Plasmaproteine und immunologische Messmethoden. 2013/2014 Dr. Brodner, Dr. Hermsen

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1 Plasmaproteine und immunologische Messmethoden 2013/2014 Dr. Brodner, Dr. Hermsen

2 Plasmaproteine: Definition Primäre Funktion im Plasma Synthese in der Leber oder im Immunsystem Abgabe in das Interstitium und Blut Höchste Konzentration im Blutplasma Definierte Halbwertszeit Funktionen: Transportproteine Immunglobuline Enzyme und Enzyminhibitoren Proteohormone Proteine mit noch unbekannten Funktionen

3 Plasmaproteine, Funktionen Enzyme, Gerinnnung Onkotischer Druck Hormone, Puffer Transport Immunabwehr

4 Plasmaproteine, Funktionen Transportproteine Albumin Coeruloplasmin Transferrin Lipoproteine Haptoglobin Präalbumin Immunabwehr Immunglobuline Komplementfaktoren Akute Phase Proteine CRP u.a. Proteinaseinhibitoren a1-antitrypsin a2-makroglobulin

5 Plasmaproteine: Diagnostik 1. Stufe: Bestimmung des Gesamteiweiß Methode: z.b. Biuret Methode Protein + Cu 2+ alkalische Lösung Cu Protein Komplex (Biuretkomplex) Absorption bei 546 nm

6 Gesamtprotein Bewertung Normbereich: 6,6 8,7 g/dl Ursachen Hypoproteinämie: nephrotisches Syndrom starker Blutverlust toxische Leberschädigung Mangelernährung (Kwashiorkor, Kachexie) Malabsorptionssyndrome (chron. Durchfälle, z.b. bei Sprue) Exsudative Dermatosen (Verbrennungen, bullöse Dermatosen) Analbuminämie Aszites hypervolämische Zustände

7 Gesamtprotein Bewertung Ursachen Hyperproteinämie: multiples Myelom Chronisch entzündliche Erkrankungen (meist nur geringe Hyperproteinämie) kompensierte Leberzirrhose (IgG, aber Albumin noch nicht stark vermindert) Dehydratationszustände

8 Plasmaproteine: Diagnostik 2. Stufe der Diagnostik Screening: Dysproteinämie Serumeiweißelektrophorese: geringe diagnostische Spezifität geringer methodischer Aufwand Spezielle Fragestellung: Defektproteinämie Einzelproteinbestimmung: hohe diagnostische Spezifität hoher methodischer und finanzieller Aufwand

9 Dysproteinämie, Defektproteinämie Dysproteinämie Defektproteinämie relative Verschiebungen des Plasmaproteinprofils die nicht notwendigerweise mit Hyper oder Hypoproteinämie einhergeht hereditäre Mangelzustände: fehlenden Synthese Synthese strukturanomaler Proteine, die zu einer defekten Ausschleusung des Proteins führt Synthese und Sekretion strukturvarianter Proteine mit mehr oder weniger vollständigem Verlust der normalen Funktion

10 Plasmaproteine: Diagnostik 2. Stufe: Screening auf Dysproteinämie Methode: Serumeiweißelektrophorese + Auftragsstelle Wanderungsrichtung Pufferlösung ph 8,2 8,6 Auftrennung nach Nettoladung, und Molekulargewicht

11 Serumeiweißelektrophorese Einteilung in Fraktionen: α1 Lipoprotein (HDL) α1 Glykoprotein α1 Antitrypsin α2 Makroglobulin Haptoglobin prä β Lipoprotein (VLDL) Transferrin β Lipoprotein (LDL) Komplementfaktore n Albumin α 1 α 2 β γ

12 Serumeiweißelektrophorese γ Fraktion: IgA IgG IgM

13 Normalbefund im Original

14 Serumeiweißelektrophorese Akute Entzündung: CRP: 22,1 mg/dl

15 Serumeiweißelektrophorese Chronische Entzündung:

16 Serumeiweißelektrophorese Leberinsuffizienz:

17 Serumeiweißelektrophorese Nephrotisches Syndrom:

18 Serumeiweißelektrophorese monoklonale Gammopathie: M Gradient M Gradient M Gradient

19 Monoklonale Gammopathie

20 Serumeiweißelektrophorese Antikörpermangel:

21 Plasmaproteine: Diagnostik Bedeutung Serumeiweißelektrophorese: 1. vorwiegend als Suchreaktion für monoklonale Gammopathien 2. keine direkte Diagnosestellung, jedoch Zuordnung von Plasmaprotein Konstellation zu charakteristischen Krankheitsgruppen

22 Plasmaproteine: Diagnostik 2. Stufe: Bestimmung einzelner Plasmaproteine Protein mögl. Ursachen Symptomatik Albumin α1 Antitrypsin Transferrin, CDT Coeruloplasmin Haptoglobin Immunglobuline : nephrotisches Syndrom, Leberzirrhose, Mangelernährung : hereditärer α1 AT Mangel CDT : Alkoholmissbrauch : M. Wilson, Nutritiver Kupfermangel : Hämolyse : Akute Phase Reaktion : verschiedene hereditäre AK Mangel Syndrome, Verlust (Niere), Leichtkettenerkrankung : Poly/monoklonale Gammopathien Ödeme Lungen und Lebererkrankungen (Emphysem, Hepatitis, Zirrohse) Leberzirrhose, Fettleber, neurolog. Schäden, Entzugssymptome akute/chronische Hepatitis, Hämolyse, Kayser Fleischer Cornealringe Vielfältig, so wie die Ursachen (immunhämolytisch, mikroangiopathisch, Malaria, mechanisch) Vielfältig, so wie die Ursachen

23 Immunologische Messmethoden Prinzip: Ag + Ak Ag Ak Komplex Antikörper (Ak) ist spezifisch gegen das Protein (Ag) gerichtet! Die Immunkomplexbildung nimmt ab: mit fallendem ph (ph < 7) durch Anstieg der Ionenstärke mit steigender Temperatur

24 Immunkomplexe Prinzip: durch zugegeben Antikörper bilden sich Immunkomlexe, deren Größe und Löslichkeit vom Antigen Antikörper Mengenverhältnis abhängt. Präzipitatmenge Äquivalenzbereich Ak Überschuss => löslicher Immunkomplex Äquivalenzbereich => unlöslicher Immunkomplex Antikörperüberschuss Antigenüberschuss Ag Überschuss => löslicher Immunkomplex Antigenkonzentration Kurve nach Heidelberger und Kendall

25 Nachweis der Immunkomplexe Direkte Nachweisverfahren: Präzipitationstechniken radiale Immundiffusion Immunelektrophorese Immunnephelometrie und Immunturbidimetrie Radiale Immundiffusion: Prinzip Präzipitatmenge Probenauftragsstelle Äquivalenzbereich Ak Überschuss Ag Überschuss Antigenkonzentration Antigenkonzentration Gel, welches den spezifischen ist proportional Antikörper dem Quadrat des Durchmessers des Präzipitatrings gegen das zu bestimmende Antigen enthält

26 Nachweis der Immunkomplexe Immunfixations Elektrophorese: Prinzip typischerweise verwendete Lösungen: Anti Ig/γ Kette Anti Ig/α Kette Anti Ig/μ Kette Anti Ig/L Kappa Anti Ig/L Lambda G A M Proteinfärbung macht die Präzipitate sichtbar

27 Immunfixations Elektrophorese

28 Immunfixations Elektrophorese

29 Immunfixationselektrophorese Indikation Nachweis und Identifikation von monoklonalen Gammopathien Identifikation Klassifikation Typisierung Schwere Kette (H Kette) Leichte Kette (L Kette) Immunglobulinaufbau variabler Teil konstanter Teil L Kette H Kette 2 Typen: κ, λ bestimmt die Ig Klasse IgG IgA IgM IgE IgD

30 Nachweis löslicher Immunkomplexe Zum Nachweis löslicher Immunkomplexe in wässrigen Lösungen: Nephelometrie Turbidimetrie Prinzip: Lichtquelle Homogene Immunoassays Monochromator Ausgangsblende Photorezeptor Nephelometrie Eingangsblende Ausgangsblende Photorezeptor Signalverstärkung möglich, z.b. mit Latexpartikeln Turbidimetrie

31 Nachweis löslicher Immunkomplexe Nephelometrische und turbidimetrische Verfahren werden meist im Bereich des Antikörperüberschusses gemessen. Präzipitatmenge Optimaler Messbereich Äquivalenzbereich Antikörperüberschuss Antigenüberschuss Antigenkonzentratio n Postzonen Effekt (=Signal nimmt trotz steigender Ag Konzentration ab)

32 Heterogene Immunoassays Prinzip: Der zu untersuchende Analyt wird gebunden und markiert. Danach wird die Singalmenge der Markierung ausgewertet. Einteilung: Nach Art der Markierung: Radio, Enzym, Fluoreszenz und Lumineszenz Immunoassays Kompetitive und nicht kompetetive Assays

33 Immunreaktionen mit markierten Reaktionspartnern Markierte Reaktionspartner werden als Tracer bezeichnet Zur Markierung stehen verschiedene Substanzen zur Verfügung Radioimmunoassay (RIA) Radionuklide, z.b. 125 Jod Enzymimmunoassay (EIA) Enzyme, z.b. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase Fluoreszenzimmunoassay (FIA) Fluorogene Substanzen, z.b. Fluorescin- und Tetramethylrhodamin-isothiocyanat Lumineszenzimmunoassay Luminogene Substanzen, z.b. Acridiniumester

34 Immunfluoreszenztest Assays mit Markierung eines Reaktionspartners: Immunfluoreszenztests (IFT) Immunfluoreszenztests: Prinzip Direkter IFT: Zu untersuchendes Direkter IFT: Inkubation Gewebe mit auf spezifischen, Objektträger fluorochrommarkierten Abwaschen Antikörpern des Patientenserums, danach Inkubation mit fluorochrommarkiertem Indirekter IFT: Zellen oder Gewebe, Antihuman Ak welche das definierte Indirekter IFT: Inkubation mit Patientenserum Antigen besitzen, sind auf dem Objektträger fixiert

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36 Kompetitiver Immunoassay Y Y Y + Y Y Y + Messignal Antigenkonzentration Kompetitiver Immunoassay: Analyt und Tracer konkurrieren um limitierte Antikörperbindungsstellen. Das Messignal ist umgekehrt proportional zur Analytkonzentration.

37 Kompetitiver Immunoassay

38 Nicht-Kompetitiver Immunoassay Y Y Y Y + Y Y Y Y + Y Y Y Y Y Messignal Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Antigenkonzentration Sandwich Immunoassay: Analyt reagiert mit einem im Überschuss vorliegenden (Catcher) Antikörper. Der zweite Antikörper (Detektor) bindet zum Sandwich Komplex. Das Messignal ist proportional zur Analytkonzentration.

39 Nicht-Kompetitiver Immunoassay

40 Ergebnisinterpretation von Immunoassays Konzentrationsbestimmung und kein funktioneller Test Messweert ist abhängig von der Spezifität des Antikörpers. Cave Kreuzreaktionen Messbereich entspricht der Konzentration der eingesetzten Kalibratoren Verwendung unterschiedlicher Referenzmaterialien führt zu unterschiedlichen Ergebnissen.