ANALYSE VON SERUMBESTANDTEILEN II

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1 130 PLATZ 5: ANALYE VON ERUMBETANDTEILEN II Mit der Dialyse wird ein einfaches Prinzip gezeigt, welches bei der Hämodialyse in der Medizin zur Anwendung gelangt. Im weiteren wird in diesem wie im vorangegangenen Platz 4 ein Einblick in die klinisch überaus wichtige Analyse von erumbestandteilen vermittelt. Die hierzu angewandten Methoden werden für mannigfache weitere analytische Zwecke eingesetzt. Theoretische Grundlagen: Dialyse (. 14) Gelchromatographie (. 30) Photometrie (. 31) Kohlenhydrate (. 9) EXPERIMENT 5.1: Dialyse von erum Ein ca. 15 cm langes tück Cellophanschlauch am einen Ende abbinden, 5 erum einfüllen und zweites Ende abbinden. chlauch in 100 Becherglas hängen. Destilliertes Wasser bis zum Rand zugeben. Nach 1/2-1 tunde je 2 Aussenflüssigkeit mit a) 2 Trichloressigsäure (10 %) versetzen (Protein-Nachweis) b) mit 1 Tropfen konzentrierter Essigsäure ansäuern und mit 5 Tropfen ilbernitratlösung versetzen. (Nachweis von Cl - als schwerlösliches AgCl). 2 einer Proteinlösung, die 1 M NaCl enthält, werde gegen 1 l Wasser dialysiert bis zum Gleichgewicht (etwa 5 td.). Darauf wird das Dialysewasser durch 1 l frisches Wasser ersetzt und weiter bis zum Gleichgewicht dialysiert. Wie gross ist die NaCl-Konzentration in der Proteinlösung nach der zweiten Dialyse? Weshalb kann diese Konzentration nur näherungsweise berechnet werden? EXPERIMENT 5.3: Colorimetrische Bestimmung von Phosphat Anorganisches Phosphat bildet mit Molybdänsäure Phosphormolybdänsäure H 3 [P(Mo 3 O 10 ) 4 ]. Diese ergibt bei Reduktion mit Ascorbinsäure einen blauen Farbstoff, dessen Konzentration photometrisch

2 bestimmt werden kann. Da Proteine die Bestimmung stören, werden sie mit Trichloressigsäure ausgefällt. Ausführung: Zu 1.5 erum 6.0 H 2 O und %ige Trichloressigsäure zusetzen, mischen und 5 min stehen lassen. Filtrieren. 6 RG folgendermassen ansetzen (Reagenzien in angegebener Reihenfolge zufügen): 131 A B C D E Blindwert Filtrat tandardlösung 0.3 mm Tichloressigsäure 10 % Wasser Molybdänsäure Ascorbinsäure Jedes RG kurz mischen (langes chütteln vermeiden). Genau 5 Minuten im Wasserbad auf 40EC erwärmen, dann auf Zimmertemperatur abkühlen. Extinktion der Ansätze im Photometer gegen Blindwert bei 546 nm ablesen. Extinktionen von C, D, und E gegen die im Ansatz vorhandene Phosphatkonzentration auf Millimeterpapier auftragen (Abszisse: Phosphatkonzentration mm; Ordinate: Extinktion) und Phosphatkonzentration in Ansatz A und B bestimmen. Millimolare Konzentration von Phosphat im Filtrat und in unverdünntem erum berechnen. EXPERIMENT 5.6: Enzymatische Bestimmung von Glucose Zur spezifischen Glucosebestimmung wird Glucoseoxidase (. 9) benutzt. Das in äquimolarer Menge gebildete H 2 O 2 wandelt ein Chromogen in einen Farbstoff um (bzw. wandelt eine Indikator-Vorläuferverbindung in eine Indikatorverbindung um, welche Licht im UV-Bereich absorbiert). Glucose-Reagens: Die jetzt käufliche Test-Kombination enthält in 0.1 M Phosphatpuffer, ph 7.0 Glucoseoxidase, Peroxidase und eine Verbindung, welche durch die Peroxidase und H 2 O 2 in eine Indikatorverbindung umgewandelt wird, die Licht bei 340 nm absorbiert (anstelle eines Chromogens, welches im sichtbaren Bereich absorbiert).

3 132 Ausführung: 0.1 Pferdeblut in ein vorbereitetes Zentrifugenglas mit 1 Perchlorsäure (0.33 M) geben, mischen, Gläser austarieren und in der Tischzentrifuge 5 min zentrifugieren. Klaren Überstand in ein Reagenzglas giessen, davon 0.1 für den Test verwenden. Probe tandard Blindwert Überstand Wasser Glucose-tandard (0.5 mm) Glucose-Reagens E 340 nm Konzentration im Blut:... mmol/l... mg/100 Mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Extinktion bei 340 nm im Photometer gegen Blindwert ablesen. Glucosekonzentration im Perchlorsäureüberstand und im Blut (mmol/l und mg/100 ) berechnen. Welches ist der Normalwert der nüchtern Blutglucose beim Menschen? Wozu dient die Perchlorsäure? Woher stammt die Glucose im Blut? EXPERIMENT 5.6 b: pezifischer Nachweis von Glucose mit Diabur-Teststäbchen Der Teststreifen enthält dieselben Reagenzien wie im obigen Versuch, aber in trockener Form und dient als semiquantitativer Nachweis von Glucose im Urin oder im Blut als " uchtest". Diese Art von in der medizinischen Praxis häufig verwendetem Test war der Vorläufer für die sog. "Trockenchemie" (Exp. 1.8). Ein Tropfen Glucoselösung 1 % auf ein Diabur-Teststäbchen geben und die Farbänderung nach genau 2 Minuten beurteilen (Anleitung auf dem Behälter befolgen). Test mit einem Tropfen Vollblut wiederholen. Nach genau 2 Minuten den treifen kurz mit Wasser abspülen und beurteilen. Warum muss der Teststreifen für den semiquantitativen Nachweis nach genau 2 Minuten abgelesen bzw. beurteilt werden?

4 133 EXPERIMENT 5.7 Bestimmung von Cholesterin im erum und in Lipoproteinen Durch Zugabe von Phosphorwolframsäure und Magnesiumionen zu Plasma oder erum werden Chylomikronen, VLDL (Very Low Density Lipoproteins) und LDL (Low Density Lipoproteins) ausgefällt. Nach Zentrifugation bleiben die HDL (High Density Lipoproteins) im Überstand. Freies und verestertes Cholesterin werden über gekoppelte Enzymreaktionen bestimmt, wobei als Endprodukt ein Farbstoff entsteht. Im Inkubationsansatz laufen folgende Reaktionen ab: Cholesterin- Cholesterinester + H 2 O > Cholesterin + Fettsäure esterase Cholesterin- Cholesterin + O 2 > 4-Cholestenon + H 2 O 2 oxidase Peroxidase 2 H 2 O Aminophenazon + Phenol > Farbstoff *) + 4 H 2 O *) 4-(p-Benzochinon-monoimino)-Phenazon Die Zunahme der Farbstoffkonzentration wird bei 500 nm photometrisch gemessen und ist der Cholesterinkonzentration direkt proportional. Material/Lösungen: Humanplasma Fällungsreagens (Phosphorwolframsäure / Magnesiumchlorid) Natriumcholat in Tris-Puffer Reagenslösung: enthält Cholesterinesterase, Cholesterinoxidase, Peroxidase, Phenol und 4- Aminophenazon, Detergens in Tris-Puffer, ph 7.6. Vorgehen: In Zentrifugenröhrchen 1 Fällungsreagens (= Lösung 1) vorlegen und 0.5 Plasma zugeben. Mischen, 10 min bei Raumtemperatur stehen lassen und anschliessend für 10 min zentrifugieren (Tischzentrifuge). Den klaren Überstand (enthält HDL) mit Pasteurpipette vollständig abtrennen und in frisches Röhrchen überführen und für Test verwenden. Präzipitat lösen mit 1 Natriumcholat (= Lösung 2) und für Testansatz verwenden. erum 5-fach verdünnen (0.2 mit 0.8 Wasser) und für Testansatz verwenden.

5 134 Blindwert erum Überstand Präzipitat (1:5 verd.) Wasser () Probe () Reagenslösung*) () E 500 nm Konzentration mm: Typische humane Blutprobe (Konz. mm) *)enthält Enzyme, ubstrate und Puffer, siehe oben. Mischen und nach 15 min Extinktion bei 500 nm gegen Blindwert ablesen. Bei einer 0.1 mm Cholesterinkonzentration im Küvettenansatz ist die Extinktion des Farbstoffes bei 500 nm Verdünnung berücksichtigen und Cholesterinkonzentration im erum, im Überstand (HDL-Fraktion) und im Niederschlag (LDL/VLDL-Fraktion) berechnen. Vor allem eine Erhöhung des Cholesterins in den LDL und VLDL lässt sich in einen Zusammenhang mit dem vermehrten Auftreten von Arteriosklerose bringen. Andererseits scheinen erhöhte HDL, welche sich in erhöhten HDL-Cholesterinwerten widerspiegelt, eine chutzwirkung zu haben. Die günstige Wirkung von HDL, wird damit in Zusammenhang gebracht, dass diese Lipoproteine überschüssiges Cholesterin aus den peripheren Geweben aufnehmen und in die Leber transportieren können, wo Cholesterin metabolisiert und mit der Galle ausgeschieden wird. Welche biologisch wichtigen Verbindungen leiten sich von Cholesterin ab? Wie können Lipoproteine aufgetrennt werden?