Effekt von Ni 2+ und Ag + auf die Zelllebensfähigkeit endothelischer Zellen. Proteinanalyse durch SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese

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1 Praktikum IV Versuche B1/B2 Effekt von Ni 2+ und Ag + auf die Zelllebensfähigkeit endothelischer Zellen Proteinanalyse durch SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese Studiengang Materialwissenschaft Bachelor ETH Zürich Frühjahrssemester 2010 Autoren: Amanda Hüsler, Katja Fröhlich, Michael Schwarzenberger und Philippe Knüsel huesleam@student.ethz.ch frkatja@student.ethz.ch pknuesel@student.ethz.ch michschw@student.ethz.ch Datum: 17. und Assistenten: Philippe Spycher und Vincent Milleret

2 1. Abstract Im ersten Versuch wurden Zellen verschiedenen Konzentrationen von Nickel-, Silberionen und Ethanol ausgesetzt. Mit den resultierenden Daten ist es schwierig konkrete Aussagen zu machen und zu stützen. Tendenziell scheinen jedoch die Silberionen eine stärkere toxische Wirkung auf die Zellen aufzuweisen als die Nickelionen. Im zweiten Experiment wurden die molaren Massen von Collagen I, Fibronectin, Antikörper und BSA 10 mittels SDS-Page Gel Elektrophorese bestimmt. Dabei zeigte sich, dass sich gewisse Proteine unter reduzierenden Bedingungen in kleinere Untereinheiten aufspalten. Insgesamt stimmten die gemessenen Massen relativ gut mit den Literaturwerten überein. 2. Ziele Im Allgemeinen wurde die sterile Arbeitsweise eingeführt und angewendet. Im ersten Experiment wurden anhand von verschiedenen Ni 2+ und Ag + Konzentrationen der Effekt auf das Überleben von Zellen bestimmt. Dieser Vorgang wird Zytotoxizitätstest genannt und ist in der Regel eine Kontrolle des Überlebens der Zellen nach einer Behandlung mit Arzneimitteln. Im zweiten Experiment spielten vier Proteine eine wichtige Rolle, nämlich Bovine Serum Albumin (BSA), Antikörper, Collagen I und Fibronectin. Diese wurden mithilfe der SDS-Page Gel Elektrophorese unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen auf ihr Molekulargewicht getestet. 3. Einleitung 3.1. Stents Ein Stent ist ein kleines, gitterförmiges Metallröhrchen, welches in blockierte Blutgefässe eingesetzt werden kann. Mithilfe eines Ballons wird die Verkalkung aufgebrochen und um eine erneute Verstopfung zu verhindern, wird der Stent eingesetzt (siehe Abbildung 1). Silberionen sind unter anderem Bestandteile eines Stents und können das Bakterienwachstum stoppen. Aufgrund des Metalls kann es zu allergischen Reaktionen des Immunsystems führen. In diesem Fall sollten auf keinen Fall Metallstents verwendet Abb. 1: Ablauf einer Stentimplantation in ein werden. verstopftes Blutgefäss [1]

3 Stents werden aus Nitinol (Nickel Titanium) hergestellt und ihre besondere Fähigkeit ist, dass sie sich an ihre eingeprägte Form erinnern können. Deshalb werden sie auch als shape memory alloys bezeichnet. Ein Stück Metall, welchem eine Form eingeprägt wurde, kann man so verbiegen wie man will, es erreicht nach einer Wärmebehandlung seine ursprüngliche Form zurück. In Abbildung 2 sind die Stents im Grössenvergleich abgebildet. Abb. 2: Stents im Grössenvergleich mit einem menschlichen Finger [2] 3.2. Proteine Proteine sind biologische Moleküle, welche in und um Zellen gefunden werden. Es gibt wasserlösliche Proteine und solche die es nicht sind. Ein nicht wasserlösliches Protein ist zum Beispiel ein Strukturprotein. Proteine übernehmen unter anderem folgende Aufgaben: Kontrolle von biochemischen Reaktionen, Einfluss in den Zellstoffwechsel, Koordination der Antworten von inneren zu äusseren Faktoren. Sie gehören zur chemischen Gruppe der Polyamide und basieren auf 20 verschiedenen Typen von Aminosäuren, welche zu Peptidverbindungen miteinander verbunden sind. Aminosäuren haben viele verschiedene Eigenschaften, welche von der Natur ihrer Seitenkette abhängen. Beispielsweise zeigen einige von ihnen einen polaren Charakter und sind neutral. Andere hingegen sind ionisiert und geben so entweder einen positiven oder negativen Charakter zu den Aminosäuren. Es existieren auch solche mit einem Kohlenwasserstoff ähnlicher Seitenkette, welche eine hydrophobe Eigenschaft aufweisen. Proteine falten sich normalerweise so, dass der hydrophile Teil sich auf der Oberfläche und der hydrophobe Teil sich im Innern befindet. Proteine können unterschiedlich gefaltet sein, nämlich als α-helix oder als β-faltblatt. Die Struktur selber kann wieder unterteilt Abb. 3:Struktur von Proteinen [3] werden in eine primäre (Aminosäuren Sequenzen), sekundäre (α-helix oder als β-faltblatt), tertiäre (Proteinuntereinheit und disulfidgebundene Untereinheiten) und in eine quartäre Struktur

4 (Protein Komplexe aus verschiedenen Polypeptidketten). Proteine verlieren ihre Funktion, wenn man ihre sekundäre, tertiäre und quartäre Struktur zerstört! Die Disulfidbindungen verbinden die Proteine verschiedener Untereinheiten. Im Experiment B2 wurden vier verschiede Proteine auf ihre molare Masse getestet: Fibronectin, Antikörper, BSA (Bovine serum albumin) und Collagen I. Das Fibronectin (es gibt 2 Arten) ist die Hauptkomponente im Blutplasma und kommt in der extrazellulären Matrix vor. Die Adhäsion von Zellen und die Gewebereparatur sind die Hauptaufgaben dieses Proteins. Ein weiterer wichtiger Blutbestandteil sind Antikörperproteine. Sie eliminieren Fremdpartikel im Körper. Das BSA ist das Hauptblutprotein und transportiert beispielsweise Fette im Blut. Das Collagen I kommt vor allem in den Knochen, der Haut und den Organen vor. Der Versuch wurde mit dem SDS-PAGE-Verfahren (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis) durchgeführt. Bei der Denaturierung der Proteine werden die sekundären, tertiären und quartären Strukturen aufgebrochen, das heisst die Proteine werden entfaltet (durch brechen der Wasserstoffbrücken). Dabei wird die Funktion des Proteins zerstört. Die primäre Struktur bleibt dieselbe wie vor der Denaturierung. Nach diesem Prozess weisen die Proteine eine zufällige Form auf, da die α-helixe und β-faltblätter zerstört wurden. Dann sorgt das Natriumdodecylsulfat, welches ein anionischer Tensid ist, dass alle Proteine negativ geladen sind. Mit Hilfe einer elektrischen Spannung, die ein elektrisches Feld erzeugt, können sich die negativ geladenen Proteine durch den Gel in Richtung Anode bewegen. Das Gel wirkt dabei wie ein Sieb, bei dem kleinere Proteine weniger zurückgehalten werden als grosse. Dadurch erfolgt eine Trennung der Proteine.

5 4. Materialien und Methoden 4.1. B1 Die Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen von Nickelionen, Silberionen und Ethanol ausgesetzt. Ausserdem wurden drei verschiedene Färbemittel verwendet: Der Hoechst nuclear stain und die life and dead stains. Letztere färbt die lebenden und toten Zellen unterschiedlich an. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt, einmal mit Silber- und einmal mit Nickelionen. Die Anordnung der einzelnen Kammern folgte dem folgenden Schema: (Abb.4): Abb. 4: Anordnung der verschiedenen Testkammern am Beispiel Nickel [4] Die in den Versuchen verwendeten Fibroblasten wurden im Voraus 1-2 Tage in einem Inkubator bei 37 C unter 5% CO 2 in DMEM mit 10% FCS (Fetal calf serum) gehalten. Ethanolbehandlung: Zuerst wurde das Zellkulturmedium entfernt und in jeweils zwei Behältern eine 50% (verdünnt in PBS (Phosphate buffered saline)) bzw. eine 100% Ethanol-Lösung hinzugefügt. Nach 5 Minuten wurde das Ethanol wieder entfernt und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Wichtig war vor allem, dass die Zellen weder austrockneten noch weggespült wurden. Hoechst nuclear stain Die Hoechst Färbung wurde aus 1 µl H342 (Hoechst stain) und 2 ml PBS hergestellt. Davon wurden anschliessend 200 µl auf die Zellen in den sieben Behältern (0, 0.1, 1, 10, 100 µl Ni 2+ Ionen und 50%, 100% Ethanol) aufgetragen und nach 2 Minuten wieder entfernt. Die Zellen wurden nochmals mit 500 µl PBS gewaschen und schliesslich wurde noch 200 µl von dem Zellkulturmedium (DMEM (Dulbecco s modified eagle medium) + 10% FCS) hinzugefügt.

6 Life and dead stain Die Zellen wurden zweimal mit 200 µl PBS gewaschen, nachdem das Medium entfernt worden war. Dann wurden die hffs (human foreskin fibroblasts) für 2 Minuten mit Fluoreszeindiazetat (2.5 µg/ml, Fluka) und Propidiumiodid (10µg/ml) versetzt. Vorsicht war hier bei den giftigen Lösungen geboten und deshalb sollten Handschuhe getragen werden. Die Färbelösung wurde entfernt und die hffs wurden zweimal mit PBS gewaschen. Die einzelnen Testkammern wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit verschiedenen Filtern untersucht. Als Lichtquelle werden meistens Quecksilberdampflampen verwendet. Die Filter filtern die Lichtquelle, dass nur diejenige Wellenlänge auf das Objekt trifft, die einen bestimmten fluoreszierenden Farbstoff anregen kann. Das emittierte Licht ist meistens langwelliger als das absorbierte. Mit Hilfe eines fluoreszierenden Mikroskops wurden dann die Zellkulturen bei den verschiedenen Ionenkonzentrationen analysiert und gezählt. Die Färbungen (Hoechst, life und death stain) emittieren dabei bei der Bestrahlung mit unterschiedliche Wellenlängen (blau, grün und rot). Mit Hilfe der Verwendung unterschiedlicher Filtern wurden diese jeweils einzeln sichtbar. Danach konnten die Zellkerne (blau), die lebenden Zellen (grün) bzw. die Zellkerne der toten (rot) Zellen gezählt werden. Die Anregungswellenlänge von Fluoreszeindiazetat (grün) beträgt 495 nm und die Emissionswellenlänge ist 519 nm. Für Propidiumiodid (rot) beträgt die Anregungswellenlänge 493 nm und die Emissionswellenlänge 620 nm. Der Hoechst stain (blau) weisst eine Anregeungswellenlänge von 345 nm und eine Emissionswellenlänge von 480 nm auf B2 Zuerst mussten 2 verschiedene Gele hergestellt werden, das Sammel- und das Trenngel. Für 10 ml des letzteren wurden Lösungen miteinander vermischt: 3.75 ml H 2 O, 2.5 ml (0.15 M/10% SDS) 4 x Tris/HCl mit einem ph-wert von 8.8, 3.75 ml (36%) Acrylamid, 100 μl APS (20%) und 10 μl TEMED. Für das Sammelgel benötigte man fast dieselben Lösungen, variierte sie jedoch in der Menge: 4 ml H 2 O, ml (0.05 M/10% SDS) von 4 x Tris/HCl mit einem ph-wert von 6.8, 0.9 ml (36%) Acrylamid. Die Menge an APS und TEMED blieben gleich. Das Trenngel wurde zuerst hergestellt und bis zur Markierung in die Kassette gefüllt. Etwas Wasser wurde vorsichtig auf die Oberfläche gegeben und das ganze während 45 min fest werden lassen. Das Wasser hatte den Effekt, dass eine schöne glatte Oberfläche gebildet wurde. Nach dem Abgiessen des Wassers konnte eine dünnere Schicht des Sammelgels hinzugefügt und der Kamm sorgfältig eingesteckt werden. Wiederum mussten 30 min gewartet werden, bis man anhand des nicht benötigten Gels in Behälter erkennen konnte, dass es fest war. Dieses ganze Vorgehen wurde zweimal durchgeführt, damit man 2 Gele erhielt.

7 Diese zwei Gele wurden in einen nicht reduzierenden und einen reduzierenden Teil aufgeteilt. Im ersteren wurde ein nicht reduzierender Puffer zu den Proben hinzugefügt, während beim letzeren ein reduzierender Puffer zum Einsatz kam. Der nicht reduzierende Puffer trennt die Proteine nicht in ihre Polypeptidketten auf. Die Proben mit dem reduzierenden Puffer wurden hingegen denaturiert aufgrund des β- Mercaptoethanol des reduzierenden Puffers und so trennten sich die Disulfidbindungen auf. Nach dem Entfernen des Kamms konnten die folgenden Proben in die Taschen eingefüllt werden: Collagen I, 10 µg Fibronectin 10 µg Antikörper 10 µg BSA 10 µg Alle Proben eines Gels wurden mit dem nicht reduzierenden (erstes Gel) oder dem reduzierenden Puffer (zweites Gel) versetzt und für fünf Minuten bei 96 C geheizt. Beim Reduzieren denaturiert SDS und entfaltet Proteine, indem Sekundär- und Tertiärstrukturen aufgebrochen werden. Das macht es interessant für die Untersuchung der Molekulargewichte. Mit dem nicht reduzierenden Puffer können die gesamten Molekülmassen bestimmt werden und mit dem reduzierenden die einzelnen Untereinheiten. In die jeweils erste Tasche eines Gels kam eine Mischung aus verschiedenen Proteinen, deren Molekularbewichte bekannt waren und daher als Molekulargewichtsmarker dienten. Weiter wurde noch ein Laufpuffer hergestellt. Dafür wurden Tris 0.25 M, Glycine 1.92 M und SDS 1% mit einem Liter Wasser gemischt. Die Lösung wurde zehnfach verdünnt.. Die so geladene Kassette wurde mit 400 V, 25 ma und 100 W in Betrieb genommen und ungefähr 55 min laufen gelassen. Man konnte gut die weissen Blasen auf dem Puffer erkennen, die anzeigten, dass der Strom lief. Die ganze Versuchsanordnung ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Gele wurden danach entfernt und in einem Plastikbehälter gegeben und mit Coomassiebriliantblau (Coomassiebrilliantblau R %, Ethanol 25%, Essigsäure 10% und ein Liter Wasser) während 30 Minuten auf Abb. 5: Apparatur zur Auftrennung der Proteine mittels SDS- Polyacrylamid Gelelektrophorese.

8 einer Schüttelapparatur behandelt. Danach wurden die Gele wieder mit einer weiteren Lösung (Essigsäure 10 %, technisches Ethanol 20% und Wasser 70%) entfärbt (über Nacht). Das Scannen der Gele wurde vom Assistenten übernommen.

9 5. Resultate 5.1. B1 Die Tabellen 1 und 2 zeigen die Anzahl Zellen in den Kulturen, die mit mit verschiedenen Silber- resp. Nickelionen-Konzentrationen behandelt wurden. Die Zellen wurden mit Hilfe eines Standard-Rechteckes (1/16 des Gesamtbildes) für jedes Bild gezählt (Abb. 6), da die Scalebars leider vergessen wurden. Konzentration [μm] # Zellen - Hoechst stain # Zellen - life stain # Zellen - death stain (a) Ethanol 50 % Ethanol 100 % Tab. 1: Anzahl Zellen im Standardrechteck, die mit verschiedenen Konzentrationen von Silberionen behandelt wurden. Die toten Zellen nach der Behandlung mit Silberionenkonzetration von 100 μm (a) konnten nicht gezählt werden. Der Grund dafür ist vermutlich, dass das Färben (death stain) vergessen ging. Konzentration [μm] # Zellen - Hoechst stain # Zellen - life stain # cells - death stain (b) Ethanol 50 % Ethanol 100 % Tab. 2: Anzahl Zellen im Standardrechteck nach Behandlung von verschiedenen KOnzentrationen von Silberionen. Bei der Probe, die mit 10 μm Nickelionen inkubiert wurde, konnten die lebenden Zellen (b) nicht gezählt werden. Die Zellen konnten nicht voneinander unterschieden werden, weil sie nicht scharf genug dargestellt werden konnten. Abb. 6: Von links nach rechts: Hoechst stain von hff nach der Behandlung mit Nickel 10 μm; life stain - von hff nach der Behandlung mit Silber 1 μm; death stain - von hff nach der Behandlung mit Silber 100% Ethanol

10 In der Abbildung 7 werden prozentual die überlebenden Zellen bei unterschiedlicher Ionenkonzentration dargestellt. Prozentuales Überleben 120% Überlebende Zellen 100% 80% 60% 40% 20% 0% Silberionen Nickelionen Ionenkonzentration [μm] Abb. 7: Prozentuales Überleben der Zellen bei verschiedenen Ionenkonzentrationenn 5.2. B2 Das Gel aus dem Versuch B2 ist in Abb. 7 dargestellt. Tab. 3 zeigt die Migrationsdistanzen der Standardlösung. Die Literaturwerte der untersuchten Proteine sind in Tab. 4 dargestellt, die gemessenen Werte in Tab. 5. Abb. 8: Gel des Versuches B2. Von links nach rechts: Standard, Antikörper nicht-reduziert, Antikörper reduziert, BSA nicht-reduziert, BSA reduziert, Kollagen nicht-reduziert, Kollagen reduziert, Fibronektin nicht-reduziert, Fibronektin reduziert

11 Molekulargewicht [kda] Migrationsdistanz [cm] Tab. 3: Migrationsdistanzen der Standardlösung Protein Antikörper BSA Kollagen Fibronektin Molekulargewicht [kda] nicht-reduziert Molekulargewicht [kda] reduziert Tab. 4:Literaturwerte der Molekulargewichte der untersuchten Proteine. [6] / /230 Abb. 9: Kalibrierfunktion, die aus den Werten aus Tab. 3 erstellt wurde. Die Gleichung der Trendlinie wurde automatisch erstellt.

12 Protein/Probe Molekulargewicht [kda] Antikörper Nicht-reduziert Reduziert 47.9 BSA Nicht-reduziert Reduziert Kollagen Nicht-reduziert Reduziert Fibronektin Nicht-reduziert Reduziert Tab. 5: Resultate der Bestimmung des Molekulargewichts der Proteine unter den jeweiligen Bedingungen.

13 6. Diskussion 6.1. B1 Die Gesamtzahl der Zellen, die mit Hoechst stain markiert wurden, sollte in allen Proben ungefähr gleich sein, da sich alle Zellen unter gleichen Bedingungen befanden und alle etwa gleichen Pipettierbedingungen ausgesetzt waren. Dies ist in der 100 μm-silberionen-probe nicht der Fall. In dieser Probe wurden lediglich acht Zellen gezählt. Höchstwahrscheinlich wurden Zellen während dem Experiment herauspipettiert (herausgewaschen). Deshalb kann für diese Konzentration an Silberionen keine Aussage getroffen werden, obwohl angenommen wurde, dass hier die höchste Sterblichkeit vorliegen müsste. Man kann lediglich annehmen, dass tote Zellen schlechter anhaften als die lebenden. Beim Vergleich der Zellenzahlen in den Tabellen 1 und 2 (death stain) sowie der prozentual überlebenden Zellen in Abbildung 7 fällt auf, dass es in der Silberionen-Probe mehr tote Zellen hat. Entgegen unserer Erwartungen stieg die Anzahl toter Zellen nicht mit der Silberionenkonzentration. Bei den Nickelionen wurde dieser Effekt ebenfalls nicht beobachtet, obwohl er auch hier erwartet wurde. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass tote Zellen in der Nickelionen-Lösungen herauspipettiert wurden. Dies würde die Nullwerte erklären. Der Vergleich der Anzahl Zellen in der Hoechst stain-probe und der life stain-probe stützen diese Hypothese, da die Zahlen ungefähr gleich sind. Abschliessend ist zu sagen, dass es anhand der Resultate schwierig ist konkrete Aussagen zu machen und zu stützen. Es scheint aber so, dass die Silberionen eine stärkere toxische Wirkung auf die Zellen aufweisen als die Nickelionen B2 Zunächst muss man festhalten, dass die angegebenen Literaturwerte in der Regel keine exakten Werte sind, da es beispielsweise verschiedene Kollagene oder Antikörper gibt. In der Grössenordnung kann aber erwartet werden, dass sich die gemessenen Werte mit denjenigen aus der Literatur decken. Für den Antikörper findet man eine relativ gute Übereinstimmung. Gemessen wurde ein Molekulargewicht von kda bei einem Lieteraturwert von ungefähr 150 kda. Mit dem reduzierenden Gel wurde ein Gewicht von 47.9 kda, eine Bande im selben Bereich (42.9 kda) findet man beim nicht-reduzierenden Gel. Das lässt darauf schliessen, dass der Antikörper aus kleineren Untereinheiten besteht, die kovalent über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind und vom reduzierenden Gel aufgetrennt werden. Tatsächlich besteht dieses Protein zwei leichten und zwei schweren Ketten, die eine verzweigte, Y-förmige Struktur aufweisen. Der Literaturwert von etwa 50 kda für die schwere Kette stimmt ziemlich gut mit unserem gemessenen Wert überein. Die Bande für die leichtere Kette bei 25 kda fehlt aber aus ungeklärten Gründen.

14 Bei der Untersuchung von BSA traten sehr viele verschiedene Banden auf, unter reduzierenden Bedingungen wurde eine Bande bei 69.8 kda gemessen, was relativ nahe am Literaturwert ist. Beim Betrachten der Kollagen-Banden fällt auf, dass sowohl für das reduzierende als auch für das nicht-reduzierende Gel gleich viele Banden bei ungefähr denselben Distanzen auftraten. Offenbar bestand das gesamte Protein aus einem fest gebundenem Molekül, dass nicht in kleinere Einheiten aufgespalten wurde. Dies ist im Einklang mit den Literaturwerten, da sowohl für das reduzierte als auch das nicht-reduzierte Protein derselbe Wert angegeben wird. Auffällig ist, dass die gemessenen Werte deutlich über dem Literaturwert sind. Da aber für reduzierende und nicht-reduzierende Bedingungen dieselben Werte gemessen wurden, muss dies an einem systematischen Fehler liegen. Für Fibronektin wurde jeweils nur eine Bande gemessen. Der Wert von kda beim nicht-reduzierenden Gel entspricht ziemlich genau dem Literaturwert. Unter reduzierenden Bedingungen wurde ein Wert von kda gemessen. Gemäss der Literatur zerfällt das Fibronectin unter reduzierenden Bedingungen in zwei Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 210 kda resp. 230 kda. Dies konnte im Experiment wohl bestätigt werden, da die Bande sehr dick war, war es aber kaum möglich beide Banden zu unterscheiden. Sie lag aber in diesem Bereich, während die Bande bei kda verschwunden war. 7. Referenzen [1] ( ) [2] ( ) [3] ( ) [4] Skript Versuch B1: Analyse der Zellmorphologie, D-MATL, ETH Zürich, 2010 Seite 7 [5] Skript Versuch B2: Proteinanalyse durch SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese, D- MATL, ETH Zürich, 2010 Seite 8 [6] ( )