Versuch 4. Enzymkinetik

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1 Versuch 4 Enzymkinetik Protokollant: Studiengang: Gruppen-Nr: Semester: Betreuer: Max Mustermann [email protected] X X X Dr. Postina Wird benotet?:

2 Aufgabenstellung Ermittlung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (v max ), der Michaelis-Menten- Konstante (K m ) und der Wechselzahl (k +2 ) einer enzymatischen Reaktion in Ab- und Anwesenheit eines Inhibitors. Als Versuchsobjekt diente die alkalische Phosphatase, als deren nicht physiologisches Substrat p-nitrophenylphosphat, dessen Umsetzung zum gefärbten Produkt, p-nitro-phenolat, leicht photometrisch bei 436nm bestimmt werden kann. Im Versuch sollte auch festgestellt werden ob das Enzym nur ein aktives Zentrum hat oder ob es sich um ein allosterisches Enzym handelt. Weiterhin soll untersucht werden ob die Inhibition mit Na 2 HPO 4 kompetetiv oder nicht kompetetiv ist. Versuchsdurchführung Der Versuch wurde exakt nach Versuchsanleitung (Skript) durchgeführt. Ergebnisse Tabelle 2 und 4 wurden während des Versuchs erstellt. Die Extinktionen wurden gegen Luft gemessen und haben deshalb keine Aussagekraft über die absolute Konzentration an Produkt in der Küvette. Die Extinktion zur Zeit t = 0 wurde keineswegs bei t = 0 abgelesen, sondern eher erst nach 5s oder 10s. Deshalb wurden die Extintinktionen bei t = 0 auf Null gesetzt und die nachfolgenden jeweils um den gleichen Wert erniedrigt. Zur Erstellung der Diagramme wurden andere Tabellen verwendet. Der Vollständigkeit halber sind sie am Ende des Protokolls angeheftet. Bei dem Versuch ohne Inhibitor mit einer Substratkonzentration von 31,75 * 10-5 (D) weicht die Reaktionsgeschwindigkeit sehr stark von der erwarteten ab. Die kann nur durch einen Fehler unsererseits erklärt werden. Diese Wertereihe wurde daher in der Auswertung nicht berücksichtigt.

3 Änderung von [P] mit der Zeit (min) (Ohne Inhibitor) 0,00012 [P] (mol/l) 0,0001 0, , ,000 0,00002 y = 4,12E-05x y = 2,92E-05x y = 2,83E-05x y = 2,40E-05x y = 1,44E-05x y = 6,93E-06x [S] = A [S] = B [S] = C [S] = D (Ausreisser) [S] = E [S] = F [S] = G Linear ([S] = A) Linear ([S] = B) Linear ([S] = C) Linear ([S] = E) Linear ([S] = F) Linear ([S] = G) Linear ([S] = D (Ausreisser)) y = 2,45E-06x 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Zeit (min)

4 Verwendete [S] in der 1/[S] (1/M) v (M/min) 1/v SubstratstammlösungTestküvette (min/m) A 1,05E-05 9,52E+ 2,45E-06 4,08E+05 B 3,17E-05 3,15E+ 6,93E-06 1,44E+05 C 1,05E- 9,54E+03 1,44E-05 6,94E+ D 3,18E- 3,15E+03 4,12E-05 2,43E+ E 1,05E-03 9,55E+02 2,40E-05 4,17E+ F 3,17E-03 3,15E+02 2,83E-05 3,53E+ G 6,35E-03 1,58E+02 2,92E-05 3,42E+ Michaelis-Menten-Diagramm (ohne Inhibitor) 3,50E-05 3,00E-05 2,50E-05 v in (M/min) 2,00E-05 1,50E-05 1,00E-05 5,00E-06 1,00E-03 2,00E-03 3,00E-03 4,00E-03 5,00E-03 6,00E-03 7,00E-03 [S] in (M) Lineweaver-Burk-Diagramm (ohne Inhibitor) 4,50E+05 4,00E+05 1/v in (min/m) 3,50E+05 3,00E+05 2,50E+05 2,00E+05 1,50E+05 y = 3,95x ,00E+05 5,00E+ 1,00E+ 2,00E+ 3,00E+ 4,00E+ 5,00E+ 6,00E+ 7,00E+ 8,00E+ 9,00E+ 1,00E+05 1/[S] in (1/M)

5 Änderung von [P] mit der Zeit (min) (Mit Inhibitor) 0,00007 [P] (mol/l) 0, , ,000 0, ,00002 y = 2,56E-05x y = 2,28E-05x y = 1,68E-05x y = 8,87E-06x 0,00001 y = 3,38E-06x y = 1,12E-06x 0 y = 3,98E-07x 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Zeit (min) [S] = A [S] = B [S] = C [S] = D [S] = E [S] = F [S] = G Linear ([S] = A) Linear ([S] = B) Linear ([S] = C) Linear ([S] = D) Linear ([S] = G) Linear ([S] = F) Linear ([S] = E)

6 Tabelle 5 (mit Inhibitor) Verwendete [S] in der 1/[S] (1/M) v (M/min) 1/v (min/m) Substratstammlösung Testküvette A 1,05E-05 9,52E+ 3,98E-07 2,51E+06 B 3,17E-05 3,15E+ 1,12E-06 8,93E+05 C 1,05E- 9,54E+03 3,38E-06 2,96E+05 D 3,18E- 3,15E+03 8,87E-06 1,13E+05 E 1,05E-03 9,55E+02 1,68E-05 5,95E+ F 3,17E-03 3,15E+02 2,28E-05 4,39E+ G 6,35E-03 1,58E+02 2,56E-05 3,91E+ Michaelis-Menten-Diagramm (mit Inhibitor) 3,00E-05 2,50E-05 v in (M/min) 2,00E-05 1,50E-05 1,00E-05 5,00E-06 1,00E-03 2,00E-03 3,00E-03 4,00E-03 5,00E-03 6,00E-03 7,00E-03 [S] in (M) Lineweaver-Burk-Diagramm (mit Inhibitor) 3,00E+06 2,50E+06 1/v in (min/m) 2,00E+06 1,50E+06 1,00E+06 y = 26,063x ,00E+05 1,00E+ 2,00E+ 3,00E+ 4,00E+ 5,00E+ 6,00E+ 7,00E+ 8,00E+ 9,00E+ 1,00E+05 1/[S] in (1/M)

7 Vergleich Reaktionsgeschwindigkeiten mit/ohne Inhibitor 3,50E-05 3,00E-05 2,50E-05 v in (M/min) 2,00E-05 1,50E-05 ohne Inhibitor mit Inhibitor 1,00E-05 5,00E-06 1,00E-03 2,00E-03 3,00E-03 4,00E-03 5,00E-03 6,00E-03 7,00E-03 [S] in (M) Vergleich mit/ohne Inhibitor in Lineweaver-Burk-Darstellung 3,00E+06 2,50E+06 1/v in (min/m) 2,00E+06 1,50E+06 1,00E+06 mit Inhibitor ohne Inhibitor 5,00E+05 0,00E+ 00 1,00E+ 2,00E+ 3,00E+ 4,00E+ 5,00E+ 6,00E+ 1/[S] in (1/M) 7,00E+ 8,00E+ 9,00E+ 1,00E+ 05

8 Vergrößerung des Vergleichs in Lineweaver-Burk-Darstellung 4,00E+05 3,00E+05 y = 27,342x /v in (min/m) 2,00E+05 1,00E+05 mit inhibitor ohne inhibitor Linear (ohne inhibitor) Linear (mit inhibitor) y = 3,6034x ,00E+ -1,00E+ 1,00E+ 2,00E+ -1,00E+05 1/[S] in (1/M) Auswertung

9 Kann man den Reaktionsverlauf der alkalischen Phosphatase mit der Michaelis-Menten-Kinetik beschreiben? Die Michaelis-Menten-Kinetik gilt für Enzyme mit nur einem aktiven Zentrum. Für Enzyme mit mehreren aktiven Zentren, die sich auch noch gegenseitig beeinflussen (allosterische Enzyme) gelten die Annahmen der Michaelis-Menten-Kinetik nicht. Trägt man für ein nicht allosterisches Enzym die Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration auf, so entsteht eine hyperbolische Kurve. Tut man das Gleiche für ein allosterisches Enzym, entsteht eine sigmoide Kurve. Grund dafür ist die sogenannte Kooperativität. Bei der Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit der alkalischen Phosphatase gegen die jeweilige Substratkonzentration sieht man, dass es sich um einen hyperbolischen Kurvenverlauf handelt, welcher typisch für Enzymreaktionen nach Michaelis-Menten ist. Somit handelt es sich auf den ersten Blick bei der alkalischen Phosphatase um ein nicht allosterisches Enzym. Da wir nicht viele Messungen durchgeführt haben, müssten wir um genau sagen zu können um welche Art Enzym es sich handelt, weitere Messungen im Bereich niedriger Substratkonzentrationen und verschiedener Enzymkonzentrationen durchführen, um mehr Messpunkte zu erhalten. Um welche Art der Inhibition handelt es sich im durchgeführten Experiment? Wie wirkt sich der Inhibitor auf v max, K m und die Wechselzahl aus? Bei einer kompetetiven Hemmung (Inhibitor konkurriert mit dem Substrat um das aktive Zentrum als Bindungsstelle) eines Enzyms bleibt dessen maximale Reaktionsgeschwindigkeit unverändert, da bei Erhöhung der Substratkonzentration, das Substrat ab einem bestimmten Wert von [S] den Inhibitor verdrängt. K m ist jetzt logischerweise größer. Bei nicht kompetetiver Inhibition (Inhibitor bindet an einen Bereich des Enzyms, der nicht dem aktiven Zentrum entspricht) ist es genau umgekehrt: V max wird kleiner, K m bleibt unverändert. Aus der Lineweaver-Burk-Darstellung (Auftragung von 1/[S] auf der x-achse und 1/v auf der y-achse) kann man erkennen um welche Art der Inhibition es sich handelt, kompetetiv oder nicht kompetetiv. Der Schnittpunkt der extrapolierten Geraden mit der x-achse ist gleich dem Wert 1/K m, der Schnittpunkt mit der y-achse = 1/v max für das jeweilige Enzym und die vorhandene Inhibition. Im obigen Linewaever-Burk-Diagramm sieht man auf den ersten Blick, dass die beiden Geraden sich im gleichen Punkt auf der y-achse schneiden, welcher den Wert 1/v max darstellt. V max bleibt somit gleich. Dagegen ändert sich der Schnittpunkt der Geraden mit der x-achse bei einer Inhibition mit Na 2 HPO 4 ( 1/K m wird kleiner K m wird größer). Das bedeutet, dass Na 2 HPO 4 ein kompetetiver Inhibitor für die alkalische Phosphatase ist. Für die Wechselzahl k +2 gilt: k +2 = V max / [E total ] Da [E total ] während des Versuchs konstant bleibt und v max sich aufgrund der kompetetiven Hemmung auch nicht ändert, bleibt die Wechselzahl k +2 auch unverändert (im Bereich der Messgenauigkeit).