Gesamteiweiß-Bestimmung

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1 Gesamteiweiß-Bestimmung TEAS Themen Proteine, Aminosäuren, Peptide, Photometrie, Biuret-Reaktion, Hypo- und Hyperproteinämien Prinzip Die Gesamteiweiß-Bestimmung aus Plasma, Serum, Urin oder Liquor erfolgt in diesem Versuch photometrisch mit der Biuret-Reaktion, in der sich zweiwertige Kupferionen an die Peptidbindungen der Proteine anlagern und durch diese Farbreaktion den Proteingehalt anzeigen. Material Studenten-Basis-Set 1 Mikroliterpipette µl Mikroliterpipette µl Digitale Stoppuhr Reagenzglasgestell, PP, 12 Plätze Laborschreiber, wasserfest Halbmikro-Küvetten Küvettenständer Zentrifugengläser Pipettenspitzen μl im Halter, 96 1 Stk Pipettenspitzen μl im Halter, Stk Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml Pipettierball Einweg-Rührspatel, 500 Stk Laborausstattungs-Set 1 Photometer Zentrifuge Chemikalien 1 0,9 % NaCl-Lösung Trichloressigsäure 19,4 % Wasser, destilliert, 5l Zusätzlich werden folgende Reagenzien benötigt Kontrolle negativ Kontrolle positiv Standard-Probe Eiweißreagenz Abb.1: P P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 TEAS Gesamteiweiß-Bestimmung Hinweis: Die für diesen Versuch verwendeten Reagenzien und Kontrollproben sind im Anhang aufgelistet. Die Standard-Probe kann aus Serum-Proben mit bekannter Konzentration bestehen oder ein käuflicher Protein Kalibrator (siehe anhang). Achtung! Beachten Sie stets die Vorbemerkungen, wenn Sie diesen Versuch durchführen. Aufgaben 1. Ermitteln Sie die Eiweiß-Konzentration in Serumprobe und Kontrollprobe. 2. Bestimmen Sie den Eiweiß-Gehalt einer Urin- oder Liquorprobe. 3. Berechnen Sie die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes. Durchführung Reagenzvorbereitung - Reagenz ist gebrauchsfertig - Reagenz auf Raumtemperatur bringen, Beipackzettel beachten. Untersuchungsmaterial : - Serum, Plasma, Sammelurin, Liquor Siehe Kapitel Präanalytik - Universal-Kontrollseren P oder N dienen als Kontrollprobe. Sie sind lyophylisiert, entsprechend der Vorbemerkungen in destilliertem Wasser lösen. - Standard-Probe Aufgabe 1: Ermitteln Sie die Eiweiß-Konzentration im Serum einer Patientenprobe und einer Kontrollprobe Abb. 2: Durchführung - Die einzelnen Probelösungen werden wie im Pipettierschema angegeben in Küvetten gemischt. Temperatur C Insgesamt werden 4 Proben vermessen: - Reagenzleerwert - Standard - Kontrollprobe - Patientenprobe Die Lösungen werden jeweils gemischt, dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die Extinktion innerhalb von 60 Minuten gegen Reagenzleerwert gemessen. Reagenzleerwert-Messung - Gerät einschalten: on/off - Wellenlänge einstellen: 550 nm - Leerwertküvette in die Messzelle stellen, dann Referenz-Messung starten: Taste R drücken Pipettierschema Standard/Kontrol le/ Patient 1. Küvette Küvette Reagenzleerwert Standard/Kontrolle/ (LW) Patient - 20 µl Aqua dest. 20 µl - Reagenz 1000 µl 1000 µl 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

3 Gesamteiweiß-Bestimmung TEAS Messung - Standard/Kontrolle/Patient in die Messzelle stellen, Messung starten: Taste T drücken - Extinktion ablesen - Gerät abschalten: on/off Aufgabe 2: Bestimmen Sie den Eiweiß-Gehalt einer Urin- oder Liquorprobe In Urin und Liquor ist die Proteinkonzentration in aller Regel zu niedrig, aus diesem Grund wird das Gesamteiweiß zunächst mit 19,4%iger Trichloressigsäure gefällt und abzentrifugiert. Im Anschluss wird der Niederschlag mit Biuret-Lösung gelöst. Dadurch erreicht man eine Konzentrierung des Proteins und kann die Biuret-Methode angewandt werden. Proteinfällung: In Zentrifugengläser pipettieren: Probe (Urin) Probe (Liquor) Harn oder Liquor 5,0 ml 1 ml 1,2 mol/l Trichloressigsäure 1,0 ml 0,2 ml - Mischen, 10 min bei C stehen lassen, - 10 min zentrifugieren (bei 3000U /min) - Überstand abgießen (verwerfen) - anschließend das Zentrifugenglas mit der Öffnung nach unten 5 min lang auf Filterpapier stellen - dann nachgelaufene Reste des Überstandes mit Filterpapier entfernen. Pipettierschema Zum Niederschlag pipettieren Probe (Urin) Probe (Liquor) Biuret-Reagenz 5 ml 1 ml Die Niederschläge werden im Fall einer Urinprobe mit 5 ml bzw. im Fall einer Liquorprobe mit 1 ml Biuret-Lösung versetzt und die Lösung anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird ein Teil in eine Küvette überführt und die Extinktion innerhalb von 60 Minuten gegen Reagenzleerwert gemessen. Reagenzleerwertmessung - Gerät einschalten: on/off - Wellenlänge einstellen: 550 nm - Leerwertküvette (s. Aufgabe 1) in die Messzelle stellen: Taste R drücken Messung - Probe in die Messzelle stellen, Messung starten: Taste T drücken - Extinktion ablesen - Gerät abschalten: on/off Als Standard wird der bereits in Aufgabe 1 ermittelte Wert benutzt. P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 TEAS Gesamteiweiß-Bestimmung Grundlagen Im menschlichen Blutplasma kommen mehrere hundert verschiedene Proteine vor. Es gibt Transportproteine, Immunglobuline, Enzyme, Hormone usw. Das Gesamteiweiß im Serum besteht zum größten Teil aus Albumin und Globulinen. Die natürlichen Proteine sind aus den 20 verschiedenen, natürlichen Aminosäuren aufgebaut. Das Verknüpfungs-Prinzip der Aminosäuren wird Peptidbindung genannt. Eine Peptidbindung entsteht unter Wasserabspaltung aus der Reaktion zwischen zwei funktionellen Gruppen: der Carboxyl-Gruppe (- COOH) und der Amino-Gruppe (-NH 2 ). Die Reihenfolge (Sequenz) der Aminosäuren bestimmt die Primärstruktur der Proteine. Mit Ausnahme der Immunglobuline und einiger weniger Gerinnungsfaktoren werden nahezu alle Plasmaproteine in der Leber gebildet. Proteine sind empfindliche Substanzen, sie können unter Konformationsänderung (Änderung der räumlichen Anordnung) denaturiert werden. Diese Denaturierung ist meist irreversibel und führt zum Verlust der biologischen Funktion des Eiweißmoleküls. Irreversible Denaturierung erfolgt durch Zugeben von starken Säuren, starken Basen, Schwermetallsalzen sowie durch Erhitzen. Den Veränderungen der Gesamtproteinkonzentration im Plasma liegen entweder Störungen des Wasser- und Elektrolythaushaltes zugrunde oder sie sind das Zeichen einer Dysproteinämie. - Eine Hypoproteinämie tritt bei einer Protein-Synthesestörung, Protein-Verlustsyndrom, einer Proteinbzw. Aminosäure-Absorptionsstörung oder einer Protein-Mangelernährung auf. - Eine Hyperproteinämie kann wegen eines Plasmozytoms (monoklonaler Gammopathie), chronischen Entzündungen oder einer kompensierten Leberzirrhose bestehen. - Eine Pseudohyperproteinämie liegt bei unveränderter intravasalen Proteinmengen vor, wenn eine Verminderung des Plasmavolumens (Dehydratation) zugrunde liegt. Ursachen sind z.b. Dursten, Durchfälle und Erbrechen. Bestimmungsmethode Biuret-Methode In dieser Methode lagern sich im alkalischen Milieu zweiwertige Kupferionen an Peptidbindungen der Proteine. Dabei wird ein Farbkomplex (blau-violett) gebildet. Die Intensität der Farbentwicklung ist der Zahl der Peptidbindungen und damit der Proteinkonzentration proportional. Voraussetzung für die Reaktion ist das Vorhandensein von mindestens zwei Peptidbindungen. Auswertung Aufgabe 1: Ermitteln Sie die Eiweiß-Konzentration in Serumprobe und Kontrollprobe Der Eiweißgehalt (c Eiweiß ) kann direkt aus der Extinktion der Proben E Probe im Vergleich mit der Extinktion (E Standard ) und der Konzentration der Standard (c Standard ) ermittelt. c Eiweiß [g/l] = E Probe E Standard c Standard Für unsere Beispieluntersuchung ergaben sich folgende Werte: Extinktion E Konzentration c [g/l] Reagenzleerwert (LW) 0 0 Standard (Std) Kontrolle (K) Patient (P 1 ) PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

5 Gesamteiweiß-Bestimmung TEAS Berechnungsbeispiel für Patient (P 1 ): E Probe c Eiweiß/P1 [g/l] = E Standard c Standard = = 85g/l 0.28 Referenzwerte: Erwachsene: g/l Weitere Informationen zu den Referenzwerten: siehe Kapitel Vorbemerkung. Hinweis Der Standard hat stets andere Werte. Sie sind der jeweiligen Packungsbeilage zu entnehmen. Der Einfluss der Körperlage bei der Blutabnahme ist groß. Bis zu 10% höhere Werte werden bei der Probennahme in aufrechter Körperhaltung gemessen.(siehe Kapitel Präanalytik) Aufgabe 2: Bestimmen Sie den Eiweiß-Gehalt einer Urin- oder Liquorprobe Der Eiweißgehalt der Probe kann direkt aus der Extinktion der Probe im Vergleich mit dem Standard ermittelt werden. Eiweiß[g/l] = E Probe [Standard] E Standard Aufgabe 3: Berechnen Sie die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes Mit der Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes überprüft man, ob das Experiment mit Fehler behaftet ist. Siehe Kapitel Vorbemerkung. Der im Experiment ermittelte Wert der Kontrollprobe ist der sogenannte Ist-Wert. Von der Kontrolle kennen wir aber auch den eigentlichen Wert, den Soll-Wert. Er ist auf der Packungsbeilage des Kontrollserums (Trulab P oder N) angegeben. Aus dem ermittelten Ist-Wert und dem bekannten Soll-Wert ergibt sich die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes nach folgender Formel: KoPEM[%] = Soll Ist Soll 100 Beispielrechnung: Ist Wert der Kontrolle: 67.7 g/l Soll Wert der Kontrolle: 65.9 g/l KoPEM[%] = Soll Ist Soll 100 = = 2.7% 65.9 Im Anschluss wird die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes vom Sollwert mit den landesüblich erlaubten Grenzen verglichen. In der Bundesrepublik Deutschland wird diese Grenze für Eiweiß in der Tabelle B 1a RiliBÄK auf +/-6 % angegeben. In unserem Beispiel erfüllt der Kontrollprobeneinzelmesswert diese Vorgabe. Folglich kann der Patient beurteilt werden. P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

6 TEAS Gesamteiweiß-Bestimmung Achtung: Bitte die gesetzlichen Vorgaben des jeweiligen Landes beachten! Siehe Kapitel Vorbemerkung. Fragen - Warum wird ein Standard mitgeführt? Um die unbekannte Konzentration einer Probe berechnen zu können, muss man zunächst den Standard mit bekannter Konzentration messen. C Standard (bekannt ) E Standard (wird gemessen) C Probe (unbekannt) E Probe (wird gemessen) Probe[g/l] = E Probe E Standard [Standard] - Welchen Einfluss hat die Körperlage bei der Blutabnahme auf die Laborergebnisse? Bis zu 10 % Unterschied in den Messwerten beim Wechsel vom Liegen auf Stehen. - Was sind die Grundbausteine des Eiweißmoleküls? Aminosäuren - Wie werden die Aminosäuren miteinander verknüpft? durch Peptidbindungen - Wo werden die meisten Proteine gebildet? In der Leber 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

7 Gesamteiweiß-Bestimmung TEAS Protokoll Aufgabe 1 Bitte tragen Sie Ihre Messwerte in die folgende Tabelle ein Extinktion Konzentration [g/l] Reagenzleerwert (LW) Standard (Std) Kontrolle (K) Patient (P 1 ) Aufgabe 2 Bitte tragen Sie Ihre Messwerte in die folgende Tabelle ein Extinktion Konzentration [g/l] Reagenzleerwert (LW) Patient (P 1 ) Aufgabe 3 Notieren Sie die Abweichung des KoPEM und diskutieren Sie das Ergebnis. Fragen - Warum wird ein Standard mitgeführt? P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 7

8 TEAS Gesamteiweiß-Bestimmung - Welchen Einfluss hat die Körperlage bei der Blutabnahme auf die Laborergebnisse? - Was sind die Grundbausteine des Eiweißmoleküls? - Wie werden die Aminosäuren miteinander verknüpft? - Wo werden die meisten Proteine gebildet? 8 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P