Durchflusszytometrische Detektion antigranulozytärer Antikörper

Transkript

1 Durchflusszytometrische Detektion antigranulozytärer Antikörper Matthias Heinzl Univ.-Klinik für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin der Medizinischen Universität Wien Ao.Univ.-Prof. Dr. Günther Körmöczi

2 GranulozytäreAntigene HLA-Klasse I HNA System = human neutrophil alloantigen

3 HNA-Antigene Antigengruppe Expression auf Antigene HNA- 1a HNA-1 Granulozyten HNA-1b HNA-1c HNA-2 Granulozyten HNA-2 HNA-3 HNA-4 HNA-5 Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten HNA-3a HNA-3b HNA-4a HNA-5a BuxJ., VoxSang, (4): p

4 AntigranulozytäreAntikörper Involviert in: TRALI (transfusion-related acute lung injury) Neonatale Immunneutropenie(NIN) Autoimmunneutropenien Unwirksamkeit von Granulozytentransfusionen Febrile Transfusionsreaktionen (FNHTR) BuxJ., VoxSang, (4): p

5 Detektion von HNA AK Standardmethoden: GIFT GAT MAIGA Screeningmethoden AK-Spezifizierung Neue Methoden: Luminex Flow-GIFT

6 GIFT Granulozytenimmunfluoreszenztest GAT Granulozytenaggregationstest Bilder: Marlies Schönbacher

7 Flow-GIFT = durchflusszytometrischer Granulozytenimmunfluoreszenztest Sekundärantikörper bindet an getesteten AK Evaluation im Durchflusszytometer Mean fluorescensce intensity(mfi) Vergleich mit Negativkontrolle positiv bei Ratio > 2 Zellpanel von 3 Spendern Erfassung aller HNA Antigene Automatisierbar! Sehr sensitiv Nguyen X.D. et al., Transfusion, 2009.

8 Ein HNA-1b AK im Flow GIFT

9 Sensitivität & Spezifität Sensitivität: 100% bei 12 HNA-Testsera(Gesamtergebnis) Spezifität: 95,5% bei 22 Negativkontrollen

10 Fragestellung Prävalenz von HNA AK unklar Bis zu 3% bei Schwangerschaftsanamnese Deutlich seltener als HLA-AK (bis zu 33% bei SS- Anamnese) Risikogruppen? Blutgruppen (BG)-Alloimmunisierte? Middelburg R.A. et al., VoxSang, 2011.

11 Warum BG-AK als Risikoindikator? BG-AK sind Risikoindikator für weiteren BG-AK bei Retransfusion 1 HLA-AK² Konzept des immunological responder BG-AK und granulozytenreaktive AK? 1. Schonewille H. et al., Transfusion, Buetens O. et al., Transfusion, 2006

12 Studiendesign AK-Screening mit flow-gift 333 Proben von Frauen mit SS-Anamnese davon 143 mit BG-AK, 190 ohne BG-AK

13 Ergebnis GranulozytäreAK RBC alloimmunised group Control group Total Anti-granulocyte No anti-granulocyte reactivity reactivity Total 38.5% 61.5% % 70.5% % 66.7% 333 Keine signifikante Assoziation zwischen BG- und antigranulozytärer Alloimmunisierung (p=0,085)

14 Ergebnis LymphozytäreAK Anti-lymphocyte reactivity No anti-lymphocyte reactivity Total RBC alloimmunised group Control group Total 40.6% 59.4% % 70.5% % 65.8% 333 Signifikante Assoziation zwischen BG- und antilymphozytärer Alloimmunisierung (p=0,035)

15 Probleme Differenzierung HLA vs HNA Antikörper MAIGA-Etablierung notwendig Geringe Spezifität? (antigranulozytäre AK in 33%) Plasmaproben verändern Zelleigenschaften und Fluoreszenzwerte

16 Veränderung der Zelleigenschaften durch EDTA-Plasmaproben

17 Zusammenfassung Flow-GIFT ideale Screeningmethode Sensitiv, automatisierbar, objektive Beurteilung Nur mit Serumproben! BG-AK kein signifikanter Risikoindikator für antigranulozytäreak

18

19 Positive Probe

20 Sample code Antibody specificity Ratios on granulocytes of donor A Ratios on granulocytes of donor B Ratios on granulocytes of donor C Interpretation GR001 HNA-1a Granulocyte reactive GR340 HNA-1a + HLA Granulocyte reactive GR002 HNA-1b Granulocyte reactive GR337 HNA-1b Granulocyte reactive GR342 HNA-1b + HLA Granulocyte reactive GR003 HNA Granulocyte reactive GR004 HNA-3a Granulocyte reactive GR336 HNA-3a Granulocyte reactive GR160 HNA-3a Granulocyte reactive GR161 HNA-3a Granulocyte reactive GR341 HNA-3b Granulocyte reactive GR005 HNA-4a + HLA Granulocyte reactive

21 Zahl der Schwangerschaften & AK-Prävalenz 60,0% 50,0% antibody pre revalence 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% Anti-granulocyte reactivity Anti-lymphocyte reactivity 0,0% >3 number of pregnancies p=0,07 für antigranulozytäre AK, p<0,001 für antilymphozytäre AK;

22 Multivariate Analyse: Risiko für antigranulozytäreak Odds Ratio P value RBC alloimmunisation pregnancies pregnancies >3 pregnancies

23 Methodenvergleich Anti-granulocyte reactivity in Flow-GIFT No anti-granulocyte reactivity in Flow-GIFT Total Negative in GIFT and GAT Reactive in GIFT or GAT Total Cohen s κ = 0,592

24 Relative AK Häufigkeiten A. Reil, Diagnostik der transfusionsassoziierten akuten Lungeninsuffizienz

25 Vlaar; Transfusion-related acute lung injury: a clinical review; The Lancet; 2013

26 Anti-granulocyte reactivityin flow-gift Positive in GIFT orgat Anti-lymphocyte reactivityin flow-gift

27 BiphasischeReaktivitäteinesHNA-2 AK auf Granulozyten

28 Greatervariabilityoffluorescence levelsin plasmasamples Mean fluorescence int tensity Serum Plasma 0 negative control 1 negative control 2 negative control 3 negative control 4

29 granulocyte reactivity after platelet absorption 22,00 20,00 18,00 16,00 no absorption absorption 14,00 12,00 ratio 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 HLA-A2 HLA-B14 HLA-A2 HLA-A2 HNA-1a+HLA HNA-1b HNA-2 HNA-3a HNA-4a antibody specificity

30 serial dilution of samples: anti-granulocyte reactivity 18,00 anti-hna-1a + anti-hla 16,00 anti-hna-1b anti-hna-2 14,00 anti-hna-2 anti-hna-3a 12,00 anti-hna-3b anti-hna-4a 10,00 anti-hna-4a ratio anti-hla class I 8,00 cut off 6,00 4,00 2,00 0,00 1 1:2 1:4 1:8 level of dilution

31 Zusammenfassung flow-gift Vorteile: Automatisierbar ideal für große Screenings Hohe Sensitivität Erkennt auch antilymphozytäre AK Beurteilung objektiver Nachteile: Nur mit Serumproben Falsch positive Ergebnisse Nguyen X.D. et al., ScientificWorldJournal, 2011

32 Zusammenfassung BG-AK als Risikoindikator BG-AK keine signifikante Risikogruppe für antigranulozytäre AK weitere Untersuchungen nötig, um möglichen Zusammenhang zu zeigen

33 Ziele des Projekts Etablierung granulozytenspezifischer Methoden GIFT, GAT, flow-gift, Luminex, Bisher in keinem österreichischem Zentrum Immunisierungsrate alloexponierter Frauen BG-Alloimmunisierung = Risikogruppe??

34 Klinische Relevanz Granulozytenimmunologienotwendig für Diagnostik von Transusionsreaktionenund Immunneutropenien Große Screenings mit flow-gift Erweiterte Untersuchungen bei BG-AK vor Granulozytentransfusionenund bei Plasmaspenden

35 Problemstellung -Methode Bisher keine Granulozytenimmunologie in Ö GAT, GIFT, MAIGA: aufwändige Methoden Flow-GIFT bisher keine Standardmethode