1.1. Grundlage aller enzymkinetischen Untersuchungen ist die Michaelis-Menten- Gleichung: V 0 = V max x [S] K m + [S]

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1 1.1 ABSHNITT 1: ENZYME Einführung Enzyme sind informationelle Makromoleküle und als solche Instrumente gezielter Prozeßsteuerung. Sie haben eine katalytische und eine kognitive Funktion. Die katalytische Funktion kommt in der Beschleunigung der Gleichgewichtseinstellung einer thermodynamisch möglichen Reaktion zum Vorschein. Kraft ihrer kognitiven Funktion bauen die Enzyme Stoffwechselketten auf und unterhalten dadurch dynamische Ordnungsgefüge. Über die Quantität eines Enzyms in Geweben und Körperflüssigkeiten, über seine Substrat- und Wirkungsspezifität, über seine Affinität zum Substrat, über seine Abhängigkeit von der H-Ionen-Konzentration und von der Temperatur, über die Beeinflußbarkeit seines aktiven Zentrums durch Effektoren erhält man Aufschluß durch das Studium der Kinetik der von ihm katalysierten Reaktion. Unter der katalytischen Aktivität (z) eines Enzyms versteht man die Erhöhung des Umsatzes (z.b. Menge Substrat/Zeiteinheit) einer chemischen Reaktion unter bestimmten Bedingungen um 1 Mol pro Sekunde (Einheit: Katal; Symbol: kat). Die katalytische Aktivität ist nicht mit der Reaktionsgeschwindigkeit (Reaktionsgeschwindigkeit: dc/dt (Konzentrationsänderung!/t)) zu verwechseln, läßt sich aber für definierte Bedingungen daraus berechnen (z = Reaktionsgeschwindigkeit x Volumen). Im allgemeinen ist die katalytische Aktivität der Menge eines Enzyms direkt proportional, wobei dann 1 Katal derjenigen Enzymmenge entspricht, die 1 Mol pro Sekunde umsetzt. Analog der Enzymkonzentration kann die katalytische Aktivität dann als katalytische Aktivitätskonzentration (b) (kurz: katalytische Konzentration; Einheit: kat/l) angegeben werden. Weitere abgeleitete Größen der katalytischen Aktivität sind die spezifische katalytische Aktivität (katalytische Aktivität pro Menge Protein; Einheit: kat/kg) und die molare katalytische Aktivität (katalytische Aktivität pro Mol Enzym; Einheit: kat/mol). Am Beispiel der Proteinase (Peptidase) Trypsin werden Experimente zur Enzymkinetik unternommen, wobei wir uns, mit Blick auf die Klinik, auch in die Grundlagen der Enzymdiagnostik einarbeiten wollen. Grundlage aller enzymkinetischen Untersuchungen ist die Michaelis-Menten- Gleichung: V 0 = V max x [S] K m + [S] (V 0 Initialgeschwindigkeit, V max Maximalgeschwindigkeit, K m Michaelis-Menten-Konstante, [S] Substratkonzentration). Ziel des Versuchs ist es, daß der Umgang mit disergleichung erlernt wird. Dazu gehören die Berechnung von V max und K m sowie der abgeleitetetn Größe K cat und K cat /K m. In einer ergänzenden omputersimulation von Enzymkinetiken wird der Vorteil einer nicht-linearen Anpassung der Daten im Vergleich zum Auswerten nach Lineweaver-Burk dargestellt. Allgemeine Methodik Die natürlichen Substrate des Trypsins sind Nahrungseiweiße. Deren Spaltung ist jedoch nicht exakt quantitativ zu verfolgen. Man bedient sich deshalb eines künstlichen Substrates (chemische Konstitution s. unten). Da die Spezifität von Trypsin auf Peptidbindungen ausgerichtet ist, die von der arboxylgruppe des Arginins ausgehen, behandelt Trypsin das künstliche Substrat BAPA wie eine von Arginin ausgehende Peptidbindung in einem Eiweiß.

2 1. Substrat: HN (H ) 3 O H NO N α -Benzoyl-arginin-p-nitroanilid abgekürzt: BAPA BAPA ist schlecht wasserlöslich. Durch Zusatz von DMSO Dimethylsulfoxid) wird es im Testansatz in Lösung gebracht. O Trypsin HN (H ) 3 O H + H N NO OOH Erstes Spaltprodukt (ungefärbt) N α -Benzoyl-arginin Das zweite Spaltprodukt p-nitroanilin ist gelb gefärbt. Seine Entstehung im Verlauf der Spaltungsreaktion wird als Zunahme der Extinkltion bei 405 nm quantitativ spektrophotometrisch bestimmt. Benzamidin verlangsamt die Trypsin-katalysierte Spaltung von BAPA. Hieraus resultiert die Aufgabe, Benzamidin als kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitor zu identifizieren.

3 1.3 Benzamidin: Der Testansatz zur Messung der Geschwindigkeit der Trypsin-katalysierten Spaltung von BAPA in Abwesenheit des Inhibitors enthält folgende Komponenten: 1. Substrat (BAPA) gelöst in Wasser unter Zusatz von DMSO. Puffer (Tris-Hl; ph = 8,0) 3. Enzym (Trypsin gelöst in Hl) Der Testansatz zur Messung der Geschwindigkeit der Trypsin-katalysierten Spaltung von BAPA in Gegenwart des Inhibitors enthält folgende Komponenten: 1. Substrat (BAPA) gelöst in Wasser unter Zusatz von DMSO. Puffer mit Inhibitor (Tris-Hl mit Benzamidin) 3. Enzym (Trypsin gelöst in Hl) Anleitungen zum Pipettieren der Testansätze finden Sie jeweils unter "Spezielle Methodik". Die Reaktion wird jeweils durch Zugabe des Enzyms zum Substrat-Puffer-Gemisch gestartet. Sodann wird die den Testansatz enthaltende Küvette in den Lichtweg (405 nm) des Photometers gebracht. Das im Verlauf der Spaltung frei werdende p- Nitroanilin färbt den Küvetteninhalt gelb. Das fortlaufende Entstehen des Farbstoffes wird als Zunahme der Extinktion bei 405 nm registriert. Die Extinktionszunahme pro Zeiteinheit ( E/Min.) ist ein Maß für die Spaltungsgeschwindigkeit vo. Aufgabenstellung: 1. Einfluß verschiedener Substratkonzentrationen [S] auf die Initialgeschwindigkeit vo der Trypsin-katalysierten Spaltung des Substrates BAPA Substratkonzentrationen [S] b) Graphische Darstellung der unter Punkt 1a) ermittelten c) Berechnung von V max, K m, Kcat/Km

4 . Einfluß eines dem Testansatz zugesetzten Inhibitors (Benzamidin) auf die Trypsin-katalysierte Spaltung des Substrates BAPA 1.4 Substratkonzentrationen [S] in Gegenwart des Inhibitors b) Graphische Darstellung der unter Punkt a) ermittelten c) Berechnung von Vmax und Km d) Ermittlung und Begründung des Hemmtyps 3. Einfluß verschiedener Enzymkonzentrationen [E] auf die Initialgeschwindigkeit vo der Trypsin-katalysierten Spaltung des Substrates BAPA Enzymkonzentrationen b) Graphische Darstellung der unter Punkt 3a) ermittelten c) Beschreibung des gefundenen Zusammenhanges Spezielle Methodik 1. Einfluß verschiedener Substratkonzentrationen [S] auf die Initialgeschwindigkeit vo der Trypsin-katalysierten Spaltung des Substrates BAPA Substratkonzentrationen Versuchsdurchführung Pipettiere DMSO/HO, Tris/Hl und BAPA/DMSO anhand von Pipettierschema 1 in die mit 1 bis 7 numerierten Reagenzgläser. Da die Reaktion durch Zugabe von Trypsin gestartet wird, erfolgt der Zusatz von Trypsin erst unmittelbar vor der eigentlichen Messung d.h. nach Abschluß der vorausgehenden Messung. Nachdem Trypsin zum ersten Reaktionsansatz pipettiert wurde, wird der Ansatz sofort gut durchmischt und der Inhalt des Reagenzglases in eine Küvette überführt. Die Küvette wird in den Lichtweg des Photometers (405 nm) gestellt, das Photometer auf den rechten Skalenendpunkt abgeglichen und die Extinktion über einen Zeitraum von 4 Minuten alle 30 Sekunden abgelesen. Das im Verlauf der Spaltung freigesetzte p-nitroanilin wird als Zunahme der Extinktion bestimmt. Die abgegelesenen Werte werden in ein Koordinatensystem eintragen: Ordinate: Extinktion bei 405 nm Abszisse: Zeit in Minuten Lege eine Ausgleichsgerade durch die Meßpunkte. Der Anstieg der Geraden ( E/min) ist ein Maß für die Initialgeschwindigkeit vo.

5 1.5 Pipettierschema 1: Ansatz DMSO/HO [ml],65,35,00 1,65 1,35 1,00 0,00 Tris/Hl [ml] 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80 BAPA/DMSO [ml] 0,35 0,65 1,00 1,35 1,65,00 3,00 Trypsin [ml] 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Gesamtvolumen [ml] 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 b) Graphische Darstellung der unter Punkt 1a) ermittelten Vervollständige folgende Tabelle: Ansatz [S] mmol/l 1 0,35 0,65 3 1,00 4 1,35 5 1,65 6,00 7 3,00 1/[S] l/mmol vo E/Min 1/vo Min/ E - Graphische Darstellung nach Michaelis-Menten: vo gegen [S] - Graphische Darstellung nach Lineweaver-Burk: 1/vo gegen 1/[S] c) Ermittlung des V max - und K m -Wertes aus dem Lineweaver-Burk- Diagramm (Angabe von V max in Katal) d) Berechnung von K cat und K cat /K m (Trypsinkonz. 5 µg/ml; Molekulargewicht Dalton)

6 1.6. Einfluß eines dem Testansatz zugesetzten Inhibitors (Benzamidin) auf die Trypsin-katalysierte Spaltung des Substrates BAPA Substratkonzentrationen [S] in Gegenwart des Inhibitors Versuchsdurchführung: Zur Versuchsdurchführung siehe Erläuterungen zu Punkt 1a). Pipettierschema : Ansatz DMSO/HO [ml],90,30 1,80 1,30 0,90 0,50 0,00 Inhibitor [ml] 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 BAPA/DMSO [ml] 0,40 1,00 1,50,00,40,80 3,30 Trypsin [ml] 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Gesamtvolumen [ml] 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 b) Graphische Darstellung der unter Punkt a) ermittelten Vervollständige folgende Tabelle: Ansatz [S] mmol/l 1 0,40 1,00 3 1,50 4,00 5,40 6,80 7 3,30 1/[S] l/mmol vo E/Min 1/vo Min/ E - Graphische Darstellung nach Michaelis-Menten: vo gegen [S] - Graphische Darstellung nach Lineweaver-Burk: 1/vo gegen 1/[S] c) Ermittlung des V max - und K m -Wertes aus dem Lineweaver-Burk- Diagramm für die inhibierte Reaktion (Angabe von Vmax in Katal) d) Ermittlung und Begründung des Hemmtyps

7 Einfluß verschiedener Enzymkonzentrationen [E] auf die Initialgeschwindigkeit vo der Trypsin-katalysierten Spaltung des Substrates BAPA Enzymkonzentrationen Versuchsdurchführung: Zur Versuchsdurchführung siehe Erläuterungen zu Punkt 1a). Die Meßzeit in diesem Versuch beträgt 4 Minuten, wobei jede Minute abgelesen wird. Pipettierschema 3: Ansatz Tris/Hl [ml] 1,30 1,10 0,90 0,70 BAPA-DMSO [ml] 1,50 1,50 1,50 1,50 Trypsin [ml] 0,0 0,40 0,60 0,80 Gesamtvolumen [ml] 3,00 3,00 3,00 3,00 b) Graphische Darstellung der unter Punkt 3a) ermittelten (Bestimmung der Initialgeschwindigkeit vo) Ordinate: Extinktion bei 405 nm Abszisse: Zeit in Minuten Lege eine Ausgleichsgerade durch die Meßpunkte. Der Anstieg der Geraden ( E/min) ist ein Maß für die Initialgeschwindigkeit vo. c) Graphische Darstellung der unter Punkt 3b) ermittelten (Abhängigkeit der Initialgeschwindigkeit vo von der Enzymkonzentration) Vervollständige folgende Tabelle: Enzymkonzentration µg/ml Testansatz 5,33 10,66 16,00 1,33 Initialgeschwindigkeit E/min Ordinate: Initialgeschwindigkeit ( E/min) Abszisse: Enzymkonzentration (µg/ml Testansatz) d) Beschreibung des gefundenen Zusammenhanges