Bezeichnung Ursprungsgewebe Referenzen ATCC-Nummer. Caki 1 Nierenzellkarzinom Fogh and Trempe (1975) HTB46

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1 19 2. Material 2.1. Tumormaterial und Patientengut Die verwendeten Zelllinien wurden in der Abteilung Zell- und Gewebezüchtung des Institutes für Pathologie der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg nach Standardprotokollen kultiviert. Tabelle 2-1 führt die Zelllinien entsprechend ihrer Bezeichnung im ATCC Verzeichnis ( American Tissue and cell culture, auf. Die Zelllinie PancTu-1 stammt von der AG Kalthoff (Christian-Albrechts-Universität Kiel). Bezeichnung Ursprungsgewebe Referenzen ATCC-Nummer Caki 1 Nierenzellkarzinom Fogh and Trempe (1975) HTB46 LN CaP Prostatakarzinom Murphy (1980) CRL1740 PancTu 1 Pankreaskarzinom Kalthoff et al. (1993) ---- MCF-7 Mammakarzinom Surgman BJ et al. (1985) HTB-22 RD (13/95) embryonales Rhabdomyosarkom American Public Health Association (1992) CCL-136 Tab. 2 1 Übersicht über die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Karzinomzelllinien. In dieser Arbeit wurden von 154 NZK-, 175 PCA-Patienten und 333 Patientinnen der Gynäkologie (Mamma-, Ovarial-, Cervixkarzinome) Blutproben auf mögliche disseminierte Tumorzellen hin untersucht. Die angefertigten Zytospinpräparate begutachtete der erfahrene Pathologe OA Dr. U. Bilkenroth histologisch. Die Verschlüsselung der Proben und die Anonymisierung der klinischen Daten erfolgte entsprechend ihres chronologischen Eingangs. Zusätzlich wurde Tumorgewebe von 27 NZK-Patienten und 17 MMK-Patientinnen Gefriergewebe untersucht. Die verwendeten Tumorgewebe der NZK-Patienten einschließlich der Normalgewebeproben stammen aus dem Institut für Pathologie der Martin-Luther- Universität Halle-Wittenberg. Das Probenmaterial der MMK-Patientinnen stellte die Universitäts- und Poliklinik für Gynäkologie der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg bereit. Sowohl das Tumor- als auch das korrespondierende Normalgewebe wurden intraoperativ gewonnen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Weiterhin wurde von 71 NZK-Patienten Tumor- und Normalgewebe (eingebettetes Material) analysiert. Das Tumor- und Normalgewebe dieser Patienten stammt ebenfalls aus dem Institut für Pathologie der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg.

2 Chemikalien und Reagenzien 100 bp DNA Molekulargewichtsstandard Invitrogen, Karlsruhe AB Serum Biotest AG, Dreieich Acrylamid Bisacrylamid Lösung (29:1) 30 % Agarose Ammoniumpersulfat (APS) APAAP Kit Biocoll Separating Solution Biochrom KG, Berlin BlueSlick Borsäure Bromphenolblau Brücken AK CD45-Microbeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach Chloroform Cytokeratin 8/18 Novocastra, Newcastle, UK D Glucose Desoxynukleotidtriphosphate (dntp) Dextransulfat DMSO DTT Invitrogen, Karlsruhe Essigsäure Ethanol (96% reinst) Ethidiumbromid Ethylendiamintetraacetat (EDTA) FACS Clean FACS Flow FACS Rinse Ficoll 400 First Strand Buffer (5x) Invitrogen, Karlsruhe FKS Formaldehyd (37%) Formamid Harnstoff Hydrochinon Igepal Isoamylalkohol Isopropanol Kaliumchlorid KH 2 PO 4

3 21 N, N, N, N, - Tetramethylendiamin (TEMED) Na 2 HPO 4 *2H 2 O Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3 ) Natriumacetat Natriumchlorid Natriumdodecylsulfat (SDS) Natriumhydroxid Natrium-Pyruvat NH 4 -Puffer Invitek (IBL Martin, Wien) OFA Penicillin Phenol Rinderserumalbumin (BSA) RPMI-1640 Pulver Saccharose SAM New England Biolabs, Frankfurt a. Main Salpetersäure (32%) Silbernitrat Sodium-Bisulphit Streptomycin Tris (hydroxymethyl) aminomethan Tris (hydroxymethyl) aminomethan HCl Trypsin Tween 20 Xylencyanol Xylol Zellkulturmedium RPMI-1640 (mit 25 mm Hepes, L Glutamin) Zitronensäure 2.3. Enzyme Proteinase K CpG-Methylase (4U/µl) Expand High Fidelity PCR-System HotStarTaq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase TdT New England Biolabs, Frankfurt a. Main Roche, Mannheim Qiagen, Hilden Amersham, Freiburg

4 Kits Human Total Survivin ELISA IMUBIND Tissue PAI-1 ELISA Kit IMUBIND upa ELISA Kit IMUBIND upar ELISA Kit New Fuchsin Kit Wizard DNA Clean-Up System HLA-Typisierungsset (Italia-ABC 144) HLA Klasse II-Primerkits (HLA-DRB/-DQB1) HLA Klasse II-Primerkits (HLA-DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5, -DQB1) R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt Biotest AG, Dreieich BAG, Lich Dynal Biotech, Hamburg 2.5. Geräte und Verbrauchsmaterialien 10ml / 50ml Röhrchen automacs Gerät BioDocAnalyzer Dynal MPC Eppendorf Concentrator 5301 Hybridisierungsofen Laminarbox Mikroskop (Axiophot) Mikrotom Peltier ThermalCycler PT200 Pipettenspitzen 10 µl / 100 µl / 1000 µl Reaktionsgefäße 0,2ml / 0,5ml / 1,5ml / 2,0ml Roller RM5 Sequi Gen Gelkammer System Starfrost-Objektträger Thermomixer 5436 Trioblock - Thermozykler mit Heizdeckel Ultrospec III Universalzentrifuge 30 RF Zellkulturflaschen Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach Dynal Biotech, Hamburg Flow Laboratories, Meckenheim Zeiss, Jena Leica, Nussloch MJ Reasearch (Biozym, Hess. Oldendorf) Schütt Labortechnik, Göttingen BioRad, München Medite Medizintechnik, Burgdorf Hettich, Tuttingen

5 Puffer und Lösungen DNA Auftragspuffer: Ficoll 400 1,8 g Bromphenolblau 25 mg Xylencyanol 25 mg mit Aqua bidest. auf 10 ml auffüllen PBS: NaCl 8,0 g KCl 0,2 g Na 2 HPO 4 *2H 2 O 1,15 g KH 2 PO 4 0,2 g PBS zur Zellzucht: NaCl 8,0 g KCl 0,4 g NaHCO 3 0,35 g D Glucose 1,0 g RPMI RPMI-1640 Pulver 16,4 g FKS 8-10 % Trypsin Lösung: EDTA 0,2 g Trypsin 0,5 g in 1 l PBS zur Zellzucht lösen Zellkulturmedium: RPMI-1640 Medium 500 ml Antibiotikum 10 ml (Penicillin, Streptomycin) FKS 80 ml Na Pyruvat 5 ml