Quantitative Proteinbestimmung

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1 Stand HL Seite 1 von 6 Quantitative Proteinbestimmung Ziele: Prinzip einer fotometrischen Konzentrationsbestimmung am Bsp. Proteinbestimmung Biuret: Stammlösung, Eichlösungen, Verdünnungsreihe, denaturierende Proteinfällung, Messbereich, Kalibriergerade, Proteinbestimmung einer unbekannten Probe Sicherer Umgang mit einem Spektralfotometer Vorbemerkungen: Die quantitative Bestimmung von Proteinen ist eine der wichtigsten und am häufigsten durchgeführten Arbeitsoperationen in einem biochemischen Labor: Die Wirksamkeit eines Zellaufschlusses ist nach Abtrennung der Zelltrümmer ausschließlich auf der Basis des Proteingehaltes im zellfreien Extrakt zu bewerten. Die Beurteilung der Anreicherung von einzelnen Proteinen aus solchen Rohextrakten durch Fällung, Dialyse und Chromatographie ist ohne eine quantitative Proteinbestimmung nach jeder Operation nicht vorstellbar. Die Proteinkonzentration ist die wichtigste Bezugsgröße für die enzymatische Aktivität. Bei Bezug der Reaktionsgeschwindigkeit (Enzymaktivität) auf den Proteingehalt in mg erhält man die spezifische Aktivität, bei Bezug auf die molare Protein(Enzym)Konzentration, was saubere Präparate und die Kenntnis der Molmasse voraussetzt, die Wechselzahl des Enzyms. Quantitative Proteinbestimmungen werden seit mehr als 70 Jahren durchgeführt. Die hierfür entwickelten Methoden sind zahlreich. Sie wurden, dem biochemischen Erkenntnisstand und der aktuellen Gerätetechnik angepasst, im Laufe der Zeit empfindlicher und spezifischer. Die Methoden sind heute fast so vielgestaltig wie die Proteine selbst. Trotzdem ist keine Technik in der Lage, alle Aufgabenstellungen zu lösen. Welche Methode genutzt werden kann, hängt von der Spezifik des Einsatzgebietes, von der verfügbaren Proteinmenge und von der vorhandenen Gerätetechnik ab. Alle bisher bekannten Bestimmungsmethoden können auf die Nutzung von vier grundsätzlich verschiedenen Proteineigenschaften zurückgeführt werden: Vorhandensein von Peptidbindungen Reaktivität von Gruppen in Aminosäureseitenketten Kolloidcharakter Ligandbindungsvermögen. Viele Verfahren eignen sich gleichzeitig zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Aminosäuren und Peptiden. Grundsätzlich lassen sich alle Methoden, die zur Bestimmung von Aminosäuren entwickelt wurden, auch zu Proteinbestimmungen einsetzen. In der Praxis am häufigsten für die quantitative Proteinbestimmung genutzt wurden bisher die Biuret und die Lowry Methode sowie die direkte spektrale Erfassung im Wellenlängenbereich um 280 nm. In den letzten Jahren werden die Bradford und die BCAMethode zunehmend häufiger angewandt. Quantitative Proteinbestimmungen ergeben, auch wenn sie ohne jeglichen subjektiven Fehler durchgeführt werden könnten, Resultate, die nie ganz exakt die wahre Proteinmenge repräsentieren. Dies liegt am Erfassungsprinzip selbst und wird besonders deutlich, wenn man Proteinlösungen gleicher Konzentration durch Einwaage verschiedener sauberer Proteine herstellt und dann den Proteingehalt mit verschiedenen Methoden ermittelt. Es ist daher gute Sitte, zum ermittelten Konzentrationswert auch den verwendeten Test und das Vergleichsprotein anzugeben. Vergleich verschiedener quantitativer Proteinbestimmungsmethoden bei Einsatz gleicher Mengen verschiedener Proteine (Stammlösungen jeweils 10 mg/m1). Bei den Bestimmungen nach der Biuret(weiß) und Lowry(gestrichelt) Methode diente Rinderserumalbumin, bei der Messung bei 280 nm(schwarz) HefeADH als Standard.

2 Stand HL Seite 2 von 6 Da in dieser Lehrerfortbildung nur die BiuretMethode durchgeführt werden soll, hier zu den anderen o.g. Methoden noch einige Anmerkungen: LowryTest Cu + Ionen aus der BiuretReaktion (siehe dort) bilden mit dem FolinCiocalteau Reagenz einen instabilen blauen Komplex, der als Maß der Proteinkonzentration dient. Vorteile: ein altehrwürdiges Verfahren. Nachteile: Der «Lowry» macht viel Pipettierarbeit und wird durch viele Pufferbestandteile gestört, so durch Mercaptoethanol, Hepes, TritonX100 und andere Seifen (fallen aus). Es empfiehlt sich daher, das Protein der Proben auszufällen und den Lowry mit dem Proteinpellet durchzuführen. Die Reagenzien müssen, außer dem FolinCiocalteau Reagenz (Merck), selbst hergestellt werden. Die Vergleichbarkeit zwischen den LowryProteinwerten verschiedener Labors ist schlecht, denn jedes Labor führt den Test mit kleinen Änderungen durch. BradfordTest Bei der Bindung des Farbstoffs Coomassie brilliant blue G250 an Proteine verschiebt sich das Absorptionsmaximum von 465nm ohne Protein auf 595nm bis 620nm mit Protein in Abhängigkeit vom Farbstoffanteil der stabilen blauen ProteinFarbstoffkomplexe. I.d.R. wird bei 595nm gemessen, die Zunahme der Absorption ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Probe. Vorteile: geringe Pipettierarbeit, rasch (die Farbentwicklung ist nach 2 min beendet.) und sensitiv (Empfindlichkeit ähnlich der LowryMethode, linearer Bereich 5 bis 50 µg Protein). Viele Substanzen, welche die FolinReaktion stören (vor allem Reduktionsmittel), zeigen keinerlei Einfluss. Nachteile: Die Reaktion läuft in saurem Milieu ab, in dem viele Proteine ausfallen. Spätestens nach 20min sollten alle Proben gemessen sein. Es stören Detergenzien, z. B. SDS oder Triton, aber auch Neutralsalze wie (NH 4 ) 2 S0 4. Der größte Nachteil ist in den beträchtlichen Extinktionsdifferenzen zu sehen, die man erhält, wenn gleiche Mengen verschiedener Proteine eingesetzt werden. BCATest Protein bildet mit Cu 2+ Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (BiuretReaktion). Die Cu 2+ Ionen des Komplexes werden vermutlich zu Cu + Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bilden. Vorteile: Der Test ist schnell (dauert 10 min bei 65 C), empfindlich (Nachweisgrenze 0,5 g Protein) und resistent gegen Seifen wie TritonX100. Die Reaktion läuft im alkalischen Milieu ab, bei dem fast alle Proteine in Lösung bleiben. Die Reagenzien sind im Handel erhältlich und geben wunderschöne Farben. Nachteile: Es stören hohe Konzentrationen von komplexbildenden Reagenzien (z.b. EDTA); des weiteren Ammoniumsulfat, NAcetylglucosamin, Glycin, reduzierende Stoffe wie Glucose, DTT oder Sorbitol und eine Reihe von Pharmaka wie Chlorpromazin, Penicillin und Vitamin C. Extinktionsmessungen bei 280nm Verbindungen, die aromatische Ringsysteme enthalten, absorbieren auf Grund der leichten Anregbarkeit von Elektronensystemen Licht im Wellenlängenbereich zwischen 260 und 280nm Dies gilt somit auch für Proteine, bei denen die Absorption vornehmlich durch den Gehalt an Tyrosin und Tryptophan bestimmt wird. Vorteile: Schnell, ohne nennenswerten Arbeitsaufwand. Protein verbleibt nativ. Weit verbreitet sind Messungen bei 280nm zur kontinuierlichen Registrierung des Proteingehaltes (Durchflussfotometer) in den Eluaten nach säulenchromatographischen Trennungen. Nachteile: Da verschiedene Proteine sehr unterschiedlichen Gehalt an aromatischen Aminosäuren haben können, ist die Methode nur zur groben Abschätzung des Proteingehaltes geeignet. Alle niedermolekularen aromatischen Verbindungen verursachen Störungen. Bei Nutzung der

3 Stand HL Seite 3 von 6 Methode zur Proteinbestimmung in Rohextrakten muss berücksichtigt werden, dass diese in der Regel beträchtliche Mengen an Nucleinsäuren enthalten, die ebenfalls in diesem Spektralbereich absorbieren. (ODMessung bei 260nm zur Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäuren). Annähernd gilt: Protein (mg/ml) =1,55 x E 280 0,76 x E 260. Hinweis: Für fotometrische Messungen im UVBereich sind Quarzküvetten bzw. spezielle UV Kunststoffküvetten zu verwenden!

4 Stand HL Seite 4 von 6 BiuretReaktion (Nachweis der Peptidbindung) Prinzip: Die BiuretReaktion ist spezifisch für alle Substanzen mit zwei oder mehr Peptidbindungen. Die Reaktion ist nach der Verbindung Biuret (H 2 NCONHCONH 2 ) benannt, die sich leicht beim trockenen Erhitzen von Harnstoff bildet. In Proteinen wird mit dieser Reaktion somit die Konzentration an Peptidbindungen (geknüpft zwischen der Carboxylgruppe und der Aminogruppe zweier Aminosäuren) gemessen. Biuretpositive Substanzen ergeben mit Cu 2+ Salzen (in alkalischer Lösung unter Zusatz von Tartrat und Jodidionen zur Stabilisierung) einen rot bis blauvioletten Farbkomplex, dessen Farbintensität bei 540 nm fotometrisch bestimmt werden kann. Aus der Struktur des Komplexes ergibt sich, dass bei Einsatz verschiedener Proteine gleicher Konzentration nur eine sehr geringe Variation in der Farbintensität auftreten kann. Allerdings ist die Empfindlichkeit der Reaktion gering. Für eine Bestimmung werden ca mg Protein benötigt. Günstig dagegen ist die hohe Spezifität der Reaktion. Neben Proteinen werden lediglich Peptide erfasst. Die BiuretMethode ist in Anwesenheit von AmmoniumIonen, die tiefblau gefärbte CuTetraminKomplexe bilden, nicht einsetzbar. Proteinbestimmungen in ammoniumsulfathaltigen Proteinfraktionen, die im Rahmen von Anreicherungsexperimenten anfallen, dürfen somit nicht direkt mit dieser Methode durchgeführt werden. Tris und Good s Puffersubstanzen stören den Test ebenfalls. In solchen Fällen ist zunächst eine Proteinfällung (s.u.) vorzunehmen. Im alkalischen Milieu des BiuretTests lösen sich Proteinniederschläge rasch auf, so dass nach einer Fällung und anschließendem Waschen des Präzipitats der Test direkt mit dem Pellet durchgeführt werden kann. Die Reproduzierbarkeit der Methode ist bei Einhaltung der Rahmenbedingungen sehr gut. BiuretReagenz: Das BiuretReagenz ist eine Mischung von Kaliumnatriumtartrat, Kupfersulfat und Kaliumjodid, die in der angegebene Reihenfolge in Natronlauge gelöst werden. Die molaren Konzentrationen der fertigen Lösung sind: 32mM KNaTartrat, 12mM CuSO 4, 30mM KJ, 200mM NaOH. 100ml herstellen und dunkel aufbewahren. TestDurchführung: (i.d.r. in 2ml Reaktionsgefäßen) Zu 0,4ml einer Probe (0,5 5mg Protein enthaltend) 1,5ml BiuretReagens geben. Mischen. Proben und ein Leerwert/Blindprobe (statt Proteinlösung, 0,4ml Lösungsmittel einsetzen) in Halbmikroküvetten(d = 1cm) umfüllen und 30min bei Raumtemperatur stehen lassen. Extinktion (Absorption) gegen den Leerwert bei 540nm messen. Proteinfällung vor dem BiuretTest: (i.d.r. in 2ml Reaktionsgefäßen) Benötigt wird 3M TCALösung (24,5g Trichloressigsäure auf 50ml mit A.dest.). 0,4ml Proteinlösung (0,5 5mg enthaltend) mit 0,1ml 3M TCALösung versetzen, gut mischen, 10min auf Eis stehen lassen, kurz vortexen, 5 min bei max. speed abzentrifugieren, den Zentrifugationsüberstand mit einer ausgezogenen Pasteurpipette möglichst vollständig abnehmen und verwerfen. Das Präzipitat in 0,4ml A.dest. resuspendieren und das Farbreagenz zugeben. Nach der vollständigen Auflösung des Präzipitats noch einmal gut mischen! Die Kalibrierkurve ist entsprechend zu erstellen!

5 Stand HL Seite 5 von 6 Durchführung: Es soll die Konzentration einer Rinderserumalbumin (BSA, AlbuminFraktion V) Lösung bestimmt werden, deren Konzentration im Messbereich des BiuretTests liegt. Hinweis: Eine Unbekannte wird immer mindestens in Doppelbestimmung gemessen. Es sollen zwei Messreihen durchgeführt werden: Messreihe 1, ohne Fällung: 10 Standards, gleichmäßig über den Messbereich verteilt. Die erforderlichen Teilvolumina aus der Stammlösung entnehmen und auf 0,4ml mit A.dest. ergänzen. Messreihe 2, mit Fällung: 5 von den in Messreihe 1 festgelegten Verdünnungen auswählen, je zweimal (Doppelbestimmung) herstellen und vor dem BiuretTest die oben beschriebene Fällung durchführen. BiuretReagenz herstellen (Angaben s.o.). Pipettiertabelle für die Herstellung der Standards erstellen: Aus der Testdurchführung Messbereich in mg/ml definieren. ß (Stammlösung) entspricht oberer Messbereichsgrenze RGNr. ß (mg/0,4ml) ß (mg/ml) V Stamml. (µl) V A.dest (µl) Reihe Für die o.a. zwei Messreihen den Bedarf an Protein (BSA V) kalkulieren und ausreichendes Volumen Stammlösung herstellen. Hinweis: generelle Mindesteinwaage 50mg, ßKonz. sind normalerweise in Messkolben herzustellen, hier ohne große Fehler Zugabe des Endvolumens mit Pipette möglich. Benötigtes Protein direkt in FalconTubes, 15ml, einwiegen. Schaumbildung beim Lösen kann durch Zentrifugieren entfernt werden. Standards herstellen (s.o. Pipettiertabelle) d.h. z.b. für Messreihe 2: fällen usw.. Proben ( Unbekannte ) in Doppelbestimmung für Messreihe 1 und 2 herstellen, d.h. z.b. für Messreihe 2: fällen usw.. Blindprobe nicht vergessen

6 Stand HL Seite 6 von 6 Fotometer anstellen An jedem der drei Spektralfotometer liegt eine KurzBedienungsanleitung. Machen Sie sich mit dem Fotometer vertraut und gehen Sie nach der Bedienungsanleitung(Konfigurationseinstellungen, Bestimmungsmethode) vor. Jeweils eine Kalibrierkurve aus den zwei Messreihen erstellen und den Proteingehalt der Proben ( Unbekannten ) ermitteln. Die Ergebnisse mit der tatsächlich hergestellten Konzentration und die beiden Messreihen untereinander vergleichen. weitere Hinweise: Es gibt verschiedene Möglichkeiten Standards herzustellen, so z.b. Arbeiten mit größeren Volumina, aus denen das Probenvolumen entnommen wird die einzelnen Stufen durch Unterverdünnung herstellen, usw.. Mit Schülergruppen empfiehlt sich, das Arbeiten mit Fotometern, die Herstellung von Verdünnungsreihen usw. mit einem Farbstoff zu üben, bevor eine Proteinbestimmung durchgeführt wird. (vgl. VA Einführung in die Fotometrie) Da meist mehr als ein Praktikum für obige VA zu veranschlagen ist: Stammlösung und Standards aus BSA können zur Verhinderung eines mikrobiellen Abbaus eingefroren werden. Beim Auftauen gründliches Mischen nicht vergessen. Im Kühlschrank und in verschlossenen Reaktionsgefäßen halten sich mit Biuret versetzte Proben mindestens eine Woche. Anwendungsbeispiele: soll nur die Analytik an sich geübt werden, empfehlen sich Lebensmittelproben, z.b. Proteinextraktion aus eiweißreichen Pflanzensamen mit geeigneten Puffern, Vergleich mit Literaturwerten, Diskussion der Unterschiede (z.b. lösliche/nicht lösliche Speicherproteine) Proteinextraktion aus Fleisch Werden verschiedene Fischsorten als Ausgangsmaterial verwendet, kann die Proteinbestimmung genutzt werden, um die Proben auf sinnvolle Konzentration in einer PAGE verdünnen zu können. soll eine Proteinbestimmung im Rahmen von Stoffwechseluntersuchungen oder/ und Biomasseproduktion eingesetzt werden, bietet sich folgendes an: im Sinne von Projekt bzw. Lernsituationorientiertem Unterricht bzw. selbstorganisiertem Lernen kein fertiges Versuchsprotokoll ausgeben, sondern Formulierung einer Aufgabenstellung, z.b. 1. Es soll ein (oder mehrere) Aufschlussverfahren für Hefezellen optimiert/verglichen werden (Ziel könnte eine ADHIsolierung sein) 2. Die Biomasseproduktion von Hefe unter verschiedenen Bedingungen soll verfolgt werden (hier könnten aerobe und anaerobe Bedingungen verglichen und untersucht werden, ob die Trockenmassebestimmung mit der Proteinbestimmung korreliert) Informationsbeschaffung, z.b. Internet Entwicklung einer Versuchsanleitung z.b. zu 1.: Variation und Vergleich verschiedener Parameter verschiedene Aufschlusspuffer (ohne und mit Detergenz, wegen cytosolischen / membrangebundenen Proteinen, ohne/mit verschiedenen Osmolytika, ohne/mit EDTA) verschiedene Materialien (Sand Aluminiumoxid Glasperlen), Glassbeads unterschiedlicher Größe, VortexDauer, Anteile HefePufferBeads usw. usw. Durchführung, Messwertaufnahme Auswertung und Präsentation der Ergebnisse (Berechnungen, Schaubilder, Grafiken)