2 Materialien. Materialien Histondeacetylaseinhibitoren (HDIs) Sigma-Aldrich, Deutschland. 2.2 Zelllinien und Zellkultur.
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- Claudia Schräder
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1 Materialien 15 2 Materialien 2.1 Histondeacetylaseinhibitoren (HDIs) Substanz Butyrat Trichostatin A (TSA) Valproat Hersteller Sigma-Aldrich, Sigma-Aldrich, Sigma-Aldrich, 2.2 Zelllinien und Zellkultur Zelllinien Name Beschreibung Quelle/Referenz ACHN humanes renales Adenokarzinom ATCC CRL 1610 Isolation aus Pleuraerguss SN12 humanes Nierenzellkarzinom (Werner et al., 2000) A498 humanes epitheliales Nierenzellkarzinom schlecht differenziert ATCC HTB 44 Zellkultur Arikel Produktname Hersteller 6-well-Platten Nunc TM Brand Products, Dänemark Eppendorfröhrchen Eppendorf AG, Fetales Kälberserum FKS BIOCHROM AG seromed, Glutamin GIBCO BRL, USA Kulturflaschen (diverse Größen) Nunc TM Brand Products, Dänemark
2 Materialien 16 Mikroskop AXIOPLAN ZEISS, Natriumpyruvat PBS-DULBECCO 1x ohne Ca 2+ + Mg 2+ Reaktionsgefäße GIBCO BRL, USA BIOCHROM AG seromed, BRAND, Tischzentrifuge Eppendorfzentrifuge 5417R Eppendorf AG, Trypanblau Merck, Trypsin BIOCHROM AG seromed, Zellmedium Earle s Salzen Minimum Essential Medium (MEM) BIOCHROM AG seromed, Deuschland Zentrifuge Megafuge 1.0 Heraeus, Zentrifugenröhrchen Nunc TM Brand Products, Dänemark 2.3 Proteinaufarbeitung ELISA-Reader MRX II DYNEX Technologies, USA Substanzen zur Proteinbestimmung Substanz A Substanz B Bio-Rad Laboratories, USA Bio-Rad Laboratories, USA Zentrifuge Optima TM TLX Ultrazentrifuge Beckmann, USA
3 Materialien Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Amoniumpersulfat (APS) Merck, Arcrylalmid Arcrylamid BIS 30 Bio-Rad Laboratories, USA Elektrophoresekammer Bio-Rad Laboratories, USA Molekulargewichtsmarker Biotinylated SDS-PAGE Bio-Rad Laboratories, USA Standards Tetramethylethylendiamine (TEMED) Serva, Boehringer Ingelheim Bioproducts Partnership, 2.5 Western-Blot Blockiermittel auf Polymerbasis Roti -Block Carl Roth GmbH + Co, Detektionslösung ECL TM Western Blotting Detection Reagents Amersham Biosciences, Schweden Filter Mini Trans-Blot Filter Bio-Rad Laboratories, USA Paper Nitrozellulosemembran Hybond TM ECL TM Nitrocellulose amersham pharmacia biotech, England membrane Panceau S (1%) Merck, Röntgenfilme Hyperfilm TM ECL Amersham Biosciences, England Transfergerät TRANS-BLOT SD Bio-Rad Laboratories, USA
4 Materialien Antikörper Caspase-3 Name Spezifität Spezies Spezifische Hersteller Bande Rabbit Anti-Active Caspase-3 Polyclonal Antibody (PAb CM1) polyklonal Kaninchen 18kDa BD Biosciences β-tubulin Name Spezifität Spezies Spezifische Hersteller Bande β-tubulin polyklonal Kaninchen 51-54kDa Santa Cruz Biotechnology, USA Zweiter Antikörper Name Spezies Hersteller Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Ziege dianova,
5 Materialien RNA RNAzol TM B WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH, LightCycler Version 1.0 Roche Diagnostics GmbH, Acridin Orange Sigma, Agarose Invitrogen, UK Chloroform Merck, DEPC-Wasser: Bidest. Wasser und diethylpyrocarbonate Sigma, Elektrophoresekammer HORIZON LIFE GIBCO BRL, USA TECHNOLOGIES Ethanol (75%ig) J. T. Baker, Niederlande Ethidiumbromid Sigma, Isopropanol J. T. Baker, Niederlande Photometer Ultrosec 3000 Pharmacia Biotech, Schweden RT-PCR Reaktions-Kit LightCycler RNA Amplivication Kit Hybridization Probes Roche Diagnostics GmbH,
6 Materialien Primer und Hybridisierungsproben Caspase-3 (Genbank accession number: U13738) Name Sequenz Hersteller Casp3_F 5 AGG GGA TCG TTG TIB MOLBIOL, Germany TAG AAG TCT AA Casp3_ A 5 GCC AAG AAT AAT TIB MOLBIOL, Germany AAC CAG GTG CT Casp3_LC 5 LC Red640 TTC TGT TIB MOLBIOL, Germany ACC ACG GCA GGC CTG AA PH Casp3_FL 5 CTG TCT GTC TCA ATG CCA CAG TCC A FL TIB MOLBIOL, Germany Survivin (Genbank accession number: U75285) Name Sequenz Hersteller Surv_S 5 AAA GAG CCA AGA TIB MOLBIOL, Germany ACA AAA TTG C Surv_A 5 GAG AGA GAA GCA TIB MOLBIOL, Germany GCC ACT GTT AC Surv_LC 5 - LC Red640 CCA GAG TIB MOLBIOL, Germany GTG CTT CTG CCT GTG C--PH Surv_FL und 5 - TGC TCT TGT TTT GTC TTG AAA GTG GC FL TIB MOLBIOL, Germany
7 Materialien Puffer und Lösungen RIPA-Puffer Complete, mini Protease 1 Tabl. Roche Diagnostics GmbH, Inhibitior Cocktail (SDS) 0,1% Serva Feinbiochemica GmbH & Co, Igepal 1% Sigma, PBS-DULBECCO 1x ohne Ca 2+ + Mg 2+ BIOCHROM AG seromed, Sodium Deoxycholate 0,5% Sigma, Trenngel 4x Puffer (ph 8,8) TRIS-Base 1,5M Sigma, (SDS) 0,4% Serva Feinbiochemica GmbH & Co, Sammelgel 4x Puffer (ph 6,8) TRIS-Base 0,5M Sigma, (SDS) 0,4% Serva Feinbiochemica GmbH & Co,
8 Materialien 22 Laufpuffer (10x) für SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) TRIS-Base 0,25M Sigma, Glycin 1,92M Merck, Ladepuffer (5x) 5M TRIS-HCL ph 6,8 12,5% Sigma, Aqua dest 50% Delta-Pharma, Bromphenolblau 2,5% Sigma, (SDS) 10% 20% Serva Feinbiochemica GmbH & Co, Glycerol 20% Merck, Mercaptoethanol 5% amresco, USA Coomassie-Farblösung v/v Isopropanol 25% J. T. Baker, Niederlande v/v Eisessig 10% Merck, w/v Coomassie Brillantblau 0,25% Bio-Rad, USA Entfärbelösung v/v Eisessig 7% Merck, v/v Ethanol 20% J. T. Baker, Niederlande
9 Materialien 23 Transferpuffer TRIS-Base 11,6g (48mM) Sigma, Glycin 5,8g (39mM) Merk, (SDS) 0,74g (0,037%) Serva Feinbiochemica GmbH & Co, Methanol 200ml (20%) J. T. Baker, Niederlande Aqua dest. auf 1600ml Delta-Pharma, Blot-Waschpuffer (TBS ph 7,6) TRIS-Base 12,1g (20mM) Sigma, NaCl 40,0g (173mM) Merck, Tween 0,05% Merck, HCL titrieren auf ph 7,6 Merck, Laufpuffer für RNA-Elektrophorese: TAE (50x) TRIS-Base 242g Sigma, Essigsäure 100% 57,1ml Merck, EDTA ph 8 100ml Biometra (amvesio) Milipore-Wasser auf 1000ml
3 Methoden. Methoden 24. 3.1 Zellkultur. Kultivieren von Zellen
Methoden 24 3 Methoden 3.1 Zellkultur Kultivieren von Zellen Die Nierenkarzinomzelllinien A498, SN12 und ACHN (Referenzen für die verwendeten Zelllinien siehe unter 2.2) wurden nach Anleitung der American
Dendrogramm der Primaten
Arbeitsblatt 1 Dargestellt ist ein Ausschnitt der DNA-Sequenz für das Enzym NAD- Polymerase, dass bei den Primatenarten Mensch(M), Schimpanse(S), Gorilla(G), Orang-Utan(O) und Gibbon(Gi) vorhanden ist.
Tab. 2-1: TKZT-Zelllinien, Herkunft, histologische Eigenschaften und Referenzen
Material 28 2 MATERIAL 2.1 Zelllinien In der vorliegenden Studie wurden etablierte Zelllinien von nichtseminomatösen TKZT untersucht. Die Untersuchungen wurden zunächst an den drei Zelllinien H12.1, 2102EP
Material. 3 Material. 3.1 Reagenzien
3 Material 3.1 Reagenzien Tabelle 1: verwendete Reagenzien Substrat Hersteller Firmensitz Agarose (NEEO, Ultra-Qualität) Carl Roth Karlsruhe BPB (Bromphenolblau) Merck Darmstadt DEPC (Diethylpyrocarbonat)
2. Material Material Chemikalien Radiochemikalien Restriktionsenzyme Enzyme (andere)
12 2. Material 2.1. Material 2.1.1. Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien wurden in höchstem Reinheitsgrad von folgenden Firmen bezogen:, Difco Laboratories, FMC Bioproducts, Gibco BRL, Merck,, Sigma
2 Materialien. Materialien 19. 2.1 Chemikalien. Merck (Darmstadt) (30 %ig mit 0,8 % Bisacrylamid) Sigma (St. Louis, USA) Roth (Karlsruhe)
Materialien 19 2 Materialien 2.1 Chemikalien Aceton Acetonitril Acrylamidstammlösung (30 %ig mit 0,8 % Bisacrylamid) Ammoniumchlorid Ammoniumnitrat Ammoniumsulfat Ampicillin ANS APS Bacitracin Bromcyan
Bezeichnung Sequenz Verwendung
8 ANHANG i 8 ANHANG I Oligonukleotide Bezeichnung Sequenz Verwendung D256 5 -ATGGCAGACGGTGAGGATATTCA-3 5 Aktin AC1 (neu) D257 5 -GCCTTTGCAATCCACATCTGTTG-3 3 Aktin AC2 (neu) D98 5 -AT CC ATG GCA ATG TCA
5,6- Carboxy- Rhodamin (Rox) TIB MolBiol, Berlin Desoxynukleosidtriphosphat (dntp)
8 Anhang 8.1 Chemikalien und Reagenzien Bromphenolblau Bromma, Schweden 5,6- Carboxy- Rhodamin (Rox) TIB MolBiol, Berlin Desoxynukleosidtriphosphat (dntp) Invitrogen TM, Karlsruhe Ethanol (RNase-frei)
2 Material. Material und Methoden 17
Material und Methoden 17 2 Material Alle Chemikalien hatten mindestens den Reinheitsgrad pro analysii und wurden, sofern nicht anders angegeben, von den Firmen Sigma (München), Serva (Heidelberg) oder
Material MATERIAL 3.1 Oligonukleotide
Material 13 3 MATERIAL 3.1 Oligonukleotide AGK34 LINE1 Ale1 Ale3 LIS1 LIS2 UR UL RA2 LS2 pbst7 sp6 DOP (6-MW) pcypac2-01 pcypac2-02 SD2 SA2 SA4 SD6 D11S2164 (CP5) forward D11S2164 (CP5) revers M16 forward
7 Anhang. Tabelle I: Zusammensetzung der Restriktionsansätze.
7 Anhang Tabelle I: Zusammensetzung der Restriktionsansätze. Reagenz Konzentration Volumen je Endkonzentration der Stammlösung Reaktionansatz Reaktionspuffer 10x NEB-Puffer 2 1.50 µl 1x MseI 4 U/µl 0.30
TCC CCA GTG AAG ACC TCC TCA GAG TCC GAC TCT. 56 C 67 siehe oben siehe oben siehe oben 56 C 66 CCG GCG CCA TTC TAT CC CGA GAA TCT GAC GCA GG 56 C 738
128 9. Anhang 9.1. Tabelle der verwendeten Primerpaare Nr. Name Sequenz 5 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 rcar. 981s rcar. 981s GAPDH. 682s GAPDH. 826a GAPDH. 381s GAPDH. 826a 18S-rRNA. 216s 18S-rRNA.
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Merck Biosciences, Darmstadt. Thermo Hybaid GmbH, Ulm Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
3 Materialien 28 3 Materialien 3.1 Chemikalien Acrylamid Agar Agarose Ammoniumsulfat Ampicillin, Natriumsalz L-Arabinose Bradford-Reagenz Bromphenolblau Caseinhydrolysat Chloramphenicol Chloroform Coomassie-Brillant-Blau
A- Zugabe von 180µl Pufferlösung und Proteinase K, Inkubation bei 56 C. B- Zugabe von 200µl einer zweiten Pufferlösung, Inkubation bei 70 C
3 Methoden 3.1 Extraktion der DNA aus den Paraffinschnitten 3.1.1 Extraktions-Kit Das QIAamp DNA Mini Kit- System beruht auf dem Prinzip der Auflösung der Eiweiße mit Proteinase K, DNA Bindung an eine
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Material und Methoden 13 2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Gewebe 2.1.1.1 Gefriermaterial Für die Einzelzellanalyse wurden fünf Fälle des klassischen Hodgkin-Lymphoms (chl) ausgewählt. Dabei
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3,58 g 0,136 g. ad 100 ml
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Western Blots Monoklonaler Anti-c-myc von Boehringer (#1667149)...2 Polyklonaler Anti-c-myc Tag 409-420(cat#06-549/Lot#14966)...2 Anti-X-Press (#46-0528/Lot#800969)...2 Monoklonaler Anti-P-Tag (H902-ascites)...3
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Material 77 5 Material 5.1 Chemikalien Salze und Puffersubstanzen wurden in analytischer Qualität von den Firmen Invitrogen (Karlruhe, D), Merck (Darmstadt, D), Roth (Karlsruhe, D) und Sigma (München,
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Material 18 2. Material 2.1 Geräte, Software, Verbrauchsmaterial Verbrauchsmaterial 96-well-Mikrotiterplatten, durchsichtig TPP 96-well-Mikrotiterplatten, weiß Nunc 96-well-Zellkulturplatten TPP 96-well-Reaktionsplatten
Anhang. 1. Verwendete Abkürzungen
A Anhang 1. Verwendete Abkürzungen ACF AM Ap r/s AS ATR ß-Gal BlaM BSA bp C-Quelle CAT CFTR cfu CI CT dntp ECA EDTA ELISA EPS HAP IS Km r/s LB LPS Mbp mcs Min MBK MHK MOI MOPS MSHA NAD OD x ORF accessory
12-well Platte 15ml und 50 ml Zentrifugenröhrchen. Cryo Freezing Container. Elektrophorese- Mikrocomputer Elektrophorese-Kammer
11 2 MATERIAL 2.1. Geräte und Arbeitsutensilien Produkt 12-well Platte 15ml und 50 ml Zentrifugenröhrchen Combitips Cryo Freezing Container Cryoröhrchen Deckgläser 18mm Elektrophorese- Mikrocomputer Elektrophorese-Kammer
8 Anhang. 8.1 Vektorkarten und verwendete Sequenzen 8.1.1 Vektorkarten. Anhang 90
Anhang 90 8 Anhang 8.1 Vektorkarten und verwendete Sequenzen 8.1.1 Vektorkarten 8.1.1.1 Expression in Sf9-Zellen durch Baculoviren pfastbac1 mit GST (Firma Invitrogen) Anhang 91 pbsv-8his mit Signalpeptid
Material. Verwendungszweck WB: Western Blot FACS:Durchflusszytometrische Analyse IF: Immunfluoreszenz TZS: T-Zell Stimulation.
2 Material 2.1 Antikörper Antikörper und Bindungsmoleküle Klon Verwendungszweck WB: Western Blot :Durchflusszytometrische Analyse IF: Immunfluoreszenz TZS: T-Zell Stimulation Lieferant anti-cd16/32 mak
2. Material und Methoden
2. Material und Methoden 2.1. Material 2.1.1. Geräte BioPhotometer 6131 (Eppendorf, Hamburg, D.) Durchlichtmikroskop BX 60 (Olympus, Hamburg, D.) Durchlichtmikroskop MZ 12 (Leica, Bensheim, D.) Feinwaage
2 Material und Methoden
2 Material und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Chemikalien, Reagenzien und Reagenziensätze Die verwendeten Chemikalien und Reagenzien, wie z.b. Puffer, Salze, Säuren, Basen und organische Lösungen wurden
kanr camr F trad36, lac I q lacz M15 proab/supe thi (lac-proab), λimm434 (P1)
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2 Material und Methoden
2 Material und Methoden 2.1 Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel 2.1.1 Chemikalien (alphabetische Reihenfolge) Chemikalien 2-Mercapto-Ethanol Antibiotika (Penicillin 10000U/ml, Streptomycin 10mg/ml) Acrylamid/Bisacrylamid
2 Material und Methoden
2 Material und Methoden 21 Material 211 Chemikalien und Enzyme Die im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Chemikalien waren von analytischem Reinheitsgrad und wurden von den Firmen Biomol (Hamburg), Fluka
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Methoden 16 3 METHODEN 3.1 Isolierung von Nukleinsäuren 3.1.1 Präparation von Gesamt-RNA Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Myokard (LV, RA) wurde mittels CsCl-Ultrazentrifugation (Chirgwin et al., 1979)
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2. Material und Methoden 2.1 Verwendete Materialien 2.1.1 Chemikalien und Enzyme Alle verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, bei Sigma (München), Roth (Karlsruhe), Fluka (Buchs,
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4 Ergebnisse 4.1 Erstellung einer Mammakarzinom-spezifischen cdna- Expressionsbank in λ-phagen 4.1.1 RNA-Isolierung aus den Mammakarzinom-Zellinien BT-474 und 8701-BC Von jeder Zellinie wurden 4 x 10 7
2. MATERIAL UND METHODEN
2. Material und Methoden 10 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1 Materialien 2.1.1 Medien, Lösungen und Zusätze Die Zellkulturmedien DMEM und RPMI 1640, CMRL 1415, die Medienzusätze L-Glutamin (200 ), Penizillin/Streptomyzin
3 Material und Methoden
3 Material und Methoden Die Chemikalien wurden von Merck bezogen, wenn nichts anderes angegeben ist. Die verwendeten Primer wurden von Tib Mol Biol synthetisiert. Der Bezugsquellen-Nachweis ist auf Seite
2. Material und Methoden
9 2. Material und Methoden 2.1. Versuchstierhaltung und Embryonengewinnung Als Versuchstiere standen uns geschlechtsreife weibliche Hybridkaninchen (ZIKA-Hybriden, Basiszucht: Fa. Krieg, Niederwünsch)
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Aus dem Institut für Immunologie der Ludwig-Maximilians-Universität zu München Vorstand: Prof. Dr.rer.nat. Thomas Brocker Analyse einzelner disseminierter Mammakarzinomzellen durch Suppression Subtractive
Rank Xerox (UK) Business Services
Europäisches Patentamt European Patent Office Office europeen des brevets Veröffentlichungsnummer: 0 460 674 A2 EUROPÄISCHE PATENTANMELDUNG Anmeldenummer: 91109303.7 Int. Cl.5: C12N 15/13, C12P 21/08,
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von April 2001 bis April 2004 an der Klinik und Poliklinik für Chirurgie des Klinikums der Universität Regensburg. Die externe Betreuung übernahm Herr PD Dr.
4. Ergebnisse. Spezies Signalpeptid B- C-Domäne A-Domäne Total a
4. Ergebnisse 4.1. Relaxin 4.1.1. Equiden 4.1.1.1. Molekulare Charakterisierung 4.1.1.1.1. Prorelaxin cdna-sequenz Mit zwei degenerierten Oligonukleotidprimern, die entsprechend der bekannten Peptid-sequenzen
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Lehrstuhl für Zellbiologie der Technischen Universität München Wissenschaftszentrum Weihenstephan Univ.-Prof. Dr. Bertold Hock Erfassung und Bewertung von Genexpressionsmustern von Zebrabärblingen (Danio
7. Anhang. 7. Anhang. Abbildung 7.1: Aminosäuresequenz AtMYC2 im Wildtyp und in jin1. Unterschiede zwischen den Sequenzen sind rot unterlegt.
7. Anhang 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 jin1 MTDYRLQPTMNLWTTDDNASMMEAFMSSSDISTLWPPASTTTTTATTETTPTPAMEIPAQAGFNQETLQQRLQALIEGTHEGWTYAIFWQPSYDFSGASV AtMYC2 MTDYRLQPTMNLWTTDDNASMMEAFMSSSDISTLWPPASTTTTTATTETTPTPAMEIPAQAGFNQETLQQRLQALIEGTHEGWTYAIFWQPSYDFSGASV
Klonierung und Charakterisierung des. murinen Mlc1-Gens
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2. Material 16 2. Material 2.1. Versuchstiere Folgende Mausstämme wurden verwendet: Balb/c byj-mäuse (Balb/c) Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA B6.129P2-IL10 tm1cgn -Mäuse (IL10 -/- ) Jackson Laboratory,
Jackson Laboratories, Boston MA, USA Charles River, Sulzfeld, D Cambridge University, Cambridge, UK Dt. Rheumaforschungszentrum, Berlin, D
2 MATERIAL 2.1 Versuchstiere Mausstamm B10.PL BALB/c TG4 DO11.10 Anbieter Jackson Laboratories, Boston MA, USA Charles River, Sulzfeld, D Cambridge University, Cambridge, UK Dt. Rheumaforschungszentrum,
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