Gerinnung: Quicktest

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1 Gerinnung: Quicktest TEAS Themen Plasmatische Gerinnung/exogener Aktivierungsweg, Quick/Thromboplastinzeit, Koagulometer Prinzip Der Quicktest gehört zu den Gerinnungsanalysen, der als Screeninguntersuchung durchgeführt wird. Die Gerinnungszeit nach Quick (auch als Thromboplastinzeit genannt) ist ein Maß für den Gehalt an Gerinnungsfaktoren des exogenen Systems (VII, X, II, I). Die Gerinnungszeit wird mit Hilfe eines Koagulometers bestimmt. Da die Thromboplastinzeit in Sekunden gemessen, aber in % angegeben wird, benötigen wir zusätzlich eine Eichgerade, die ebenfalls in diesem Versuch beschrieben ist. Material Studenten-Basis-Set 1 Mikroliterpipette µl Mikroliterpipette µl Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml Pipettierball Digitale Stoppuhr Laborschreiber, wasserfest Küvettenständer Koagulometer Startset Pipettenspitzen μl im Halter, 96 1 Stk Pipettenspitzen μl im Halter, Stk Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk Einmalreaktionsgefäß 1,5 ml, 1000 Stk Laborausstattungs-Set 1 Koagulometer Chemikalien 1 0,9% NaCl-Lösung Wasser, destilliert, 5 l Zusätzlich werden folgende Reagenzien benötigt Quick-Reagenz Standard Humanplasma 100% Quick Kontrollplasma normal Kontrollplasma abnormal Hinweis: Die für diesen Versuch verwendeten Reagenzien und Kontrollproben sind im Anhang aufgelistet. Standard Humanplasma kann entweder aus einem vorhandenen Standard-Pool, eine Mischung von Patientenplasmen, die alle einen Quick-Wert von 100% haben, genommen werden oder käuflich erworben werden (siehe Anhang). Achtung! Beachten Sie stets die Vorbemerkungen, wenn Sie diesen Versuch durchführen. Abb.1: P P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 TEAS Gerinnung: Quicktest Aufgaben 1. Erstellen Sie eine Eichgerade aus einer Verdünnungsreihe und ermitteln Sie daraus den Quickwert einer Patientenprobe und einer Kontrollprobe. 2. Berechnen Sie die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes. 3. Berechnen Sie die International Normalized Ratio. Durchführung Reagenzvorbereitung Das Reagenz ist lyophilisiert und muss vor Gebrauch wieder in destilliertem Wasser gelöst werden. Siehe auch: Kapitel Vorbemerkung. - Rekonstituieren Sie mit genau 10 ml destilliertem Wasser das lyophilisierte Reagenz (Siehe Kapitel Vorbemerkung). - Vorsichtig schwenken, mindestens 15 Minuten stehen lassen. Das gelöste Reagenz ist bei 2 8 C 5Tage verwendbar. - Reagenz vor der Messung mindestens 10 Minuten auf 37 C temperieren. Untersuchungsmaterial - Natriumcitratplasma - Mischungsverhältnis: 9 Teile Blut + 1 Teil Citrat, Abb. 2: Verdünnungsreihe siehe Kapitel Präanalytik - Standardhumanplasma ist lyophilisiert (siehe Hiweis) - BasiCon 1 Kontrollplasma normal/bzw. BasiCon 2 Kontrollplasma abnormal sind lyophylisiert, entsprechend des Beipackzettels in destilliertem Wasser lösen (siehe Kapitel Vorbemerkung). Aus dem Standardhumanplasma (oder Normal - Plasmapools) stellt man eine Verdünnungsreihe nach dem folgenden Pipettierschema her. Abb. 3: Einschalten des MC1 1. Verdünnung 2. Verdünnung 3. Verdünnung 4. Verdünnung 50% 25% 12,5% 6,25 % 500 µl NaCl-Lösung 500 µl NaCl-Lösung 500 µl NaCl-Lösung 500 µl NaCl-Lösung 500 µl Standard 100% 500 µl Standard 50% 500 µl Standard 25% 500 µl Standard 12,5% mischen mischen mischen mischen Einschalten des Koagulometers - Greiner Koagulometer einschalten. - Bei der Abfrage der Ergebnis-Berechnung nein anwählen - Reagenz auf 37 C (im Koagulometer Reagenzröhrchen) temperieren 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

3 Gerinnung: Quicktest TEAS Ablauf einer Messung - Eine Küvette mit Metallkugel in die Messzelle stellen µl der zu vermessenden Probe vorlegen - Programm starten Taste drücken - Inkubation,1 min. bei 37 C Taste drücken - Programm starten Taste drücken µl Reagenz zufügen und gleichzeitig Messung starten: Taste drücken - Gerinnungszeit ablesen Dieser Ablauf ist für alle Messungen gleich. Es müssen der 100% Standard und die 50%-, 25%-, 12,5%-, 6,25 %-Standardverdünnungen gemessen werden und im Anschluss die Kontrollprobe (für Aufgabe2) und die Patientenprobe. Grundlagen Der Quicktest gibt eine Aussage über den Gehalt an Gerinnungsfaktoren des exogenen Systems (I, II, V, VII, X). Der Quickwert kann bei angeborenem Faktorenmangel des extrinsischen Systems, bei Leberschädigung oder einer Marcumartherapie erniedrigt sein. Da die Leber die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X nur dann synthetisiert, wenn Vitamin K zur Verfügung steht, führt auch Vitamin K-Mangel zu pathologischen Quick-Werten. Die Thromboplastinzeit einer Plasmaprobe wird in Sekunden gemessen aber in Prozent berichtet. Aus diesem Grund braucht man eine Kalibrationsgerade, die aus verschiedenen Verdünnungen eines Normal -Plasmapools oder eines Standardhumanplasmas vorher ermittelt werden soll. Zur Gerinnung wird die Patientenprobe mit Gewebsthromboplastin und Ca 2+ -Ionen versetzt. Die Gerinnungszeit der Probe wird mit Hilfe eines Kugelkoagulometers erfasst. Die im Rahmen eines Quicktests erhaltenen Werte sind stark abhängig vom verwendeten Thromboplastin sowie von der Messmethode, was zum erheblichen Problem bei der Vergleichbarkeit der Quickwerte in Prozent zwischen verschiedenen Laboratorien geführt hat. Um dieses Problem umzugehen, wurde die International Normalized Ratio (INR) eingeführt. Sie ist eine von Methoden und Reagenzien unabhängige Größe. Bestimmungsmethode Im Einkanal Kugelcoagulometer MC1 dreht sich eine schräggelagerte Messküvette langsam um ihre Längsachse. Die Stahlkugel in der Küvette bleibt auf Grund der Schwerkraft am niedrigsten Punkt der Küvette liegen. Gerinnt das zugefügte Proben/Reagenzgemisch, zieht der Gerinnnungsfaden die Kugel aus ihrer Position. Ein Magnetsensor detektiert die Lageänderung der Kugel und stoppt einen zuvor gestarteten elektronischen Zeitmesser. Auswertung Aus den Gerinnungszeiten der Verdünnungen des Standardhumanplasmas oder Normal -Plasmapools, deren Quick-Werte sich direkt aus der Verdünnung berechnet werden, wird nun auf halblogarithmischem Papier eine Eichgerade erstellt. Die Gerinnungszeiten der Kontrollprobe bzw. Patientenprobe werden dann in diese Darstellung eingetragen und ihre Quickwerte anhand der Skala und der Tabelle ermittelt. Gerinnungszeit Quick in % Standard ,5 s 100 Standard 50 18,2 s 50 Standard 25 27,6 s 25 Standard 12,5 53,2 s 12,5 Kontrolle 29 s 27 Patient 1 36 s 20 Das folgende Beispiel soll dieses Vorgehen verdeutlichen. Die Patientenprobe hat eine Gerinnungszeit von 36 s. Aus dem Schnittpunkt der Eichgerade bzw. der von diesem Punkt aus gezogenen Senkrech- P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 TEAS Gerinnung: Quicktest ten auf der x-achse wird anhand der y-achse eingezeichneten Skala zunächst der Reziprok-Wert und mithilfe der Tabelle dann der Quickwert bestimmt. Aufgabe 2: Berechnen Sie die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes Mit der Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes überprüft man, ob das Experiment mit Fehler behaftet ist. Siehe Kapitel Vorbemerkung. Der im Experiment ermittelte Wert der Kontrollprobe ist der sogenannte Ist-Wert. Von der Kontrolle kennen wir aber auch den eigentlichen Wert, den Soll-Wert. Er ist auf der Packungsbeilage des Kontrollserums (BasiCon 1 oder 2) angegeben. Aus dem ermittelten Ist-Wert und dem bekannten Soll-Wert ergibt sich die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes nach folgender Formel: KoPEM[%] = Soll Ist Soll PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

5 Gerinnung: Quicktest TEAS Berechungsbeispiel: Ist-Wert der Kontrolle: Soll-Wert der Kontrolle: KoPEM[%] = 29 sec 30,7 sec Soll Ist Soll 100 = = 5.5% 30.7 Im Anschluss wird die Abweichung des Kontrollergebnisses mit den erlaubten Grenzen verglichen. Nach Tabelle 1a RiliBÄK für Thromboplastinzeit darf das Kontrollergebnis bis zu +/-11,5 % abweichen. In unserem Beispiel erfüllt die Messung der Kontrolle diese Vorgabe. Folglich kann der Patient beurteilt werden. Achtung: Bitte die gesetzlichen Vorgaben des jeweiligen Landes beachten! Siehe Kapitel Vorbemerkung. Aufgabe 3: Berechnung der INR (=International Normalized Ratio) Die Grundlage der INR- Berechnung ist die Prothrombin-Ratio (PR): PR = Gerinnungszeit des Patientenplasmas (sec) Gerinnungszeit des Normalplasmapools (Standard) (sec) Jede Reagenziencharge wird an internationalem Referenzthromboplastin kalibriert. Das Ergebnis wird in ISI (Internationaler Empfindlichkeits-Index) angegeben (Siehe Beipackzettel des Reagenzes). Daraus lässt sich mit Hilfe der PR die INR (International Normalized Ratio) nach folgender Formel berechnen. INR= PR ISI Berechungsbeispiel: Standard 100 % Kontrolle (K) Patient (P1) Ist-Wert 14,5 s 29 sec 36 sec ISI-Wert (laut Beipackzettel des Reagenzes): 1.08 INR Kontrolle = PR ISI = = 2.1 INR Patient = PR ISI = = 2.6 Mit einem INR von 2.6 liegt unser Patient außerhalb des normalen Bereichs. Die Gerinnungszeit ist also verlängert im Vergleich zum normalen Wert. Referenzwerte: - INR P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

6 TEAS Gerinnung: Quicktest Quick-Wert (Prozent der Norm) % Weitere Informationen zu den Referenzwerten: siehe Kapitel Vorbemerkung. Fragen - Erläutern Sie den genauen Ablauf der Gerinnung beim exogenen Mechanismus, welche Rolle spielen die Ca +2 -Ionen? Beim exogenen Mechanismus aktiviert das Gewebsthromboplastin (PIIl) den Gerinnungsfaktor VII in seine aktive Form VIIa, VIIa überführt den Gerinnungsfaktor X in seine aktive Form Xa, der Prothrombin in Thrombin spaltet. Thrombin wiederum ist in der Lage vom Fibrinogen kleinere Einheiten abzu spalten, um Fibrin zu bilden. Ein Teils dieser Reaktionen (siehe Schema) findet nur in Gegenwart von Ca 2+ -Ionen statt, weshalb durch die Zugabe dieser Ionen die Gerinnung gezielt gestartet werden kann. - Warum führt man die Gerinnungsuntersuchungen nicht mit Serum durch? Im Serum sind die Gerinnungsfaktoren schon verbraucht. Serum wird schließlich aus einer bereits geronnen Blutprobe durch Zentrifugation gewonnen. - Warum rechnet man den INR-Wert aus? Um die Vergleichbarkeit von Patientenergebnissen zu gewährleisten, die mit unterschiedlichen Reagenzien und Nachweismethoden untersucht worden sind. 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P

7 Gerinnung: Quicktest TEAS Protokoll Aufgabe 1 Tragen Sie Ihre Ergebnisse der 100%, 50 %-, 25%-, 12,5%-, 6,25 %-Standardverdünnungen sowie der Kontroll- und Patientenproben in folgende Tabelle ein und erstellen Sie dann die Eichgerade mit dem halblogarithmischen Papier auf der nächsten Seite. Ermitteln sie daraus die Quickwerte der Proben. Gerinnungszeit Quick in % Standard Standard Standard Standard 12,5 12,5 Standard 6,25 6,25 Kontrolle Patient 1 Aufgabe 2 Notieren Sie die Abweichung des KoPEM und diskutieren Sie das Ergebnis. Aufgabe 3 Notieren Sie die von Ihnen berechnete INR und diskutieren Sie das Ergebnis. P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 7

9 Gerinnung: Quicktest TEAS Fragen - Erläutern Sie den genauen Ablauf der Gerinnung beim exogenen Mechanismus, welche Rolle spielen die Ca +2 -Ionen? - Warum führt man die Gerinnungsuntersuchungen nicht mit Serum durch? - Warum rechnet man den INR-Wert aus? P PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 9