SDS- PAGE und Western Blot

Transkript

1 SDS- PAGE und Western Blot LiSSA Methodenseminar Doreen Braun InsCtut für Biochemie und Molekularbiologie bonn.de

2 Grundstruktur von Aminosäuren H H H 2 N C R + H 3 N C R COOH L- Aminosäure COO - wässrige Lösung, ph7 NH 2 COOH H R Aminogruppe Carboxylgruppe Wasserstoff variabler Rest

3 Primärstruktur PepCdbindung H H H O H H 2 N C COOH + H 2 N C COOH H 2 N C C N C COOH + H 2 O R 1 R 2 R 1 H R 2 Sekundärstruktur TerCärstruktur Wechselwirkung des PepCdrückgrats Wechselwirkung zwischen Aminosäureseiten- ke_en α- Helices β- Faltblä_er

4 SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) - Komponenten - 5% PAA > 7% PAA Sammelgelpuffer (Tris- HCl ph6,8; SDS) Trenngelpuffer (Tris- HCl ph8,8; SDS) PAA - Polyacrylamid Laemmli- Puffer Tris- HCl, ph6,8 SDS ß- Mercaptoethanol oder DTT Glycerin (Beschweren der Probe) Bromphenolblau (Farbe) Laufpuffer SDS Glycin Tris

5 Natriumdodecylsulfat - SDS Enjaltung von globulären Proteinen Überdeckung der Eigenladung des Proteins Einheitliche negacve Ladung

6 ß- Mercaptoethanol oder DTT - RedukConsmi_el - H Cystein H 2 N C CH 2 SH + HS H 2 C H C Cystein COOH - 2H + - 2e - COOH NH 2 H CysCn H H 2 N C CH 2 S S H 2 C C COOH COOH NH 2

7 Sammelgel ph8,3 Cl - - Ionen (Sammelgelpuffer) ph6,8 große Porengröße ph8,8 Glycin H + H 3 N C H Zwi_erion bei ph6,8 (Laufpuffer) COO - neg. Ladung bei ph8,3 & ph8,8

8 Sammelgel Elektrisches Feld Cl - - Ionen wandern schnell voraus (Leit- ionen) Glycin als Zwi_erion wandert langsam hinterher (Folgeionen) Cl - - Ionen werden aufgrund der posi- Cven Ladung des Glycinat zurück- gehalten Protein- SDS- Komplexe wandern als Stapel (stack) zwischen Leit- und Folgeionen mit koncnuierlicher Ge- schwindigkeit

9 Trenngel Elektrisches Feld ph6,8 ph8,8 ph8,3 große Porengröße geringere Porengröße Trenngel- Sammelgel- Grenze Änderung ph- Wert Änderung Porengröße ph- Wert: 8,8 Glycin verliert zwi_erionischen Charakter negacve Ladung überwiegt à Zu- nahme Mobilität Trenngel - Sammelgel- Grenze Änderung ph- Wert Änderung Porengröße

10 How to prepare a SDS- PAA- gel: Putzen Glaspla_en, Kamm, Spacer 70% Ethanol (Enjernung von Staub, PAA- Resten...) Zusammenbauen und Einspannen auf Dichtheit testen Trenngel gießen Zusammensetzung siehe Tabelle 2 mit Isopropanol (Wasser, Ethanol...) überschichten Sammelgel gießen (doppelte Kammlänge) Isopropanol enjernen und mit Wasser spülen (Reste mit Filterpapier enjernen) Zusammensetzung siehe Tabelle 2 Kamm einsetzen

11 Tabelle 1: Puffer

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13 Tabelle 2: Zusammensetzung SDS- PAA- Gel Trenngel: 20 ml 7,5 % 10 % 12,5 % 15 % dh 2 O 7,5 ml 5 ml 2,5 ml - Trenngelpuffer 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Gellösung (20%) 7,5 ml 10 ml 12,5 ml 15 ml Temed 20 µl 20µl 20 µl 20 µl APS (10%) 200 µl 200µl 200 µl 200 µl Sammelgel: 10 ml 5 % dh 2 O 5 ml Sammelgelpuffer 2,5 ml Gellösung (20%) 2,5 ml Temed 10 µl APS (10%) 100 µl % Acrylamid MW (kda) 7, ,

14 Tabelle 3: Kämme (Peqlab- Gele)

15 TroubleshooCng - Hall of Shame h_p:// page/sdsgoofs.html

16 TroubleshooCng - HycultBiotech weitere Beispiele verfügbar h_ps:// PAGE_1.pdf

17 Western Blot SDS- PAA- Gel, Comassie- Färbung Western Blot, Nitrocellulosemembran

18 Tabelle 4: Ladungskontrollen

19 Western Blot - Auxau Übertragung der negacv geladenen SDS- Protein- Komplexe auf Membran. Blo_en bei konstanter Einstellung der Stromstärke: 2-5 ma/cm 2 Zeit Transferpuffer (ph 8,3) Glycin Tris Methanol (SDS)

20 H 2 O à H + + OH - OH - Die entstehenden Ionen werden über die Filterpapiere abgeleitet. ph- Wert des Transferpuffers nicht einstellen! Änderung des ph- Wertes führt zur vermehr- ten Bildung von Ionen und Hitzeentwicklung. Die Filterpapiere können das Übermaß an Ionen nicht kompensieren à braun- ver- brannte Membran H +

21 Methanol und SDS Methanol verhindert Schwellen des Gels à unscharfe Banden erhöht AbsorpCon der Proteine an NC- Membran verringert Porengröße SDS verbessert Transfereffizienz großer Proteine bei kleinen Proteinen nachteilig (equi- librieren des Gels in Transferpuffer)

22 Membran PVDF stabiler à Stripping geeignet hydrophobe Membran für hydrophobe Proteine (z.b. Membranproteine) höhere Bindungskapazität: µg/cm 2 NC schnellere Bindung Stripping ungeeignet Bindungskapazität: 80 µg/cm 2 Porengröße: 0,45µm > 20 kda 0,2µm < 15kDa

23 Puffersystem Semi- Dry Blot Filterpapiere in Kathoden- und Anodenpuffer getränkt höhere Transferleistung Transfer hydrophober Proteine Natriumcarbona_ransferpuffer, ph9,9 (nach Dunn) 10x (1l): 8,4 g NaHCO 3 & 3,2 g Na 2 CO 3 ph- Wert des Puffers sollte 2 ph- Einheiten höher liegen als IEF

24 Nach dem Blo_en - Anfärben der Membran Ponceau- S- Rot (0,1 % in 5 % Essigsäure) Überprüfung des Transfers bindet reversibel an posicv geladene Aminogruppen von Proteinen

25 Nach dem Blo_en - Blockieren Absä~gen unspezifischer Bindungsstellen AnCkörper = Proteine Magermilchpulver preiswert ungeeignet für DetekCon von Phospho- Protein enthält Casein (Phospho- Protein) à Hintergrund BSA Milch, BSA ß- AcCn ß- AcCn ß- AcCn Membran

26 Nach dem Blo_en - AnCkörper

27 Nach dem Blo_en - AnCkörper Waschen Viel hil viel.

28 Nach dem Blo_en - DetekCon ECL - enhanced chemiluminescence Luminol + Peroxid à [angeregtes Intermediat] à 3- Aminophthalat + Licht (Emmisison bei 428nm) HRP: 2 H 2 O 2 à O 2 +2 H 2 O

29 TroubleshooCng - Western blot doctor (BioRad)

30 Danke und guten AppeCt