Praktikum Transfusionsmedizin

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1 Praktikum Transfusionsmedizin Humanmedizin 1. klinisches Jahr ÜBUNGEN: 1. Blutgruppenbestimmung AB0-System Die Blutgruppenbestimmung im AB0-System erfolgt: 1. durch Bestimmung der AB0-Antigene (Erythrozyteneigenschaften) 2. durch Bestimmung der Isoagglutinine (Serumeigenschaften) Testseren und Testzellen werden täglich überprüft Untersuchung der Erythrozyteneigenschaften (Plattentest): 1 Trpf. Testserum Anti-A (blau) 1 Trpf. Testserum Anti-B (gelb) 1 Trpf. Testserum Anti-A+B Zu jedem Testserum wird 1 Trpf. 5% ige Patientenerythrozytensuspension in isoton. NaCl- Lösung getropft. Negativkontrolle: 1 Trpf. 5% ige Pat.-Erythr.-Suspension wird in eine leere Vertiefung getropft. Inkubation ca. 15 min bei Raumtemperatur in feuchter Kammer. Ablesen: Überprüfung auf Agglutination oder Hämolyse auf hellem Hintergrund. Dokumentieren. Die Negativkontrolle darf keine Agglutination oder Hämolyse zeigen Untersuchung der Serumeigenschaften: 1 Trpf. Pat.-Serum + 1 Trpf. A1-Testerythrozyten 5% ig 1 Trpf. Pat.-Serum + 1 Trpf. A2-Testerythrozyten 5% ig 1 Trpf. Pat.-Serum + 1 Trpf. B -Testerythrozyten 5% ig

2 1 Trpf. Pat.-Serum + 1 Trpf. 0 -Testerythrozyten 5% ig Inkubation ca. 15 min bei Raumtemperatur in feuchter Kammer. Ablesen auf hellem Hintergrund. Dokumentieren. Stimmt des Ergebnis der Erythrozyteneigenschaften nicht mit dem der Serumgegenprobe überein, muss der Test wiederholt werden.! Sind die Serumeigenschaften nicht oder unvollständig ausgebildet, erfolgt eine Zweitbestimmung der AB0-Eigenschaften mit monoclonalen Testseren (anderer Klon als bei Erstbestimmung) im => Röhrchentest: Tropfschema wie bei Bestimmung der Erythrozyteneigenschaften im Plattentest: je 1 Trpf. Testserum + 1 Trpf. Pat.-Erythr. 5% ig in isoton. NaCl Zentrifugation (Immucent low ) 30 sec Ablesen auf hellem Hintergrund. Dokumentieren. 2. Bestimmung des Rhesus-Faktors D Die Bestimmung des Rh-Faktors D erfolgt stets mit 2 verschiedenen Testseren. Bei der Verwendung monoclonaler Testseren ist darauf zu achten, dass Reagenzien unterschiedlicher Klone verwendet werden. Die Angaben der Hersteller sind zu beachten Röhrchentest 1 Trpf. Anti-D-Testserum (1. Hersteller) 1 Trpf. Anti-D-Testserum (2. Hersteller) 1 Trpf. Rh-Control (= neg. Kontrolle) Trpf. Pat.-Erythr.-Susp (5-10% ig in isoton. NaCl-Lös.) 1 Trpf. Pat.-Erythr.-Susp. (5-10%ig in isoton. NaCl-Lös.) 1 Trpf. Pat.-Erythr.-Susp. (5 -!0%ig in isoton. NaCl-Lös.) - Röhrcheninhalt vermischen - 15 sec. (Immucent high ) - Sediment sorgfältig aufschütteln und über Lichtquelle auf Agglutination prüfen. - Dokumentieren. Für beide Testseren ist täglich eine Kontrolle mit D-positiven und D-negativen Testerythrozyten durchzuführen.

3 2.2. Plattentest: - Tropfschema wie beim Röhrchentest - Inkubation 10 min in feuchter Kammer - Ablesen auf hellem Hintergrund - Dokumentieren 3. Antikörpersuchtest Der Antikörpersuchtest gehört zu jeder Blutgruppenbestimmung. Er dient der Erkennung irregulärer erythrozytärer Antikörper im Serum des Patienten, die Transfusionszwischenfälle auslösen können. Er wird mit mindestens 2 Testerythrozytensuspensionen durchgeführt, welche sich in ihrem Antigenmuster ergänzen. Transfusionsrelevante Antikörper reagieren am empfindlichsten im indirekten Antihumanglobulintest bei 37 C. Deshalb ist dieser Test vorgeschrieben. Eine Antikörpersuche in anderen Milieus kann in Einzelfällen erforderlich sein. Vor einer Transfusion darf der Antikörpersuchtest nicht älter als 3 Tage sein. Die für die Antikörpersuche eingesetzte Blutprobe sollte nicht älter als 24 Std. sein. Hämolysierte oder zersetzte Blutproben sind ungeeignet. Die Antikörpersuche kann im Röhrchen, auf Gelkarten oder auf als Festphasentest durchgeführt werden. Antikörpersuche im Röhrchen im Dreistufentest: Durchführung: a ) Eigentest: 2 Trpf. Pat.-Serum + 1 Trpf. Pat.-Erythr.-Susp. (5% ig in isoton.nacl-lös.) b ) 2 Trpf. Pat.-Serum + 1 Trpf. Testrerythr.-Susp.I 2 Trpf. Pat.-Serum + 1 Trpf. Testerythr.-Susp. II 1. Stufe: 5 min Inkubation bei Raumtemperatur 2. Stufe: je Röhrchen 2 Trpf. Liss-Lösung zusetzen 10 min im Wasserbad bei 37 C inkubieren

4 3. Stufe: (ind. AHG-Test) 3 x waschen mit isoton. NaCl-Lösung je Röhrchen 2 Trpf. AHG-Serum zusetzen Kommt es zu einer Agglutination mit einer der Testerythrozytensuspensionen, liegt ein irregulärer erythrozytärer Antikörper vor, der über ein Differenzierungspanel identifiziert werden muss. Das Transfusionsblut darf das Antigen, gegen das der Antikörper gerichtet ist, nicht enthalten. Bei jeder Antikörpersuche wird eine positive und negative Kontrolle mitgeführt: - Pos. Kontrolle: 2 Trpf. Anti-D-Verdünnung + 1 Trpf. 0D-Erythr.-Susp - Neg. Kontrolle: 2 Trpf. Anti-D-Verdünnung + 1 Trpf. 0d-Erythr.-Susp. Um sicher zu stellen, dass auch schwache Antikörper erkannt werden, muss die Anti-D-Verdünnung so eingestellt sein, dass die pos. Kontrolle nur im AHG-Test ein positives Ergebnis zeigt. Alle negativ ausfallenden Antiglobulintests sind mit sensibilisierten Testerythrozyten zu überprüfen: - Zugabe von je 1 Trpf. Coombs-Kontrollzellen - gut vermischen - (30 sec mit Immucent low ) - ablesen Die Test ist nur gültig, wenn nach Zugabe der Coombs-Kontrollzellen zur Negativkontrolle der AHG- Test positiv wird. 4. Direkter Coombstest (DCT; Direkter Antihumanglobulintest) Der direkte Coombstest dient dem Nachweis von in vivo an die Erythrozyten gebundenen Antikörpern. Testdurchführung: Röhrchentest 1. In 2 Röhrchen je 1 Trpf. Pat.-Erythrozyten ( 5 % ig in isoton. NaCl) tropfen 2.Erythrozyten 3 x waschen (Coombs-Waschzentrifuge). Bei Waschen von Hand: Röhrchen mit isoton. NaCl-Lös. füllen; die Menge der Waschflüssigkeit sollte jeweils der 100fachen Menge des Erythrozytenvolumens entsprechen, damit das Serum vollständig entfernt wird. Gut mischen, und den Überstand entfernen. Den letzten Überstand vollständig dekantieren. 3. In jedes Röhrchen 2 Trpf. polyspezifisches AHG-Serum tropfen ( 2 verschiedene Hersteller)

5 4. Zentrifugation 60 sec. low. 5. Beurteilung nach Grad der Agglutination. Ergebnis dokumentieren. (Wichtig für zuverlässige Testergebnisse ist das richtige Aufschütteln des Erythrozyten-Sediments: Röhrchen schräg halten und leicht schütteln, bis sich das Sediment vollständig abgelöst hat. Danach Röhrchen leicht hin-und herbewegen, bis eine gleichmäßige Suspension der Erythrozyten oder Agglutinate beobachtet wird.) 6. Eine positive und eine negative Kontrolle mit beiden AHG-Seren ist mitzuführen Herstellung der positiven Kontrolle - In je 1 Röhrchen 1 Trpf. 1x gewaschene Erythrozyten 0D (5%ig in isoton. NaCl tropfen. - Je 1 Trpf. Anti-D-Verdünnung inkomplett 1:100 zugeben min bei 37 C im Wasserbad inkubieren. Weiterbehandlung der so sensibilisierten Erythrozyten wie die zu untersuchenden Probandenerythrozyten Jeder negativ ausfallende Coombstest ist mit sensibilisierten Erythrozyten zu überprüfen! 5. Die serologische Verträglichkeitsprobe (Kreuzprobe) Die Kreuzprobe ist vor jeder Transfusion durchzuführen, wobei der indirekte AHG-Test als sensitivste Methode Bestandteil der Untersuchung sein muss. Sie dient der Erkennung blutgruppenserologischer Unverträglichkeiten zwischen Spender und Empfänger durch Überprüfung der Verträglichkeit zwischen Empfängerserum und Spendererythrozyten (Majortest). Die für die Verträglichkeitsprobe eingesetzte Blutprobe muss eindeutig beschriftet sein: Name, Vorname, Geburtsdatum, Entnahmedatum. Hämolysierte oder zersetzte Blutproben sind ungeeignet. Kreuzprobe im Dreistufentest: Durchführung: Eigentest: 2 Trpf. Empfängerserum + Majortest: 2 Trpf. Empfängerserum + 1 Trpf Empfängererythr.-Susp. (5% ig in isoton.nacl-lös.) 1 Trpf. Spendererythr.-Susp. (5% ig in isoton. NaCl-Lös.) 1.Stufe: 5 min Inkubation bei Raumtemperatur

6 2. Stufe: je Röhrchen 2 Trpf. Liss-Lösung zusetzen 10 min im Wasserbad bei 37 C inkubieren 3. Stufe: 3 x waschen mit isoton. NaCl-Lösung je Röhrchen 2 Trpf. AHG-Serum zusetzen Vor jeder Kreuzprobe werden die AB0-Eigenschaft und der Rhesus-Faktor D im Röhrchentest überprüft. Bei jeder Kreuzprobe wird eine positive und negative Kontrolle mitgeführt: - Pos. Kontrolle: 2 Trpf. Anti-D-Verdünnung + 1 Trpf. 0D-Erythr.-Susp - Neg. Kontrolle: 2 Trpf. Anti-D-Verdünnung + 1 Trpf. 0d-Erythr.-Susp. Die Anti-D-Verdünnung muss so eingestellt sein, dass die pos. Kontrolle nur im AHG-Test ein positives Ergebnis zeigt. Alle negativ ausfallenden Antiglobulintests sind mit sensibilisierten Testerythrozyten zu überprüfen: - Zugabe von je 1 Trpf. Coombs-Kontrollzellen - gut vermischen - (30 sec mit Immucent low ) - ablesen Die Kreuzprobe ist nur gültig, wenn nach Zugabe der Coombs-Kontrollzellen der AHG-Test positiv wird. (Ebenso wie der Antikörpersuchtest kann auch die Verträglichkeitsprobe auf der AHG- Karte durchgeführt werden.)