Cholesterinbestimmung

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1 Cholesterinbestimmung TEAS Themen Cholesterin, Lipoproteine, Photometrie, Hyperlipidämie Prinzip Cholesterin ist ein Bestandteil aller biologischen Membranen und damit ein lebenswichtiges Lipid. Erhöhte Cholesterinwerte stellen einen wesentlichen Risikofaktor für arteriosklerotische Gefäßerkrankungen, insbesondere für die koronare Herzkrankheit dar. Die Cholesterin-Konzentration in einer Blutprobe wird photometrisch durch eine Farbindikatorreaktion bestimmt. Material Studenten-Basis-Set 1 Mikroliterpipette µl Mikroliterpipette µl Reagenzglasgestell, PP, 12 Plätze Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml Pipettierball Digitale Stoppuhr Laborbecher, 100 ml, PP Laborschreiber, wasserfest Pipettenspitzen μl im Halter, 96 Stk Pipettenspitzen μl im Halter, Stk Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk Einweg-Rührspatel, 500 Stk Halbmikro-Küvetten Küvettenständer Laborausstattungs-Set 1 Photometer Chemikalien 1 Wasser, destilliert, 5 l Zusätzlich werden folgende Reagenzien benötigt Cholesterinreagenz Kontrolle TruLab N und P Abb. 1: P P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 TEAS Cholesterinbestimmung Hinweis: Die für diesen Versuch verwendeten Reagenzien und Kontrollproben sind im Anhang aufgelistet. Achtung! Beachten Sie stets die Vorbemerkungen, wenn Sie diesen Versuch durchführen. Aufgaben 1. Bestimmen Sie den Cholesterin-Gehalt einer Serumprobe und einer Kontrolle. 2. Berechnen Sie die zughörige Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes. Durchführung Reagenzvorbereitung Reagenz ist gebrauchsfertig Standard ist gebrauchsfertig, er ist in der Packung des Reagenzes enthalten. Reagenz auf Raumtemperatur bringen, Beipackzettel beachten. Messung Die Temperatur sollte C betragen. Insgesamt werden 4 Proben vermessen: - Leerwert - Standardprobe - Kontrollprobe - Patientenprobe Jeweils 10 µl der Probe bzw. destilliertes Wasser für den Reagenzleerwert werden mit 1000 µl des Reagenzes direkt in der Messküvette gemischt. Nach 10 Minuten inkubieren bei Raumtemperatur soll die Extinktion innerhalb von 60 Minuten gegen den Reagenzleerwert gemessen werden. Abb. 2: Durchführung Pipettierschema Untersuchungsmaterial Serum - Siehe Kapitel Präanalytik TruLab P oder N dienen als Kontrollproben. Sie sind lyophylisiert, entsprechend des Beipackzettels in destilliertem Wasser lösen (siehe Kapitel Vorbemerkung). Reagenzleerw ert Probe/Standard/ - 10 µl Kontrolle Aqua dest. 10 µl - Probe/Stan dard/ Kontrolle Reagenz 1000 µl 1000 µl Zunächst muss der Reagenzleerwert eingestellt werden: - Gerät einschalten: on/off - Wellenlänge einstellen: 550 nm - Leerwertküvette in die Messzelle stellen, dann Referenz-Messung starten: Taste R drücken Messung der Proben: - Probe in die Messzelle stellen, Messung starten: Taste T drücken - Extinktion ablesen - Gerät abschalten: on/off 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

3 Cholesterinbestimmung TEAS Grundlagen Cholesterin ist als Bestandteil aller biologischen Membranen ein lebenswichtiges Lipid. Außerdem ist es Biosynthese-Vorstufe zahlreicher Steroidhormone, des Vitamin D und der Gallensäuren. Wegen ihrer geringen Wasserlöslichkeit liegen die Cholesterine und Cholesterinester im Plasma ausschließlich gebunden an verschiedenen Lipoproteinen vor. Cholesterin wird mit der Nahrung aufgenommen aber auch endogen synthetisiert. Die Ausscheidung erfolgt über die Haut, die Galle sowie über den Darm, wobei eine Rückresorption über den enterohepatischen Kreislauf ebenfalls möglich ist. Eine Cholesterinbestimmung dient der Früherkennung eines Arteriosklerose-Risikos und Therapiekontrolle mit lipidsenkenden Medikamenten sowie der Diagnose von Hyper- und Hypolipoproteinerkankungen. Werden im Serum eines Patienten nach 12-stündiger Nahrungskarenz hohe Triglycerid- und/oder Cholesterinwerte gemessen, ist eine Hyperlipoproteinämie bewiesen. Hyperlipoproteinämien sind Stoffwechselerkrankungen auf dem Boden gesteigerter Synthese oder eines verzögerten Abbaus von Lipoproteinen, die Cholesterin und Triglyceride im Blutplasma transportieren. Erhöhte Plasmalipoprotein- Konzentrationen verursachen Arteriosklerose. Ist die Ursache angeboren, spricht man von primären Hyperlipidämien. Tritt die Erhöhung der Blutfette im Rahmen einer Erkrankung auf (z. B. Diabetes mellitus, Nierenerkrankung, Alkoholismus) spricht man von einer sekundären Hyperlipidämie. Sekundäre Hyperlipidämien sind häufiger. Die Hyperhomocysteinämie wird als unabhängiger Risikofaktor einer atheriosklerotischen Gefäßerkrankung eingestuft. Homocysteinerhöhungen führen zur Gefäßendothelschädigung. Tritt meist bei Vitamin- B12-, -B2-, -B6-Mangel sowie Folsäuremangel auf. Weiterführende Diagnostik: Triglyceride, Lipoproteinelektrophorese, Homocystein Testprinzip Nach enzymatischer Hydrolyse der Cholesterinester wird das gesamte Cholesterin von Luftsauerstoff oxidiert. Dabei entsteht Wasserstoffperoxid, das mit Phenol und 4-Aminophenazon unter Einwirkung von Peroxidase einen roten Farbstoff ergibt, dessen Extinktion bei 546 nm bestimmt wird. Die Farbintensität ist der Cholesterinkonzentration direkt proportional und wird über einen Standard berechnet. Auswertung Aufgabe 1 Der Cholesteringehalt kann direkt aus der Extinktion der Proben über den Standard ermittelt werden. Da der Standard in mg/dl angegeben ist, soll im Anschluss die Umrechnung der Konzentration in die SI- Einheit (mmol/l) erfolgen. E Probe c Cholesterin [mg dl] = E Standard c Standard[mg dl] c Cholesterin [mg dl] = c Cholesterin [mmol l] Beispiel: c Standard = 200 mg/dl, ΔE Probe = 0,17, ΔE Standard = 0,25 c Kontrolle [mg dl] = 0, mg dl = 136 [mg dl 0,25 ] P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 TEAS Cholesterinbestimmung Aufgabe 2: Berechnen Sie die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes Mit der Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes überprüft man, ob das Experiment mit Fehler behaftet ist. Dafür wird neben einer Patientenprobe auch eine Kontrollprobe gemessen. Der im Experiment ermittelte Wert der Kontrollprobe ist der sogenannte Ist-Wert. Von der Kontrolle kennen wir aber auch den eigentlichen Wert, den Soll-Wert. Er ist auf der Packungsbeilage des Kontrollserums (Trulab P oder N) angegeben. Aus dem ermittelten Ist-Wert und dem bekannten Soll-Wert ergibt sich die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes in % nach folgender Formel: Soll Ist KoPEM[%] = 100 Soll Beispielrechnung: Konzentration der Kontrolle Ist: 136 mg/dl Konzentration der Kontrolle Soll: 146 mg/dl KoPEM[%] = 100 = 6,8 % 146 Im Anschluss wird die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes vom Sollwert mit den landesüblich erlaubten Grenzen verglichen. In der Bundesrepublik Deutschland wird diese Grenze für Cholesterin in der Tabelle B 1a RiliBÄK auf +/-7,0 % angegeben. In unserem Beispiel erfüllt der Kontrollprobeneinzelmesswert diese Vorgabe. Folglich kann der Patient beurteilt werden. Achtung: Bitte die gesetzlichen Vorgaben des jeweiligen Landes beachten! Siehe Kapitel Vorbemerkung. Referenzwerte Erwachsenen <240 mg/dl Hinweis Fehlerquellen: stark lipämische, ikterische oder hämolytische Proben. Fragen - Warum braucht Cholesterin ein Transportprotein im Körper? Lipide sind nicht wasserlöslich, aus diesem Grund brauchen sie in der Blutbahn ein Transportmolekül - Was muss bei der Blutabnahme beachtet werden? Standardisierte Blutabnahme: 12-stündige Nahrungskarenz - Wofür braucht der Körper Cholesterin? Membranaufbau, Steroidhormonsynthese, Gallensäureproduktion 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

5 Cholesterinbestimmung TEAS Protokoll Aufgabe 1 Bitte tragen Sie Ihre Messwerte in die folgende Tabelle ein. Extinktion Konzentration [mg/dl] Leerwert Standard (lt Packung) Kontrolle TruLab N Patient 1 Aufgabe 2 Notieren Sie die Abweichung des KoPEM und diskutieren Sie das Ergebnis. Fragen - Warum braucht Cholesterin ein Transportprotein im Körper? - Was muss bei der Blutabnahme beachtet werden? - Wofür braucht der Körper Cholesterin? P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

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