Plasmaproteine und immunologische Messmethoden

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1 Plasmaproteine und immunologische Messmethoden SS 2013 Alexander Brodner

2 Plasmaproteine: Definition Primäre Funktion im Plasma Synthese in der Leber oder im Immunsystem Abgabe in das Interstitium und Blut Höchste Konzentration im Blutplasma Definierte Halbwertszeit Funktionen: Transportproteine Immunglobuline Enzyme und Enzyminhibitoren Proteohormone Proteine mit noch unbekannten Funktionen

3 Plasmaproteine: Diagnostik 1. Stufe: Bestimmung des Gesamteiweiß Methode: z.b. Biuret Methode Protein + Cu 2+ alkalische Lösung Cu Protein Komplex (Biuretkomplex) Absorption bei 546 nm

4 Gesamtprotein Bewertung Normbereich: g/l Ursachen Hypoproteinämie: nephrotisches Syndrom starker Blutverlust toxische Leberschädigung Mangelernährung (Kwashiorkor, Kachexie) Malabsorptionssyndrome (chron. Durchfälle, z.b. bei Sprue) Exsudative Dermatosen (Verbrennungen, bullöse Dermatosen) Analbuminämie Aszites hypervolämische Zustände

5 Gesamtprotein Bewertung Ursachen Hyperproteinämie: multiples Myelom chronisch entzündliche Erkrankungen (meist nur geringe Hyperproteinämie) kompensierte Leberzirrhose (IgG, aber Albumin noch nicht stark vermindert) Dehydratationszustände

6 Plasmaproteine: Diagnostik 2. Stufe der Diagnostik Screening: Dysproteinämie Serumeiweißelektrophorese: geringe diagnostische Spezifität geringer methodischer Aufwand Spezielle Fragestellung: Defektproteinämie Einzelproteinbestimmung: hohe diagnostische Spezifität hoher methodischer und finanzieller Aufwand

7 Dysproteinämie, Defektproteinämie Dysproteinämie Defektproteinämie relative Verschiebungen des Plasmaproteinprofils die nicht notwendigerweise mit Hyper oder Hypoproteinämie hereditäre Mangelzustände: fehlenden Synthese Synthese strukturanomaler Proteine, die zu einer defekten Ausschleusung des Proteins führt Synthese und Sekretion strukturvarianter Proteine mit mehr oder weniger vollständigem Verlust der normalen Funktion

8 Plasmaproteine: Diagnostik 2. Stufe: Screening auf Dysproteinämie Methode: Serumeiweißelektrophorese Auftragsstelle Wanderungsrichtung Pufferlösung ph 8,2 8,6 Auftrennung nach Nettoladung, isoelektrische Punkt und Molekulargewicht

9 Serumeiweißelektrophorese Einteilung in Fraktionen: α1 Lipoprotein (HDL) α1 Glykoprotein α1 Antitrypsin α2 Makroglobulin Haptoglobin prä β Lipoprotein (VLDL) Transferrin β Lipoprotein (LDL) Komplementfaktore n Albumin α 1 α 2 β γ

10 Serumeiweißelektrophorese γ Fraktion: IgA IgG IgM

11 Serumeiweißelektrophorese Nephrotisches Syndrom:

12 Serumeiweißelektrophorese Leberinsuffizienz:

13 Serumeiweißelektrophorese Akute Entzündung: CRP: 22,1 0,4 mg/dl

14 Serumeiweißelektrophorese Chronische Entzündung:

15 Serumeiweißelektrophorese monoklonale Gammopathie: M Gradient M Gradient M Gradient

16 Serumeiweißelektrophorese Antikörpermangel:

17 Plasmaproteine: Diagnostik Bedeutung Serumeiweißelektrophorese: vorwiegend als Suchreaktion für monoklonale Gammopathien verwendet keine direkte Diagnosestellung, jedoch Zuordnung von Krankheitsgruppen zu charakteristischen Konstellationstypen

18 Plasmaproteine: Diagnostik 2. Stufe: Bestimmung einzelner Plasmaproteine Protein mögl. Ursachen Symptomatik Albumin α1 Antitrypsin Transferrin, CDT Coeruloplasmin Haptoglobin Immunglobuline : nephrotisches Syndrom, Leberzirrhose, Mangelernährung : hereditärer α1 AT Mangel ( : akute Phase) CDT : Alkoholmissbrauch : M. Wilson, Nutritiver Kupfermangel : Hämolyse : Akute Phase Reaktion : verschiedene hereditäre AK Mangel Syndrome, Verlust (Niere), Leichtkettenerkrankung : Poly/monoklonale Gammopathien Ödeme Lungen und Lebererkrankungen (Emphysem, Hepatitis, Zirrohse) Leberzirrhose, Fettleber, neurolog. Schäden, Entzugssymptome akute/chronische Hepatitis, Hämolyse, Kayser Fleischer Cornealringe Vielfältig, so wie die Ursachen (immunhämolytisch, mikroangiopathisch, Malaria, mechanisch) Vielfältig, so wie die Ursachen

19 Immunologische Messmethoden Prinzip: Ag + Ak Ag Ak Komplex Antikörper (Ak) ist spezifisch gegen das Protein (Ag) gerichtet! Die Immunkomplexbildung nimmt ab: mit fallendem ph (ph < 7) durch Anstieg der Ionenstärke mit steigender Temperatur

20 Immunkomplexe Prinzip: durch zugegeben Antikörper bilden sich Immunkomlexe, deren Größe und Löslichkeit vom Antigen Antikörper Mengenverhältnis abhängt. Präzipitatmenge Äquivalenzbereich Ak Überschuss => löslicher Immunkomplex Äquivalenzbereich => unlöslicher Immunkomplex Antikörperüberschuss Antigenüberschuss Ag Überschuss => löslicher Immunkomplex Antigenkonzentratio n Kurve nach Heidelberger und Kendall

21 Nachweis der Immunkomplexe Direkte Nachweisverfahren: Präzipitationstechniken radiale Immundiffusion Immunelektrophorese Immunnephelometrie und Immunturbidmetrie Radiale Immundiffusion: Prinzip Präzipitatmenge Probenauftragsstelle Äquivalenzbereich Ak Überschuss Ag Überschuss Antigenkonzentration Antigenkonzentration Gel, welches den spezifischen ist proportional Antikörper dem Quadrat des Durchmessers des Präzipitatrings gegen das zu bestimmende Antigen enthält

22 Nachweis der Immunkomplexe Immunfixations Elektrophorese: Prinzip typischerweise verwendete Lösungen: Anti Ig/γ Kette Anti Ig/α Kette Anti Ig/μ Kette Anti Ig/L Kappa Anti Ig/L Lambda G A M Proteinfärbung macht die Präzipitate sichtbar

23 Immunfixations Elektrophorese

24 Immunfixations Elektrophorese

25 Nachweis löslicher Immunkomplexe Zum Nachweis löslicher Immunkomplexe in wässrigen Lösungen: Nephelometrie Turbidimetrie Prinzip: Lichtquelle Monochromator Ausgangsblende Photorezeptor Nephelometrie Eingangsblende Ausgangsblende Photorezeptor Signalverstärkung möglich, z.b. mit Latexpartikeln Turbidimetrie

26 Nachweis löslicher Immunkomplexe Nephelometrische und turbidimetrische Verfahren werden meist im Bereich des Antikörperüberschusses gemessen. Präzipitatmenge Optimaler Messbereich Äquivalenzbereich Antikörperüberschuss Antigenüberschuss Antigenkonzentratio n Postzonen Effekt (=Signal nimmt trotz steigender Ag Konzentration ab)

27 Immunologische Messmethoden Indirekte Nachweisverfahren: Latexagglutination, indirekte Hämagglutination Agglutinations Hemmtests Assays mit Markierung eines Reaktionspartners: Immunfluoreszenztests (IFT), Immunoassays Immunfluoreszenztests: Prinzip Direkter IFT: Zu untersuchendes Direkter IFT: Inkubation Gewebe mit auf spezifischen, Objektträger fluorochrommarkierten Abwaschen Antikörpern des Patientenserums, danach Inkubation mit fluorochrommarkiertem Indirekter IFT: Zellen oder Gewebe, Antihuman Ak welche das definierte Indirekter IFT: Inkubation mit Patientenserum Antigen besitzen, sind auf dem Objektträger fixiert

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29 Immunoassays Prinzip: Der zu untersuchende Analyt wird gebunden und markiert. Danach wird die Singalmenge der Markierung ausgewertet. Einteilung: Nach Art der Markierung: Radio, Enzym, Fluoreszenz und Lumineszenz Immunoassays Kompetitive und nicht kompetetive Assays Homogene und heterogene Assays ( homogen= keine Trennung des Akgebundenen Ag vom freien Ag) Beispiel: EMIT (Enzyme multiplied immunoassay): Kompetetiver, homogener Enzym Assay. Im Ansatz sind Enzym markierte Antigene, welche mit dem nachzuweisenden Antigen in der Probe um die begrenzten Antikörper konkurrieren. Das gebundene Enzym ist nur in freier Form katalytisch wirksam