphorsäure für Analysezwecke aufgelöst wurden ml absolutes Ethanol für Analysezwecke. 3

4 Entfärbelösung Nacheinander werden gemischt: ml 100%iger Eisessig für Analysezwecke ml absolutes Ethanol für Analysezwecke ml destilliertes Wasser Vorgehensweise Die Lösung für das Trenngel ( ) wird zwischen zwei 7 x 10 cm große Glasplatten gegossen. Die Oberfläche des Gels wird durch Zugabe von 2 Tropfen destilliertem Wasser geglättet. Nach Polymerisieren des Trenngels und Ausscheiden des Wassers wird mittels einer 1 ml Pipette 1 ml Konzentrationsgel ( ) auf das Trenngel gegeben. Anschließend wird der Kamm angebracht, dessen Abdrücke die Abgabekavitäten bilden werden. Die für den Vergleichsbereich erforderlichen Proben werden in einer Mischung (1:1, v/v) aus 0,5 M Natriumhydroxid ( ) und Pufferlösung ( ) so vorbereitet, dass der Bereich zwischen 5 µg/ml und 50 µg/ml liegt. Es werden 20 bis 30 µl Wein- und Vergleichsprobe in die Kavitäten gegeben. Nach der Migration (bei einer konstanten Spannung von 90 V) während ca. 3-4 Stunden bei Raumtemperatur werden die Gels abgestreift und sofort für 30 Minuten in 50 ml wässrige 20 %ige TCA-Lösung und anschließend in 50 ml Färbungslösung ( ) getaucht. Die Proteine werden in blau gefärbten Streifen sichtbar. Anschließend wird das Gel mit 50 ml Entfärbungslösung ( ) entfärbt. Nachdem der Boden des Gels transparent geworden ist, wird es zur Konservierung in destilliertes Wasser gelegt. 3 QUANTITATIVE ANALYSE Die Intensität jedes Flecks wird mit einem speziellen Scanner ermittelt, der mit einer Software zur Bildanalyse ausgestattet ist. Die auf dem Gel vorhandene Proteinmenge wird durch die Berechnung der durchschnittlichen Pixel-Dichte des Streifens und durch Einbeziehen der Bandbreite bestimmt. Der Proteingehalt jeder Probe wird durch eine Eichkurve ermittelt. Die Punkte dieser Kurve werden festgelegt, indem man die bekannten Konzentrationen an auf das Gel aufgetragenen pflanzlichen Proteinen entsprechend der zugehörigen Integrationsfläche aufzeichnet. Die Quantifikationsgrenze liegt in einem 100-fach konzentrierten Medium bei 0,030 ppm bei Erbsen und Lupinen und bei 0,36 ppm bei Gluten. Der Variationskoeffizient liegt immer unter 5 %. 4 IMMUNOBLOT-NACHWEIS DER ALLERGENEN WIRKUNG BEHANDELTEN WEINS UND MOSTS Anschließend wird die allergene Wirkung von eventuell nach dem Abziehen im behandelten Most und Wein verbleibenden Proteinen pflanzlichen Ursprungs bewertet. 4.1 PRINZIP Nach der Elektrophorese werden die Gels einem Immunblot-Test unterzogen. Die Proteine werden auf eine Membran übertragen, auf der sie absorbiert werden. Durch Zugabe von pflanzliches Protein bindenden Antikörpern (z. B. Anti-Gliadin-Antikörper, wenn es sich bei dem pflanzlichen 4

5 Protein um Gluten handelt) kommt es zur Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Der Komplex wird durch die Zugabe von Antikörpern nachgewiesen, die gegen die mit Phosphatase gekoppelten, pflanzliches Protein bindenden Antikörper gerichtet sind. In Gegenwart des chromogenen Substrats des Enzyms wird sich eine Färbung entwickeln, deren Intensität zur Menge der entstandenen Immunkomplexe proportional ist. Diese Immunreaktion wird mittels einer Eichkurve quantifiziert, welche mit Pflanzenproteinlösungen bekannter Konzentration erstellt wird. 4.2 PROTOKOLL : Reagenzien Transferpuffer Es werden 3,03 g Tris, 14,4 g Glycin (R), 200 ml Methanol (R) gemischt und mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzt %ige Gelatine Es werden 8,77 g Natriumchlorid (R), 18,6 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für Analysezwecke, 6,06 g Tris und 0,5 ml Triton X in 800 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der ph- Wert wird mit konzentrierter Salzsäure für Analysezwecke auf 7,5 gebracht. Es werden 10 g Gelatine hinzugefügt und das Volumen auf 1 l ergänzt ,25 %ige Gelatine Es werden 8,77 g Natriumchlorid (R), 18,6 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für Analysezwecke, 6,06 g Tris und 0,5 ml Triton X in 800 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der ph- Wert wird mit konzentrierter Salzsäure auf 7,5 gebracht. Anschließend werden 2,5 g Gelatine hinzugefügt und das Volumen auf 1 l ergänzt Polyklonale Antikörperlösung wie im Handel erhältlich oder im Anhang beschrieben 10 µl gegen pflanzliches Protein gerichtete polyklonale Antikörper, a. M. f. 10 ml mit 0,25 %iger Gelatine ( ) TBS-Puffer Es werden 29,22 g Natriumchlorid für Analysezwecke und 2.42 g Tris in 1 l destilliertem Wasser aufgelöst Alkalischer Phosphatasepuffer Es werden 5,84 g Natriumchlorid (R), 1,02 g Magnesiumchlorid (R) und 12,11 g Tris in 800 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der ph-wert wird mit konzentrierter Salzsäure auf 9,5 gebracht und das Volumen auf 1 l ergänzt Entwickler Es werden 15 g Phosphatbromchlorindolphosphat (BICP) und 30 g Nitrotetrazolium-Blau (NBT) in 100 ml alkalischem Phosphatasepuffer ( ) aufgelöst. 5

6 4.2.2 Vorgehensweise Nach der Elektrophorese werden die Proteine durch eine Elektrophoreseelution vom Gel auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran übertragen (16 Stunden bei 4 C unter 30 V im Transferpuffer ( )). Die Membrane werden mit 1 %iger Gelatine ( ) gesättigt und 3-mal mit 0,25 %iger Gelatine ( ) gewaschen. Die Gelatine bindet an den freien Stellen und verhindert so die unspezifische Adsorption der immunologischen Reagenzien. Anschließend wird die Membran in eine 10 ml Lösung polyklonaler, gegen pflanzliches Protein gerichteter Antikörper ( ) getaucht. Im Fall von Gluten stammen die Anti-Gliadin-Antikörper aus dem Handel, bei Erbsen und Lupinen werden die Antikörper gemäß angegebenem Protokoll hergestellt. Der IgG-Antigen-Komplex wird durch Zugabe von 10 µl gegen Kaninchen-IgG gerichtete monoklonale Mäuseantikörper detektiert, welche mit alkalischer Phosphatase markiert sind. Die Membrane werden zweimal mit 0,25 %iger Gelatine ( ) und einmal mit dem TBS-Puffer ( ) gewaschen. Nach Inkubieren im Entwickler ( ) bildet sich an der Stelle, an der das Enzym gebunden ist, ein dunkelvioletter Niederschlag. 4.3 QUANTITATIVE ANALYSE Zur quantitativen Berechnung der restlichen immunologischen Reaktivität eines Weins aus dem Handel wird eine Eichkurve erstellt: bekannte Konzentrationen an auf das Gel aufgetragenen pflanzlichen Proteinen (und auf die Membran übertragen) in Abhängigkeit der durch Einbeziehen der Fleckenintensität erzielten Flächen entsprechend der gebildeten Immunkomplexe. Die Analyse wird mit derselben Ausstattung wie zur Analyse der Elektrophorese-Gels durchgeführt. 6

7 ANHANG Herstellung polyklonaler Anti-Erbsen-Antikörper Die polyklonalen Anti-Erbsen-Antikörper sind zur Ermittlung der allergenen Wirkung der Erbseneiweiße in behandelten Weinen und Mosten erforderlich und werden durch gentechnische Verfahren im Tier erzeugt. 1 PRINZIP Die Seren mit den polyklonalen Antikörpern werden nach einer Hautinjektion des Antigens bei Neuseeland-Kaninchen gewonnen. 2 PROTOKOLL 2.1 Reagenzien PBS-Phosphat-Puffer ph=7.4: Es werden 8 g NaCl, 200 mg KCl, 1,73 Na 2 HPO 4 H 2 O und 200 mg KH 2 PO 4 in 300 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der ph-wert wird mit 1 M Natriumkarbonat auf 7,4 gebracht. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzt Antigene: Man löst 10 mg Erbseneiweiß in 5 ml PBS-Phosphat-Puffer auf (2.1.1). Anschließend wird die Lösung auf sterile Weise auf 0,2 µm gefiltert und bis zur Immunisierung bei -20 C konserviert. 2.2 Vorgehensweise Mischen von 1 ml Lösung aus (2.1.2.) mit 1 ml komplettem Freund schen Adjuvans. 1 ml dieser Mischung wird unter die Haut eines ca. 3 kg schweren Neuseeland-Kaninchens injiziert. Diese Injektion wird am 15., 30. und 45. Tag nach der Erstinjektion wiederholt. 60 Tage nach der ersten Injektion werden dem Kaninchen am Ohr 100µl Blut abgenommen, das auf seine Fähigkeit mit den Antigenen zu reagieren getestet wird. Diese Untersuchung wird durch einen Immunblot-Test (wie in Kapitel 4.2 des Analyseverfahrens beschrieben) mit einem Gel durchgeführt, auf dem das Erbseneiweiß migriert hat. Nach Überprüfen, ob sich ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet hat, werden dem Kaninchen 15 ml Blut abgenommen, das 30 Minuten bei 37 C aufbewahrt wird. Das Serum mit den polyklonalen Anti-Erbsen-Antikörpern wird nach 5 Minuten Zentrifugieren des Bluts bei 3000 U/m entnommen. 7