1. Nachweis klinisch relevanter Antikörper gegen die zu. 2. Verhinderung der Neuimmunisierung. - Vertretbarer Arbeitsaufwand, schnelles Ergebnis
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- Eva Wetzel
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1 Prätransfusionelle Diagnostik Ziele der prätransfusionellen Diagnostik 1. Nachweis klinisch relevanter Antikörper gegen die zu transfundierenden Erythrozyten- zur Gewährleistung einer physiologischen Überlebenszeit der transfundierten Erythrozyten in vivo 2. Verhinderung der Neuimmunisierung Rahmenbedingungen: - Vertretbarer Arbeitsaufwand, schnelles Ergebnis - Angemessene Kosten Kristina Hölig Transfusionsmedizin Medizinische Klinik und Poliklinik I, Universitätsklinikum Carl Gustav Carus an der TU Dresden Schwerpunkte Antierythrozytäre Antikörper Nachweistechniken Vorgaben der Richtlinien Empfehlungen für die Praxis Was sind irreguläre Antikörper? Antikörper gegen Blutgruppeneigenschaften, die nicht bei allen (gesunden, erwachsenen) Individuen vorhanden sind. Entstehungsweise: - Natürliche Antikörper: Durch Stimuli aus Natur und Umwelt entstanden (Nahrungsmittel, Bakterien, Parasiten...) In der Regel nicht transfusionsrelevant - Autoantikörper In der Regel nicht unmittelbar transfusionsrelevant, aber Verkürzung der Erythrozytenüberlebenszeit möglich - Alloantikörper: Entstehung durch Alloimmunisierung (Schwangerschaften, Transfusionen) Sehr häufig transfusionsrelevant Welche Faktoren bestimmen klinische Relevanz der irregulären Antikörper? Immunogenität der Blutgruppeneigenschaften Reihenfolge fallender Immunogenität: D >> K > E,c >> Fy a > Jk a... Ig-Klassen (Subklassen) der Antikörper, Aktivierung von Komplement: IgM, IgG (IgG1 und IgG3) Frequenz der Antigene Bestimmt Verfügbarkeit kompatibler Konserven und Wahrscheinlichkeit der Immunisierung nach Garratty, Induktion Phagozytose: IgG 1: Moleküle/Erythrozyt IgG 3: Moleküle/Erythrozyt 1
2 Anzahl der Antigendeterminanten pro Erythrozyt ABO-System: 1-2 x 10 6 Rh-System: 1-3 x 10 4 (ähnlich Fy, Jk) Kell-System 2-5 x 10 3 Dosiseffekt: MNSs, Jk u.a. (= stärkere Reaktion bei homozygotem Allel) Rolle der Antigenfrequenz: Beispiele für Verfügbarkeit kompatibler EK Anti-E: 73% Anti-K: 91% Anti-c: 19% Anti-Fy a : 34% Problemsituationen: Anti-s: 11% Anti-e: 2% Anti-k: 0.2% Anti-Vel: 0.04% Kombinationen beachten! Reaktionsmuster der Antikörper Komplette/inkomplette Antikörper (IgG/IgM) Wärme/Kälteantikörper Verschwinden von Antikörpern Reverbi Blood Transfus 2008, 6; Untersuchung der Persistenz von 673 irreg. Ak über 9 Jahre ( ) Längste Persistenz: Anti-D Kürzeste Persistenz: Anti- Jk a Kein Einfluss: Alter, Geschlecht der Patienten, Vorhandensein multipler Antikörper Komplementaktivierung (bis C3d, komplett): Lyse intralienal, intrahepatisch oder intravasal Zerstörung der Antigene im Enzymtest Schwerpunkte Agglutinationstest klassisch mit Anti-Serum Antierythrozytäre Antikörper Nachweistechniken Vorgaben der Richtlinien Empfehlungen für die Praxis Objektträgertechnik 2
3 Geltechnik Reaktionsmuster nach Zentrifugation Agglutinationstests modern - Automatisierung Festphasentechnik Mikrotiterplatte (Capture, Solidscreen) positiv pos Gel auch mit Zusatz von Antihumanglobulin-Serum neg negativ Mikrotiterplatte Nachweis von Mischfeldagglutinationen Summers et al. Transfusion 49, 2009, Schnelltest Multicard Geltechnik Festphase Blutgruppe: OccD.Ee K+ 0% Rh(+) 100% Rh(+) 90% Rh(+) 50% Rh(+) 10% Rh(+) Welche Technik ist die beste??? Weisbach et al. Transfus Med 2006, 16; Untersuchung von 446 Seren (368 klinisch signifikante Antikörper, 78 geringer signifikante Antikörper ) Vergleich Röhrchentest mit modernen Techniken (3 Geltestsysteme, 1 Affinitätsadhärenztest, 2 Festphasentests) Ergebnis: Alle modernen Tests sensitiver, aber auch höhere Rate von falsch-positiven Ergebnissen Schlußfolgerung: Auch schwach reaktive Antikörper sind nicht selten klinisch relevant (DHTR!), daher sensitivere Tests empfohlen, entscheidend ist Spezifität und Automatisierbarkeit Schwerpunkte Antierythrozytäre Antikörper Nachweistechniken Vorgaben der Richtlinien Empfehlungen für die Praxis 3
4 Richtlinien Hämotherapie ( , letzte Anpassung ) Im Regelfall müssen vor allen invasiven und operativen Eingriffen, bei denen intra- und perioperativ eine Transfusion ernsthaft in Betracht kommt (z. B. definiert durch hauseigene Daten), ein gültiger Befund - der Blutgruppenbestimmung - des Antikörpersuchtestes (bei positivem Befund vorhandene Antikörper vor Transfusion differenzieren)... vorliegen Kasuistik: 55-jährige Patientin Blutgruppenbefund: BD Anti-Fy a Aktuell: Operation in Neurochirurgie Laminektomie Keine präoperative Bereitstellung von EK (geringe Transfusionswahrscheinlichkeit) Intraoperative Blutungskomplikation Keine ausreichende und rechtzeitige Verfügbarkeit kompatibler Ek, Blutung chirurgisch nicht beherrschbar Patientin verstirbt intraoperativ Untersuchungsverfahren Wahl der Untersuchungsmethoden... unter Berücksichtigung des aktuellen Wissensstandes Bei manueller Bestimmung Zweitablesung durch qualifizierte Person Bei maschineller Bestimmung vergleichbare Befundabsicherung (Erstablesung Automat, Zweitablesung MTA) Klärung unklarer Befunde durch den Verantwortlichen Regelmäßige Qualitätssicherungsmaßnahmen (interne und externe Qualitätskontrollen gemäß RiLi) Einhaltung der Vorschriften des MPG Bei Verwendung von 2 Chargen monoklonaler Testseren auf unterschiedliche Klone achten Qualitätsmanagement im immunhämatologischen Labor Die Aktivität und Spezifität der Antiseren im AB0 und Rh- Blutgruppensystem sind mindestens wöchentlich, zusätzlich bei Chargenwechsel, zu kontrollieren Die Kontrollen der Funktionstüchtigkeit von Ausrüstungsgegenständen und Geräten (Kühlschränke, Tiefkühlschränke, Zentrifugen, Trockenschränke, Wasserbäder, Kühlzentrifugen, Antiglobulin-Automaten, Waschzentrifugen) sowie die Kontrollen der erforderlichen Beschaffenheit der Chemikalien, Lösungen, Supplemente, Enzyme, Plasmen und Testzellen sind mindestens wöchentlich vorzunehmen. Qualitätsmanagement im immunhämatologischen Labor Antigenaustestung: Eine aktuelle Kontrolle zur Prüfung auf Autoagglutination der Probe muss vorliegen und gegebenenfalls mitgeführt werden.... Eine DNA-Typisierung kann als ergänzendes Untersuchungsverfahren zur Antigenbestimmung dienen. Antikörpersuchtest: Die Sensitivität und Spezifität des Antikörpersuchtests ist arbeitstäglich mit einem geeigneten Serum mit bekannter Antikörperspezifität von schwacher Reaktivität zu kontrollieren. Antikörpersuchtest Bestandteil der Blutgruppenbestimmung Wiederholung bei Verträglichkeitsprobe Gültigkeit 3 Tage (Tag der Blutentnahme plus 3 Tage) Ausnahmen: 7 Tage bei präoperativer Bereitstellung von EK`S wenn innerhalb der letzten 12 Monate keine Bluttransfusion oder Schwangerschaft (Verantwortung trägt transfundierender Arzt) Indirekter AHG-Test mit 2 Testery. Pflicht, weitere Techniken fakultativ, im Röhrchentest Coombskontrolle erforderlich Direkter AHG-Test: 2 verschiedene polyspezifische AHG- Reagenzien (anti-igg +/- anti-c3d) Antikörperidentifizierung: Klärung von Spezifität und klinischer Bedeutung, ggf. Nothilfepass! 4
5 Differenzierung irregulärer erythrozytärer Antikörper Serologische Verträglichkeitsprobe (Kreuzprobe) sollen homozygot vorhanden sein Spezialfall des Antikörpersuchtestes, deshalb Bestimmungen analog Indirekter AHG-Test (o. gleichwertige Methode ) Bestimmung ABO-Merkmale aus jeder neuen Blutprobe Gültigkeit 3 Tage (+Tag der Blutentnahme) Notfälle: Abweichungen von Richtlinien, Schnelltests möglich, aber: Dokumentation der Notfallindikation (transfund. Arzt)! Routine-Serologie muss auch nachträglich durchgeführt werden Schwerpunkte Antierythrozytäre Antikörper Nachweistechniken Vorgaben der Richtlinien Empfehlungen für die Praxis Empfehlungen für die klinische Praxis Standardisiertes Vorgehen: Eingriffe mit möglichem transfusionsbedürftigem Blutverlust - z. B. O,1% Transfusionswahrscheinlichkeit: Blutgruppe und Antikörpersuchtest Eingriffe mit >10% Transfusionswahrscheinlichkeit, keine irregulären Antikörper: Bereitstellung kompatibler Konserven ( Regelbedarf ) Eingriffe mit Transfusionswahrscheinlichkeit <10%, keine Antikörper, keine seltene Blutgruppe (Rh-negativ!): ggf. BAB-System ( Type, screen and hold - gedankliche Bereitstellung von Konserven, Kreuzprobe bei Bedarf) Auswahl von Erythrozytenkonzentraten zur Transfusion Vorgehen bei Nachweis irregulärer Antikörper Blutgruppenserologische Voraussetzungen: - ABO, D für alle Empfänger - Rh-Formel, K bei Mädchen/Frauen im gebärfähigen Alter, Langzeittransfusion, irregulären AK, Auto-AK - Ausschluß irregulärer Antikörper gegen Antigene in der Konserve Einschätzung Risiko/Versorgungsprobleme ggf. Maximalbedarf an kompatiblen Konserven bereitstellen ggf. Op verschieben, Eigenblutkonzept, Epo,... erwägen Wichtig: Kommunikation zwischen Klinik und Labor! Wertung von Nothilfepässen/Vorbefunden 5
6 Kasuistik: 49jährige Patientin (165kg!, multiple HLA-Ak) AML aus OMF, mehrere Schwangerschaften, mehrere frühere Transfusionen Blutgruppe: B ccddee K neg. Stationäre Aufnahme zur allogenen PBSCT (HLA-identer Bruder) X XXX X X X X X X XX X XX Transfusionsbedarf: 50 EK, 66 TBK (Crossmatch) 11% der Bccddee sind s-negativ! X XX X nicht ausgeschlossen: Anti- D, -C, -Cw,-N, -s Befund: Anti-D, Anti-C, Anti-s Wie viele EK müssen für 1 kompatible Konserve getestet werden? Patient Blutgruppe 0 : Anti-c, Anti-E und 5(6) weitere AK 87,5 % der Mischantikörper mit Beteiligung von AK gegen Kell u./o. C,c,D,E,e 7 Alloantikörper: 1 Patient oder 0,06% der Antikörperpatienten mit freundlicher Genehmigung: E. Sommerfeld, Dresden Anti- Fy(a) 1 von 3 EK Fy(a) negativ = 3 EK CCee testen 5 Alloantikörper: 4 Patienten oder 0,23 % der Antikörperpatienten Anti- Jk(b) Anti-S Anti-Cw Anti- Lu(a) V.a. Anti-M 1 von 4 EK Jk(b) negativ = 4 x 3 (12) EK CCee testen 1 von 3 EK S negativ = 4 x 3 x 4 (48) EK CCee testen 98% Cw negativ 92% Lu(a) negativ 1 von 5 EK M negativ = 4 x 3 x 4 x 5 (ca. 250) EK CCee testen Das nicht sicher bestätigte Anti-M wurde bei einer Anforderung von zuletzt 14 EK nicht berücksichtigt. mit Bielefeld freundlicher 2013 Genehmigung: E. Sommerfeld, Dresden 4 Alloantikörper: 6 Patienten oder 0,35% der Antikörperpatienten 3 Alloantikörper: 63 Patienten oder 3,67 % der Antikörperpatienten 2 Alloantikörper: 239 Patienten oder 13,94 % der Antikörperpatienten 1 Alloantikörper: 1404 Patienten oder 81,84 % der Antikörperpatienten Auswertung von 1714 Patienten mit Alloantikörpern ohne begleitende WAAK oder HTLA-AK; DRK-BSD Ost; Labor ITM Dresden Problematik der HTLA-Antikörper ( High titer low avidity ) Häufigkeit (Zeitraum von 3 a) mit freundlicher Genehmigung von A. Seltsam, Springe Imponieren meist als schwache Reaktionen im AHG-Test (Eigenkontrolle i. d. R. negativ, Absorption-Elution negativ) Mit handelsüblichen Differenzierungspanel nicht bestimmbar. Häufig keine oder fakultative klinische Relevanz. Vorgehen: Ausschluss von Anti-Ch und Rg durch Zugabe von Komplement (frisches ABO-kompatibles Serum) Differenzierung anstreben (Referenzzentren) in der Regel keine klinische Relevanz, aber: Gefahr der Zeitverzögerung bei Notfalltransfusionen! Information des Klinikers- Nothilfepass??? 6
7 Nachweis von anti-cha und anti-rga mit freundlicher Genehmigung von A. Seltsam, Springe 80jährige Frau; 0d ccddee K-, Vorbefund aus externem Labor: Anti-Chido (a) und anti-duffy(a) Kreuzprobe (Festphasentechnik, Automat) 11 von 11 EK 4+ AKS in Enzymtechnik negativ Durchführung der Kreuzprobe im Hemmtest Kasuistik: 36jährige Patientin Anamnese: 2 Schwangerschaften; keine Angaben zu früheren Transfusionen. Initiale Blutgruppenbestimmung: AB CcD.ee Kk; unspezifische Reaktionen im Enzymtest Aktuell: multiple Frakturen nach Fenstersturz Verlauf: Komplikationslose Transfusion von 7 Ek am Aufnahmetag (bei negativer Kreuzprobe) 5d danach nochmals komplikationslos 2 Ek transfundiert 2d später erneute Kreuzprobe: wechselnde schwache Reaktionen mit einigen Konserven (Enzym- und AHG-Test), einige Konserven verträglich In Antikörperdifferenzierung keine Zuordnung zu bestimmten Antigenen möglich??? Kreuzproben freigegeben, intraoperativ 2 Ek transfundiert akute intravasale Hämolyse Serologischer Befund: Anti-Vel Weiterer Verlauf: Klinische Stabilisierung der Patientin (Hb 4,0 mmol/l= 6,4g/dl) ohne weitere Transfusionen Perspektiven der Diagnostik: Cocktails rekombinanter Blutgruppenproteine mit freundlicher Genehmigung von A. Seltsam, Springe Verdacht auf Antikörper gegen hochfrequentes Antigen Neutralisierender Proteincocktail zur Inhibition von klin. relevanten AK gegen hochfr. AG Neutralisierender Proteincocktail Zur Inhibition von klin. irrelevanten AK gegen hochfr. AG Inhibition Keine Inhibition Inhibition Neutralisierung mit einzelnen Proteinen Spezialdiagnostik im Referenzlabor Neutralisierung mit einzelnen Proteinen Übersicht: Recombinant blood group proteins for use in antibody screening and identification tests Axel Seltsam and Rainer Blasczyk Current Opinion in Hematology : Acute haemolytic transfusion reactions due to weak antibodies that in vitro did not seem to be clinically significant B. Hoppe, L. Pastucha, A. Seltsam, A. Greinacher & A. Salama Vox Sanguinis 2002, 82; jähr. Mann aorto-coronarer Bypass, 2 Ek komplikationslos transfundiert, 4 Wochen später bei Notfalloperation 2 Ek gekreuzt, schwache Reaktionen im AHG-Test mit allen Konserven, nach Transfusion akute intravasale Hämolyse, nach Testdosis (30ml Ek) erneute Hämolyse, Entlassung ohne Transfusion anti-jmh (MAA negativ) 64jähr. Frau, OMF, polytransfundiert, Anti-Fy a, -S,-Jk a,-e bekannt, schwere Hämolyse (Lendenschmerzen und Makrohämaturie) nach 2 EK (Fy(a-), S-,Jk(a-), E-, danach positive Reaktionen mit allen gekreuzten Ek, nach Testdosis erneute AHTR keine Identifizierung des Antikörpers, keine kompatiblen Konserven gefunden, Patn. nach 3 Wochen an dekompensierter Anämie verstorben 7
8 Testung der klinischen Relevanz antierythrozytärer Antikörper 60 jähriger Mann mit CMMoL, A D In 10 Jahren 7 EK ohne Komplikationen transfundiert AKS positiv (Geltest und Röhrchentest)1-2+, DAT negativ 3 EK AD kompatibel (Plasma, Geltechnik, AHG,Anti-IgG), problemlos transfundiert 1 Woche danach: identische serolog. Befunde, erneut AD Konserven kompatibel verkreuzt Bei Transfusion akute Transfusionsreaktion, Intravasale Hämolyse, Nierenfunktionsstörung Nach Transfusion DAT+ mit anti-igg und anti-c3d Identifizierung von anti-hi (1:32 bei Raumtemperatur, reaktiv bis 37 C) Spätere Kreuzproben mit Serum und anti-c3d AHG-Serum Spätere Transfusionen von A1-EK komplikationslos, 2 Jahre später an Grunderkrankung verstorben Cr-51 Überlebenszeit Untersuchungsdauer 11 Tage, nuklearmedizin. Station erforderlich Monozyten-Monolayer-Assay in vitro Testung der Phagozytose beladener Erythrozyten durch Monozyten gesunder Spender (Dauer einige h, erfahrenes Labor erforderlich, Relevanz unsicher) modifizierte Oehlecker-Probe zügige Transfusion von 20-30ml Blut, 5min stoppen, Pat. beobachten, Blutprobe entnehmen, zentrifugieren, Überstand auf Hämolyse beurteilen Vorgehen bei multiplen irregulären Antikörpern Differenziertes Vorgehen hinsichtlich klinischer Relevanz: Einsatz verschiedener Differenzierungspanel, Untersuchungstechniken (Enzymtechnik, Kombination aus Enzym- und AHG-Technik, bithermische Ansätze...) Bei Dringlichkeit Kreuzprobe auf Verträglichkeit, Beratung des transfundierenden Arztes, (Dokumentation der Notfallindikation!) ggf. Klärung in Referenzlaboratorien Obligat klinisch relevante Antikörper (Rh-Ak, K, Fy, Jk, Ss,...) immer beachten (außer vitale Indikation-Massivtransfusion!) Fakultativ klinische relevante Antikörper (M, N, Le a...) Kreuzprobe auf Verträglichkeit, im Routinefall beachten Irrelevante Antikörper (Kälte-Ak, HLA, HTLA) ignorieren Autoren postulieren eine spezielle Responderpopulation - unabhängig von Diagnose, Alter und weitgehend unabhängig von der Zahl der verabreichten Erythrozytenkonzentrate Vorschlag: Gabe von extensiv gematchten Präparaten an diese Responder bereits nach Entwicklung des ersten Antikörpers Responderhypothese 8
9 Pool J, Daniels G: Blood Group Antibodies and their Significance in Transfusion Medicine Transfusion Medicine Reviews 21 (2007);58-7 Was tun bei positivem Eigenansatz/DAT??? Kommunikation mit Klinik: Grunderkrankung? Transfusionsanamnese? Aktuelle Therapie? Dringlichkeit der Transfusion? Bei Dringlichkeit (und negativer Transfusionsanamnese) Freigabe von (möglichst Rh-Formel- und Kell-kompatiblen) Konserven, Beratung des transfundierenden Arztes! Im Regelfall Abklärung durch Elution, ggf. molekularbiologische Bestimmung transfusionsrelevanter Antigene, ggf. Auto- oder Alloadsorption... Vorgehen bei Panagglutination nach Chiaroni et al. Transfusion 49, 2009, Klinische und Transfusionsanamnese (!) 2. Variable oder uniforme Reaktivität? Gemisch verschiedener Allo-AK Allo-AK gegen hochfrequentes Ag oder Auto-AK 3. Phäno- ggf. Genotypisierung 4. Beurteilung Eigenkontrolle, Durchführung von Autound Alloadsorption Reduktion der Reaktivität nach Auto- und Alloadsorption Auto-AK Keine Reduktion der Reaktivität nach Autoadsorption, Reduktion nach Alloadsorption Allo-AK gegen Hochfrequentes Ag Keine Reduktion der Reaktivität nach Auto- und Alloadsorption HTLA-AK oder Hochtitriger Allo-AK Worst Case Scenario Irregulärer Antikörper (hämolyt. aktiv, gegen hochfrequentes Antigen...) + Klinischer Notfall (Polytrauma, akute Gastrointestinalblutung...) Beratung über klinische Relevanz des konkreten Antikörpers, Suche nach am wenigsten unverträglichem Blut Evtl. modifizierte Oehlecker-Probe Evtl. vorübergehend Transfusion von inkompatiblen Konserven Parallel: Nutzung intraoperativer Autotransfusion Überregionale Suche nach kompatiblen Konserven Einbestellung spezieller Spender (Verwandte)... Längerfristige Konsequenzen aus serologischen Problemfällen Bestätigung in Referenzeinrichtung (Befundabsicherung) Nothilfepass! + EDV! E. A. Hod, S. A. Arinsburg, R. O. Francis, J. E. Hendrickson, J. C. Zimring & S. L. Spitalnik Rechtzeitig genügend Konserven bereitstellen! Möglichst Eigenblut asservieren (evtl. Epo) Evtl. gerichtete Spenden von Verwandten organisieren Beschaffung von verträglichen Konserven aus überregionalen Blutbanken mit TTK-Abteilung Zurückhaltend transfundieren 9
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