Versuch. Übungswoche: Enzyme. Kinetik der Lactat - Dehydrogenase. Enzymkinetik der Lactat Dehydrogenase Peroxidase Nachweis

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1 Labormethoden der Biologie Vorlesung zur Übung Zellbiologie und Physiologie Übungswoche: Enzyme AG Kudla Leiter: Oliver Batistič Enzymkinetik der Lactat Dehydrogenase Peroxidase Nachweis Versuch Kinetik der Lactat - Dehydrogenase 1

2 Das Energieprofil einer chemischen Reaktion. Das thermodynamische Gleichgewicht einer chemischen Reaktion wird bestimmt durch die Differenz zwischen der freien Enthalpie der Reaktanden und der Produkte, G. G = freie Reaktionsenthalpie H = Enthalpie der an der Reaktion beteiligten Stoffe S = Änderung der Entropie Exotherme Reaktionen sollten spontan ablaufen? Das Energieprofil einer chemischen Reaktion. Übergangszustand Übergangszustand Um reaktionsfähig zu werden, müssen Reaktanden einen angeregten Übergangszustand (transition state) durchlaufen. Deshalb erfolgt meistens keine spontane Reaktion. Diese Aktivierungsenergie E A kann z.b. thermische Energie sein 2

3 Die Reaktionsgeschwindigkeit einer chemischen Reaktion steigt exponentiell mit der Temperatur t. Steigende Temperatur erhöht die thermische Aktivierung der Reaktanden. Daher steigt v exponentiell mit t. Die Exponentialfunktion v versus t steigt mit der freien Enthalpie der Aktivierung ( Aktivierungsenergie) einer Reaktion. v Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Temperatur log(v) van t Hoff sche Arrhenius-Darstellung Regel oder RGT Regel: chemische Reaktionen -E/ 2.303*R verdoppeln sich bei einem Temp.anstieg um 10K Temperatur in K 1/Temperatur in ( K) -1 Enzymatische Katalyse Durch Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms werden die Reaktanden aktiviert. Dadurch wird der Betrag für die thermische Aktivierung zum Erreichen des transition state geringer. Die Katalyse beeinflusst nur die Reaktionskinetik. Sie hat keinen Einfluss auf das thermodynamische Gleichgewicht der Reaktion. 3

4 Enzyme beschleunigen die Geschwindigkeit einer Reaktion um das Vielfache Orotidine5'-monophosphate Uridine5'-monophosphate Das aktive Zentrum eines Enzyms Das aktive Zentrum ist eine Tasche oder Spalte am Protein, in die das Substrat gebunden wird und die Reaktion erfolgt. Die Spezifität des Enzyms beruht auf der sterischen Passgenauigkeit zwischen aktivem Zentrum und Substrat. Enzym und Substrat durchlaufen bei Bindung eine strukturelle Änderung Substrat Bindetasche; aktives Zentrum Enzymprotein 4

5 Induced Fit Substratbindung an das katalytische Zentrum löst eine reversible Protein-Konformationsänderung aus, durch die das Substrat enger ins katalytische Zentrum eingeschlossen wird (induced fit). Das aktive Zentrum ist für den Überganszustand von SP optimiert, Bindungen (maximal im induced fit) stellen Aktivierungs-Energie zur Verfügung Inhibitoren ähneln v.a. dem Übergangszustand (höhere Affinität, aber ohne Umsetzung) Bestimmung der Enzymkinetik Zusammenfassung des Reaktionszyklus zu zwei Reaktionen: 1. Bildung des ES Komplexes; 2. katalytischer Zerfall des EP Komplexes. 5

6 Die Bildung des ES Komplexes ist schnell, aber reversible; Der katalytische Zerfall ist somit Geschwindigkeitsbestimmend Der katalytischer Zerfall ist langsam, aber praktisch irreversibel. Daher wird die Geschwindigkeit v der gesamte Enzymreaktion bestimmt durch: 1. die Geschwindigkeitskonstante k 2 2. die Konzentration [ES]. v 0 = k 2 [ES] Daher wird die Geschwindigkeit v der gesamte Enzymreaktion bestimmt durch: 1. die Geschwindigkeitskonstante k 2 2. die Konzentration [ES]. Zur Bestimmung der Kinetik wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei gleichbleibender Enzymkonzentration und unterschiedlicher Substratkonzentration zum Zeitpunkt 0 untersucht 6

7 Substratsättigungsfunktion einer Enzymreaktion Bei niedrigen Substratkonzentrationen wird die Reaktionsgeschwindigkeit v durch die Substratkonzentration [S] bestimmt v steigt mit [S]. Die resultierende Substratsättigungsfunktion ist hyperbolisch. V max wird erreicht, wenn alle Enzymproteine mit Substrat gesättigt sind ( Substratsättigung ). Die Reaktionsgeschwindigkeit ist dann unabhängig von [S]. Die maximale Geschwindigkeit, V max, wird durch die Menge an verfügbarem Enzym [E] begrenzt. Substratsättigungsfunktion einer Enzymreaktion Die Michaeliskonstante K M kennzeichnet die Substratkonzentration [S], bei der 50% der Enzympopulation mit Substrat gesättigt ist. Die Geschwindigkeit entspricht dann ½ V max. Die K M drückt aus, welche Affinität das Substrat zum Enzym hat: bei hoher Affinität ist der Wert für die K M relativ klein, und umgekehrt. 7

8 Lineare Umformung der Michaelis Menten Kurve Die Funktion eines Inhibitors lässt sich aus der Kinetik ablesen Nicht-Kompetitive Hemmung Kompetitive Hemmung 8

9 Substratsättigungskurve der Lactat - Dehydrogenase (LDH) Die Lactat-Dehydrogenase (LDH) katalysiert die Milchsäuregärung unter anaeroben Bedingungen. Glykolyse LDH Milchsäuregärung 9

10 Substratsättigungskurve der LDH Pyruvat + NADH Lactat + NAD + v o..... Substratsättigungskurve der LDH [S] (Lactatkonzentration) Pyruvat + NADH Lactat + NAD + Messung: Zeitlicher Verlauf der Extinktionszunahme (340 nm) nach Zugabe von Lactat + NAD. A 340 nm v 0 = Steigung (mol NADH pro min) v o Die Anfangsgeschwindigkeit (Steigung) v o,. ändert sich mit der Lactatkonzentrationen Zeit (min) Grundlagen zur Berechnung: Lambert-Beer Gesetz und Optischer Test ; s. Kurswoche Enzymatische Metabolitbestimmung! 10

11 Originalmessungen aus Übung Berechnung der Kinetik Absorptionsänderung (340 nm) / Zeit Konzentrationsänderung / Zeit (Lambert- Beersche-Gesetzt) Konzentration: mol/l; mmol/l? Zeit: Minuten; Sekunden? Ziel: v max = mol Lactat * sec -1 * mg Enzym -1 11

12 Versuch: Peroxidase Nachweis Peroxidase Reaktion Peroxidasen oxidieren phenolische Substrate mit H 2 O 2 : RH 2 + H 2 O 2 R + 2 H 2 O geringe Substratspezifität; große Enzymfamilie (Genfamilie) Isoenzyme. Was sind Isoenzyme? strukturell und funktionell ähnliche Enzyme, Expression oft unterschiedlich reguliert (durch unterschiedliche Promotorstruktur!), oft unterschiedliches Targeting (unterschiedliche Signalpeptide) 12

13 Die Wirkungsweise der Peroxidase Beispiel: Phenoloxidasen Die Oxidation eines Phenols durch die Peroxidase führt zur Bildung eines Phenolradikals. Das delokalisierte ungepaarte Elektron kann mit Resonanzstrukturen anderer Phenole reagieren. Phenolradikale polymerisieren spontan. Beispiel: Lignifizierung. Zusammenspiel von NADP-Oxidase und Zellwand-Peroxidasen bei Zellwand - Polymerisationen z.b. Abwehr, Verwundung, Xylembildung Polymerisation Peroxidase NADPH NADP NADPH Oxidase Zellwand Phenole H 2 O 2 e - O.- 2 O 2 SOD 13

14 Anwendungsbeispiel für Peroxidasen - Immunohistochemische Detektion von Proteinen Western Blot Meerrettich-Peroxidase mit Antikörpern gekoppelt oxidiert Luminol Chemilumineszenz Histochemische Aktivitätsfärbung einer Peroxidase: Oxidation des künstlichen Substrates Tetramethyl-Benzidin Die Färbung wird durch den Radikalfänger Ascorbat (Vitamin C) gehemmt! 14

15 Ascorbat fängt Superoxid / Wasserstoffperoxid ab. (Reduktive Entgiftung). reduziertes Ascorbat oxidiertes Ascorbat Elektrophoretische Trennung von (Enzym-) Proteinen im Gel 15

16 Native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Bildung eines Polymers mit definierter Ausschlussgröße Molekülsieb. Polymerisation des Gels, ausgelöst durch Radikalstarter Ammonium Persulphat. Bewegung der nativen (intakten) Proteine im elektrischen Feld, entsprechend 1. ihrer Ladung, 2. ihrer Größe Denaturierende Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese (SDS-PAGE) Detergenz Dodecylsulphat (SDS) bildet eine Micelle um Proteine, nach außen einheitliche Ladungsdichte (negativ geladen); Proteine werden denaturiert, Trennung der Proteine nur nach Größe (geeignet zur Molekulargewichtsbestimmung!) Native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese PAGE ohne SDS! Proteine (Enzyme) bleiben funktionsfähig! Trennung der Proteine nach Größe und Ladung! 16

17 Aktivitätsfärbung der Peroxidase im nativen Gel Das künstliche Substrat 4-Chlor-1- Naphtol ist reduziert farblos, oxidiert blau-schwarz. Rettich Tabak Tabak Tabak Tabak Tomate Stiel kl. Blatt gr. Blatt Wurzel Blatt Nachweis gewebsspezifischer Expression von Peroxidase - Isoenzymen Viel Spaß 17