1. Hämatokrit-Bestimmung, Hämoglobingehalt-Bestimmung (Extinktionsmessung) 2. Gerinnungsfunktionsprüfung nach QUICK

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Hans Förstner
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1 Praktikumsaufgaben 1. Hämatokrit-Bestimmung, Hämoglobingehalt-Bestimmung (Extinktionsmessung) 2. Gerinnungsfunktionsprüfung nach QUICK Allgemeine Bemerkung: Die Blutproben sind Patientenmaterial. Bitte Handschuhe tragen und vorsichtig mit dem Blutmaterial um gehen! Alle Abfälle, die mit Blut in Kontakt gekommen sind (Röhrchen, Pipettenspitzen, Papier etc.), müssen gesondert gesammelt werden. 1. Station Stichworte: Funktion der Erythrozyten, Sauerstoffbindung 1.1 Hämatokrit Material: EDTA-Blut, Hämatokritkapillaren, Spezial-Zentrifuge Hämatokrit-Wert: Anteil der roten Blutkörperchen am Volumen des Blutes. Bestimmt wird der Hämatokrit-Wert, indem man eine ungerinnbar gemachte Blutprobe in einem Röhrchen zentrifugiert. Die schwereren roten Blutkörperchen setzen sich dabei ab und werden gemessen. Den Anteil der weißen Blutkörperchen an den zellulären Bestandteilen kann man dabei vernachlässigen. Der Hämatokrit ist sowohl von der Anzahl als auch vom Volumen der roten Blutkörperchen abhängig. Durchführung: Röhrchen mit EDTA-Blut aufschütteln eine Hämatokritkapillare wird in das Blut getaucht und zu etwa 90 % gefüllt. am unteren Ende der Kapillare ca. 2 mm weit Luft eindringen lassen unteres blutfreies (!) Ende der Kapillare mit Kitt abdichten (rechtwinklig in den geglätteten Kitt einstechen). die Hämatokritkapillare mit der zugekitteten Seite nach außen in die Zentrifuge setzen. Zum Gewichtsausgleich immer zwei Kapillaren gegenüber platzieren. Zentrifuge starten (ca. 5 min. ca g), stoppt automatisch zur Auswertung entweder die Prozentangaben in der Zentrifuge nutzen, oder (falls Anfangs- und Endpunkt nicht übereinstimmen) die Kapillare aus der Zentrifuge entnehmen und den Wert anhand des ausliegenden Nomogramms ablesen. Dazu die Kapillare auf die Ableseschablone legen und so verschieben,

2 bis die Blutuntergrenze auf dem Nullstrich liegt und die Plasmaobergrenze die 100 %-Linie gerade berührt. Dann den Hämatokrit in % ablesen. Schematische Darstellung eines Nomogramms zur Hk-Bestimmung Hämatokritwert (Ht) % Referenzbereiche: Kinder 1-4 Jahre: Vol. % 10 Jahre: Vol. % Erwachsene Männer: Vol. % Frauen: Vol. % Frage 1.1: Wann ist der Hämatokritwert verändert? 1.2 Hämoglobin Material: EDTA-Blut, Photometer, Küvetten, Pipetten (20 µl, 1000 µl), Transformationslösung, Zentrifuge, Caps Der Farbstoff Hämoglobin besteht aus einem Proteinanteil und Häm als prosthetische Gruppe. Beim Häm handelt es sich um ein Protoporphyrinringsystem mit zentralem Eisenatom. Die Sauerstoffbindung erfolgt am Eisenatom. Neben Sauerstoff können CO 2 und andere Liganden reversibel binden. Die Bestimmung des Hb-Gehaltes im Blut wird nach der Cyanhämiglobinmethode im Photometer ausgeführt. Für die photometrische Messung wird das Hämoglobin durch eine Transformationslösung in das sehr stabile Cyanhämiglobin überführt. Bei dieser Reaktion wird das Eisen im Hämoglobin oxidiert (durch Kaliumhexacyanoferrat(III)) und an die freiwerdende Bindungsstelle tritt ein Cyanid-Ion, so dass sich Cyanhämiglobin bildet. Das Reaktionsprodukt ist über lange Zeit stabil und zeigt ein Absorptionsmaximum bei 546 nm. (Lambert-Beersches Gesetz).

3 Durchführung: Die Reaktionslösung enthält Kaliumcyanid und Kaliumhexacyanoferrat(III) (giftig), deshalb besondere Vorsicht bei diesem Versuch. Jede Gruppe führt 1-2 Messungen durch. Es wird ein Leerwert (= nur Reagenz ohne Blut) angesetzt und als Referenz gemessen. Eppendorf-Cap (1,5 ml) beschriften: Leerwert bzw. Probe 1250 µl (= 2x 625 µl) Transformationslösung in jedes Cap vorlegen 5 µl Blut dazu pipettieren, durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren nachspülen, umschütteln 5 min. stehen lassen. 2 min. zentrifugieren (Eppendorfzentrifuge RPM) (immer 2 Caps gegenüber) Ansatz mit der Pipette in eine Einmalküvette pipettieren Am Photometer bei 546 nm Wellenlänge die Extinktion messen Leerwert als Abgleich (Extinktion = 0) verwenden. Auswertung: [c] Hämoglobin = Extinktion x 36,8 Hb[g]/dl Hämoglobingehalt (Hb) : Extinktion = Hb = g/100ml Referenzbereich: Männer: Hb/dl Frauen: Hb/dl Frage 1.2: Bei welchen Krankheiten ist der Hämoglobingehalt verändert?

4 2. Station: QUICK-Test Stichworte: Blutgerinnung, intrinsisches/extrinsisches System, Gerinnungsfaktoren Material: Citratplasma, Calcium-Thromboplastinreagenz, Wasserbad (37 C), Plastikreagenzröhrchen, Plastikhäkchen, 200µl µl-Pipette, Stoppuhr Mit dem Quick-Wert wird das extrinsische Gerinnungssystem untersucht. Dazu wird Citratplasma, das durch Komplexbindung von Ca 2+ -Ionen ungerinnbar geworden ist, durch Zugabe von Gewebethromboplastin zusammen mit Calcium zur Gerinnung gebracht. Die Zeit bis zum Auftreten des ersten Fibringerinnsels wird koagulometrisch als Prothrombinzeit bzw. Quick-Wert gemessen. Durchführung: Es kommt sehr genau auf die richtige Zeitnahme und Häkeltechnik an. Vor dem tatsächlichen Versuch einmal den Handlungsablauf trocken durchspielen! Versuch in 2er-Teams durchführen. Probe (= Citratplasma) bei Raumtemperatur aufbewahren. Wasserbad auf 37 C aufwärmen 1,1 ml (pro 5 Studenten) Calcium-Thromboplastinreagenz (STA Neoplastin Plus, Roche; vor Gebrauch schütteln!) bei 37 C inkubieren ein leeres 3,5 ml-röhrchen bei 37 C inkubieren 100 µl Plasma in das leere Plastikröhrchen pipettieren und genau 60 sek. inkubieren 200 µl Calcium-Thromboplastinreagenz (vorher gemischt!) zügig in die 100 µl Plasma zugeben und gleichzeitig die Stoppuhr starten 1-2mal pro Sekunde häkeln: ein Plastikhäkchen in der Mitte des Röhrchens senkrecht durch das Gemisch auf- und abbewegen sofort die Uhr stoppen, sobald sich ein gallertartiges Gerinnsel aus dem Ansatz herausziehen lässt die abgelesene Zeit ist die Thromboplastinzeit nach Quick Auswertung: Der Quickwert in % der Norm wird anhand der ausliegenden Kalibrationskurve graphisch ermittelt. Die Kalibrationskurve wurde mit Hilfe der benutzten Calcium- Thromboplastin-Charge und einer Verdünnungsreihe erstellt, die aus gepooltem Normalplasma hergestellt wurde. Dabei entspricht die Gerinnungszeit für das unverdünnte Plasma einem Wert von 100 %. Anhand der Bezugskurve können die gemessenen Zeitwerte in einen Prozentwert, den sog. Quick-Wert übertragen werden.

5 Gerinnungszeit (Quick) sek % Der Quick-Wert eines Plasmas gibt an, welche Verdünnungsstufe einer Normalplasmaverdünnung in NaCl-Lösung die gleiche Thromboplastinzeit hat wie das untersuchte Plasma. Referenzbereich: % der Norm Frage 2: Wann ist der Quickwert verändert? Wann ist eine Untersuchung des Quickwertes indiziert?

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