B Quantitative Bestimmung der shla und scd74 Moleküle

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1 B - 5 Vera Rebmann und Hans Grosse-Wilde B Einleitung Lösliche HLA Klasse I Moleküle (shla-i) wurden erstmalig 1970 von van Rood (1) und Charlton (2) im Serum von gesunden Probanden nachgewiesen. Weitere Studien zeigten, daß auch lösliche HLA Klasse II Moleküle (shla-ii) existieren. shla-i kommt in fast allen Körperflüssigkeiten vor und wird hauptsächlich von der Leber, aber auch von anderen HLA exprimierenden Somazellen produziert. Während für shla-i eine immunologische Funktion zunächst von Ploegh und Güssow (3) erheblich in Frage gestellt wurde, belegen neuere Studien die vielfachen funktionellen Eigenschaften der shla Moleküle. So werden heute immunmodulierende Eigenschaften bei Infektionen, inflammatorischen Prozessen und Abstoßungsepisoden nach Organtransplantation sowie Apoptose von Immunzellen, aber auch die individuelle Erkennung über shla und olfaktorischen Rezeptoren diskutiert (4-6). Das CD74 Antigen oder die invariante Kette von HLA Klasse II ist ein typisches intrazelluläres Glykoprotein und reguliert durch die Assoziation mit HLA Klasse II Molekülen im Endoplasmatischen Reticulum den Transport dieser Moleküle zu den Endosomen und damit die Präsentation von exogenen Peptiden durch die HLA Klasse II Antigene auf der Zelloberfläche. Eine neuere Studie zeigt, daß CD74 auch als lösliches Molekül im Serum vorkommt (7). Ebenso wie für shla Antigene sollte hier die immunologische und ggf. diagnostische Bedeutung weiter geklärt werden. Dabei ist die quantitative Erfassung von shla und scd74 Molekülen eine methodische Grundlage für die wissenschaftliche Analyse dieser Moleküle. B Quantitative Bestimmung der shla und scd74 Moleküle B Bestimmung der shla-i Konzentration B Prinzip Die quantitative Bestimmung der shla und scd74 Moleküle wird mit Hilfe der Sandwich ELISA-Technik durchgeführt. Bei dieser Methode werden nach Adsorption eines Antikörpers (Fängerantikörper) an eine feste Phase (Mikrotiterplatte) Antigene aus Lösungen spezifisch gebunden, die daraufhin mit einem zweiten Antikörper (Detektionsantikörper) erkannt werden können. Entscheidende Voraussetzung ist, daß Fänger- und Detektionsantikörper an unterschiedliche Epitope des Antigens binden. Nach spezifischer Bindung eines enzymkonjugierten Antikörper an den Detektionsantikörper und Zugabe einer Substratlösung DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

2 wird der Umsatz der enzymatischen Reaktion photometrisch oder fluorometrisch gemessen. Dabei verhalten sich die ermittelten optischen Dichten (Fluoreszenz-Intensitäten) proportional den gebundenen enzymkonjugierten Antikörpern bzw. den Antigenen. B Material Mikrotiter (Costar GmbH, Bodenheim) ELISA Waschgerät Photometer EDTA-Plasma B Reagenzien: Antikörper: mak w6/32 (Biozol, Eching) POX Kaninchen anti-human ß2-Mikroglobulin (DAKO, Hamburg) Standard: rekombinantes HLA-B7 (rhla-b7),(8); oder eine Plasma-Probe mit bekannter shla-i Konzentration Puffer: PBS (ph 7,2), PBS-BSA (2 %), PBS-Tween (0,05 %) Citrat-Puffer (ph 5,0): 0,1 M Citronensäure-1-Hydrat 0,1 M tri-natriumcitrat-dihydrat Substrat: H 2 O 2 (30%) o-phenylendiamine (OPD) Stoplösung: 3 M H 2 SO 4 B Durchführung 1) Der mak w6/32 wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,2 µg/ml verdünnt. Jeweils 100 µl dieser Verdünnung werden pro Kavität der Mikrotiterplatte dazugegeben und über Nacht bei 4 C inkubiert. 2) Nicht gebundener mak wird durch Waschen (3x) mit PBS-Tween (0,05%) entfernt. 3) Die Blockierung der noch freien Bindungsstellen der Mikrotiterplatte erfolgt durch Inkubation mit einer 2% BSA-PBS Lösung (250 µl / Kavität) bei Raumtemperatur (RT), 1h. 4) Überschüssiges BSA wird durch Waschen (3x) mit PBS-Tween (0,05%) entfernt. 5) EDTA-Plasma Proben werden 1:26 mit PBS verdünnt. Standards (rhla-b7) in Konzentrationen von 2,5; 6,25; 25; 50; 62,5 und 125 ng/ml und EDTA-Proben werden in einem Volumen von 100 µl / Kavität aufgetragen. Die Inkubation erfolgt bei RT, 1h. 6) Nicht gebundenes shla-i wird durch Waschen (3x) entfernt. 68 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998

3 7) POX konjugierter anti-human ß 2 -Mikroglobulin Antikörper wird 1:1.000 mit PBS verdünnt und jeweils 100 µl / Kavität aufgetragen. Inkubation erfolgt bei RT, 1h. 8) Überschüssige Antikörper werden durch Waschen (3x) entfernt. 9) 10 mg OPD werden in 10 ml Citrat-Puffer und 8µl H 2 O 2 gelöst und jeweils 100 µl / Kavität aufgetragen. Inkubation erfolgt bei RT im Dunkeln, 15 min. 10) Die Reaktion wird mit 50 µl / Kavität 3 M H 2 SO 4 gestoppt und der Substratumsatz bei 490 nm photometrisch gemessen. Anhand der Standardkurve können die shla-i Konzentrationen ermittelt werden. B Bestimmung der shla-dr Konzentration B Durchführung B Material Mikrotiter (Costar GmbH, Bodenheim, Kat.: 2581) ELISA Waschgerät Fluorometer EDTA-Plasma B Reagenzien Antikörper: mak L243 (IgG2a), (Becton Dickenson, Heidelberg, Kat.: 7360 ) mak anti HLA-DR (IgG1), (Boehringer, Heidelberg, Kat.: ) AP Ziege anti-maus IgG1, (Serva, Heidelberg, Kat.: ) Standard: affinitätsgereinigtes HLA-DR4 Puffer: Carbonat-Puffer (ph 9,6): 0,05 M K 2 CO 3 0,05 M KHCO 3 3% BSA-Carbonat-Puffer (ph 9,6) PBS PBS-Tween (0,0 5 %) Diethanolamin-Puffer (ph 9,6): 1 M Diethanolamin 0,5 mm MgCl 2 MUP-Stammlösung 10 mm 4-Methylumbelliferylphosphat (wird bei -20 C gelagert) Stopplösung: 1 M NaOH DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

4 B Durchführung 1) Der mak L243 wird mit 0,05 M Carbonat-Puffer (ph 9,6) auf eine Konzentration von 0,025 µg / ml verdünnt. 100 µl dieser Verdünnung werden pro Kavität der Mikrotiterplatte dazugegeben und über Nacht bei 4 C inkubiert. 2) Überschüssige mak werden durch Waschen (3x) mit PBS-Tween (0,05 %) entfernt. 3) Die Blockierung der noch freien Bindungsstellen der Mikrotiterplatte erfolgt durch Inkubation mit einer 3 % BSA-Carbonat-Puffer (250 µl / Kavität) bei 37 C, 1 h. 4) Überschüssiges BSA wird durch Waschen (3x) mit PBS-Tween (0,05%) entfernt. 5) Standards in Konzentrationen von 0,2; 0,3; 0,4; 0,65; 0,8 und 1,4 µg / ml und unverdünnte EDTA-Plasma Proben werden in einem Volumen von 100 µl / Kavität aufgetragen. Die Inkubation erfolgt bei 37 C, 1,5 h. 6) Nicht gebundenes Antigen wird durch Waschen (3x) entfernt. 7) Der HLA-DR mak wird 1:1000 mit PBS verdünnt und jeweils 100 µl / Kavität aufgetragen. Inkubation erfolgt bei 37 C, 1 h. 8) Überschüssige mak werden durch Waschen (3x) entfernt. 9) AP konjugierter anti-maus IgG1 Antikörper wird 1:1.000 mit PBS verdünnt und jeweils 100 µl / Kavität aufgetragen. Inkubation erfolgt bei 37 C, 1 h. 10) Überschüssige Antikörper werden durch Waschen (3x) entfernt 11) 100 µl MUP-Stammlösung wird mit 10 ml Diethanolamin-Puffer gemischt und jeweils 100 µl / Kavität aufgetragen. Inkubation erfolgt bei RT im Dunkeln, 40 min. 12) Die Reaktion wird mit 50 µl / Kavität 1 M NaOH gestoppt und der Substratumsatz bei Ex 355 nm / Em 460 nm fluorometrisch gemessen. Anhand der Standardkurve können die shla-dr Konzentrationen ermittelt werden. 70 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998

5 B Bestimmung der scd74 Konzentration B Prinzip Die quantitative Bestimmung der scd74 Moleküle wird mit Hilfe der Sandwich ELISA- Technik durchgeführt. Bei dieser Methode werden nach Adsorption eines Antikörpers (Fängerantikörper) an eine feste Phase (Mikrotiterplatte) Antigene aus Lösungen spezifisch gebunden, die daraufhin mit einem zweiten Antikörper (Detektionsantikörper) erkannt werden können. Entscheidende Voraussetzung ist, daß Fänger- und Detektionsantikörper an unterschiedliche Epitope des Antigens binden. Nach spezifischer Bindung eines enzymkonjugierten Antikörper an den Detektionsantikörper und Zugabe einer Substratlösung wird der Umsatz der enzymatischen Reaktion photometrisch oder fluorometrisch gemessen. Dabei verhalten sich die ermittelten optischen Dichten (Fluoreszenz-Intensitäten) proportional den gebundenen enzymkonjugierten Antikörpern bzw. den Antigenen. B Durchführung B Material Mikrotiter (Costar GmbH, Bodenheim, Kat.: 2581) ELISA Waschgerät Photometer EDTA-Plasma B Reagenzien Antikörper: mak Bu45 (IgG1), (Binding Sites GmbH, Heidelberg, Kat.: MC120) mak M-B741 (IgG2a), (Alexis GmbH, Grünberg, Kat.: ) POX Ziege anti-maus IgG2a (Serva, Heidelberg, Kat.: ) Positiv-Kontrolle: 10 6 Detergenz solubilisiertes Zell-Lysat der Zellinie RAJI Puffer: Carbonat-Puffer (ph 9,6): 0,05 M K 2 CO 3 0,05 M KHCO 3 3% BSA-Carbonat-Puffer (ph 9,6) PBS PBS-Tween (0,05 %) Antikörperpuffer: PBS-Tween (0,05 %) 1 % BSA 1M NaCl Citrat-Puffer (ph 5,0): 0,1 M Citronensäure-1-Hydrat 0,1 M tri-natriumcitrat-dihydrat Substrat: H 2 O 2 (30%), OPD DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

6 Stopplösung: 3 M H 2 SO 4 B Durchführung 1) Der mak Bu45 wird mit Carbonat-Puffer (ph 9,6) auf eine Konzentration von 1,3 µg / ml verdünnt. 100 µl dieser Verdünnung werden pro Kavität der Mikrotiterplatte dazugegeben und über Nacht bei 4 C inkubiert. 2) Überschüssige mak werden durch Waschen (3x) mit PBS-Tween (0,05 %) entfernt. 3) Die Blockierung der noch freien Bindungsstellen der Mikrotiterplatte erfolgt durch Inkubation mit einem 3% BSA-Carbonat Puffer (250 µl / Kavität) bei 37 C, 1 h. 4) Überschüssiges BSA wird durch Waschen (3x) mit PBS-Tween (0,05 %) entfernt. 5) Positiv-Kontrolle und unverdünnte EDTA-Plasma Proben werden in einem Volumen von 100 µl / Kavität aufgetragen. Die Inkubation erfolgt bei 37 C, 1,5 h. 6) Nicht gebundenes scd74 wird durch Waschen (3x) entfernt. 7) mak M-B741 wird auf eine Konzentration von 0,6 µg / ml mit Antikörper-Puffer verdünnt und jeweils 100 µl / Kavität gegeben. Inkubation erfolgt bei 37 C, 1 h. 8) Überschüssige mak werden durch Waschen (3x) entfernt. 9) POX konjugierter anti-maus IgG2a Antikörper wird 1:1000 mit Antikörperpuffer verdünnt und jeweils 100 µl / Kavität gegeben. Inkubation erfolgt bei 37 C, 1 h. 10) Überschüssige Antikörper werden durch Waschen (3x) entfernt. 11) 10 mg OPD werden in 10 ml Citrat-Puffer und 8 µl H 2 O 2 gelöst und jeweils 100 µl / Kavität aufgetragen. Inkubation erfolgt bei RT im Dunkeln, 15 min. 12) Die Reaktion wird mit 50 µl / Kavität 3 M H 2 SO 4 gestoppt und der Substratumsatz bei 490 nm photometrisch gemessen. Es wird definiert, daß eine relative Unit dem OD-Wert von 10 6 RAJI Zell-Lysat entspricht. B Referenzen 1. van Rood JJ, van Leeuwen A, van Santen MCT. Anti HL-A2 inhibitor in normal human serum. Nature 1970: 226: Charlton RK, Zmijewski CM. Soluble HL-A7 antigen: location in the ß-lipoprotein fraction of human serum. Science 1970: 170: Güssow D, Ploegh H. Soluble class I antigens: a conundrum with no solution? Immunol Today 1987: 8: Tilg H, Westhoff U, Vogel W, et al. Soluble HLA class I serum concentrations increase with transplant-related complications after liver transplantation. J Hepat 1992: 14: Nicolle MW, Nag B, Sharma SD, et al. Specific tolerance to an acetylcholine receptor epitope induced in vitro in Myastenia gravis CD4 + Lymphocytes by soluble major histocompatibility complex class II -peptide complexes. J Clin Invest 1994: 93: Zavazava N, Westphal E, Müller-Ruchholtz W. Characterisation of soluble HLA molecules in sweat and quantitative HLA differences in serum of healthy individuals., J of Immunogenet 1991: 17: Rebmann V, Grosse-Wilde H. Biochemical Analysis of soluble invariant chain (scd74) and their complex formation with shla-dr. Eur J Immunogenet 1995: 22: Pouletty P, Ferrone S, Amesland F. et al. Summary report from the first international workshop on soluble HLA antigens. Paris, August Tissue Antigens 1993: 42: DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998