Wahlpraktikum. Wirkung von Enzymen aus Schlangengift auf Zellmembranen

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1 Wahlpraktikum Wirkung von Enzymen aus Schlangengift auf Zellmembranen Voraussetzungen für Praktikum Anmeldung bei der Studienplanung Absolvierung des 1. Blockes im 1. Semester (Grundlagen über Membranen) Einleitung Schlangengifte sind komplexe Gemische von verschiedenen Proteinen und Oligopeptiden, die teils als Enzyme, teils als Enzyminhibitoren und teils als blockierende Liganden lebenswichtige Strukturen im Beuteorganismus schädigen. Die wichtigsten Angriffspunkte von Schlangengiften sind Zellmembranen, Proteine und Polysaccharide der Gefässwand und des Bindegewebes, sowie Plasmaproteine, die am Hämostase-, Fibrinolyse- oder Komplementsystem beteiligt sind. Einige isolierte Schlangengiftproteine mit bekannter Wirkungsweise haben als pharmazeutische Wirkstoffe, als diagnostische Reagenzien oder als präparative Hilfsmittel praktische Anwendungen in der Medizin (siehe Ref. 1). Grundsätzlich wird zwischen zwei Typen von Schlangengiften unterschieden: neurotoxische Gifte hämozytotoxische Gifte Viele Gifte enthalten mehrere Komponenten, die zudem sowohl neurotoxisch wie auch hämozytotoxisch wirken können. Problemstellung Wir haben ein Enzym isoliert aus dem Gift von Naja mossambica mossambica. Versuchen Sie mittels einfacher Experimente herauszufinden, um welche Art von Enzym es sich dabei handelt. Aufgabe 1 Einige hämozytotoxische Gifte zeigen eine schädigende Wirkung auf die Integrität von Zellmembranen und führen so zur Zerstörung (Lyse) von Zellen. Sie studieren deshalb eine mögliche hämozytotoxische Wirkung des isolierten Enzyms an folgendem Modellsystem: Sie geben eine bestimmte Menge des Enzyms zu isolierten menschlichen Erythrozyten und bestimmen die Lyse der Zellen in Abhängigkeit der Inkubationszeit. Die Zelllyse bei Erythrozyten bezeichnet man als Hämolyse. Sie lässt sich einfach bestimmen, indem man - mittels eines Photometers - den Austritt von Hämoglobin aus den Erythrozyten in den zellfreien Ueberstand nach Zentrifugation misst. Seite 1

2 Vorgehen 1 Bereiten Sie folgende Suspensionen vor (in Reagensgläser pipettieren): Erythrozyten Puffer Wasser A 1 ml 9 ml - B 1 ml 9 ml - C 1 ml - 9 ml Vergleichen Sie das Aussehen der Suspensionen A, B und C. In den Reagensgläsern A und B sind die Erythrozyten intakt geblieben, die rote Lösung ist trüb. Im Reagensglas C ist die Lösung weniger trüb aber dafür deutlicher rot gefärbt: Eine Vielzahl von Zellen ist geplatzt (lysiert) und dabei ist Hämoglobin ausgetreten. Frage 1a: Was muss wohl im Puffer enthalten sein, dass die Erythrozyten in den Reagensgläsern A und B nicht lysieren? Stellen Sie nun die Reagensgläser A und B in ein Wasserbad bei 37 C. Nach 5 min geben Sie 30 units des isolierten Enzyms zu Reagensglas A und lassen die Suspensionen unter leichtem Schütteln inkubieren. Nach t = 0, 30, 60, 90 min entnehmen Sie den Reagensgläsern A und B je 1.3 ml (2 x 650 µl) Suspension und pelletieren die Erythrozyten mittels Zentrifugation (5 min, x g). Anschliessend entnehmen Sie 0.8 ml der jeweiligen Überstände und messen die Absorptionen im Photometer bei 615 nm. Die zum Teil lysierten Erythrozyten im Reagensglas C verwenden Sie zum Aufstellen einer Eichkurve, die dann zur Bestimmung einer allfälligen Lyse der Erythrozyten (Hämolyse) in den Reagensgläsern A und B verwendet wird. Dazu verdünnen Sie die Lösung C mit Wasser nach folgendem Schema (im Doppel ausführen; direkt in Küvetten pipettieren): Hämolyse (%) Verdünnte Wasser (ml) Lösung C (ml) Messen Sie die Absorptionen dieser Lösungen im Photometer bei einer Wellenlänge von 615 nm gegen Wasser und erstellen Sie eine Eichkurve (% Hämolyse versus Absorption). Frage 1b: Was beobachten Sie? Bestimmen Sie das Ausmass der Hämolyse in den beiden Reagensgläsern. Seite 2

3 Aufgabe 2 Der obige Versuch zeigt Ihnen, dass die Aktivität des isolierten Enzyms zu einer Schädigung der Zellintegrität von Erythrozyten und damit zur Hämolyse geführt hat. Sie ziehen nun folgende Enzyme in Betracht, die für diesen Effekt verantwortlich sein könnten: eine Protease eine Glycosidase eine Phospholipase Frage 2a: Informieren Sie sich aus der Literatur, welche Reaktionen die oben genannten Enzyme durchführen. Frage 2b: Diskutieren Sie, welche Effekte diese Enzyme auf Erythrozyten haben könnten? Könnten diese Veränderungen ausreichen, um eine Zelllyse zu bewirken? Sie bestimmen nun experimentell, um welche Art von Enzym es sich beim Präparat handeln könnte. Aufgabe 3 Veränderungen in der Proteinzusammensetzung (Grösse und Kohlenhydratdekorationen) können mittels SDS-Polyacrylamidegel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert werden. Frage 3a: Informieren Sie sich aus der Literatur, auf welchen Prinzipien diese Methode beruht. Vorgehen 3 Zur Analyse der Proteinzusammensetzung der Erythrozytenmembran werden zuerst sogenannte 'Ghosts' präpariert. Dazu werden die Erythrozyten aus den Reagensgläsern A und B nach der 90-minütigen Inkubation in einem hypotonen Puffer bei 4 C komplett lysiert. Die aufgebrochenen Erythrozyten werden anschliessend zentrifugiert und solange mit dem hypotonen Puffer gewaschen, bis dass das ausgetretene Hämoglobin vollständig entfernt und das resultierende Membranpräparat farblos (oder höchstens noch leicht rosa gefärbt) ist. Frage 3b: Weshalb werden zur Analyse der Proteine der Erythrozytenmembran zuerst 'Ghosts' hergestellt und nicht gleich ganze Erythrozyten verwendet? Die Proteinkonzentration in den Ghost-Präparationen wird bestimmt. Anschliessend werden die einzelnen Proben auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen (pro Bahn 50 µg Protein). Zusätzlich wird eine Ghostpräparation nach Behandlung mit einer bekannten Protease (Trypsin) aufgetragen. Seite 3

4 Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgt dann während 16 h bei einer konstanten Spannung von 70 V. Anschliessend werden die Proteine im Gel mit einem unspezifischen Farbstoff (Coomassie blue) sichtbar gemacht. In einem zweiten SDS-Polyacrylamidgel analysieren Sie mögliche Veränderungen in der Kohlenhydratdekoration der Proteine. Dazu tragen Sie die selben Proben wie oben auf (pro Bahn wiederum 50 µg). Zusätzlich wird eine Probe nach Behandlung mit einer bekannten Glycosidase (Endoglycosidase F; Endo F) aufgetragen. Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine (s. oben) werden die Glycoproteine mit einer Kohlenhydrat-spezifischen Färbemethode sichtbar gemacht. Resultate: siehe File SDS-PAGE. Frage 3c: Welche Unterschiede zwischen den einzelnen Bahnen erkennen Sie? Interpretieren Sie den Befund. Eine schematische Darstellung einer SDS-PAGE von Erythrozytenmembranproteinen sowie des Aufbaus der Erythrozytenmembran finden Sie im File Figuren Ery. Aufgabe 4 Veränderungen in der Lipidzusammensetzung können mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert werden. Frage 4a: Informieren Sie sich aus der Literatur, auf welchen Prinzipien diese Methode beruht. Vorgehen 4 Um die Lipidzusammensetzung der Erythrozytenmembran zu studieren, extrahiert man die gesamten Lipide von Erythrozyten mit organischen Lösungsmitteln und trennt die einzelnen Komponenten (Phospholipide, Fettsäuren, Cholesterin, Glycolipide) anschliessend mittels TLC in speziell zusammengesetzten Lösungsmittelgemischen. Da wir in unserem Enzympräparat eine Phospholipase vermuten, wird ein System gewählt, dass sich für die Analyse der verschiedenen Phospholipidklassen eignet. Seite 4

5 Lipid-Extraktion 2 x 630 µl ml Erythrozytensuspension A und B in Reagenzgläser pipettieren Zentrifugation (7 min; rpm); Überstände möglichst quantitativ abnehmen und verwerfen Zugabe von 125 µl H 2 O dest zu Pellets A und B; gut mischen (Vortex); 15 min bei RT stehen lassen Unter ständigem mischen langsame Zugabe von 2 x 700 µl kaltem Isopropanol (2-Propanol) Für 60 min auf Eis stehen lassen; ca. alle 10 min gut mischen Unter ständigem mischen langsame Zugabe von 2 x 450 µl Chloroform (CHCl 3 ) Für 60 min bei RT stehen lassen; ca. alle 10 min gut mischen Zentrifugation (15 min; rpm); Überstände (ca. 2 ml extrahierte Lipide) vorsichtig abpipettieren und unter Stickstoff eindampfen Lipidextrakt in 50 µl CHCl 3 :Methanol (2:1) aufnehmen; bei -20 C aufbewahren Die extrahierten Lipide werden nun mittels TLC in die verschiedenen Phospholipidklassen und eine Neutrallipid-Fraktion aufgetrennt. Dazu tragen Sie die Extrakte nach einem vorgegebenen Schema mit einer feinen Glaspipette auf eine 20 cm x 20 cm Silica Gel TLC Platte. Daneben werden reine Phospholipide als Standards aufgetragen (je 50 nmol). PC: Phosphatidylcholin PE: Phosphatidyläthanolamin PS: Phosphatidylserin Sph: Sphingomyelin LPC: Lysophosphatidylcholin LPE: Lysophosphatidyläthanolamin Chol: Cholesterin PC PE PS Sph A B LPC LPE Chol Seite 5

6 Präparation des Laufmittels zum Entwickeln des Chromatogramms: CHCl 3 50 ml Methanol 25 ml Essigsäure 8 ml 0.9% NaCl 2.5 ml Geben Sie dann das Laufmittel in einen Glastank, der mit Filterpapier ausgekleidet ist, und lassen Sie das System für 15 min äquilibrieren. Anschliessend stellen Sie die TLC Platte in den Tank und lassen das Chromatogramm entwickeln, bis die Lösungsmittelfront ca. 1 cm vom oberen Rand der Platte entfernt ist (Dauer ca. 100 min). Entfernen Sie die Platte aus dem Tank und stellen Sie sie in eine Kapelle zum Abdampfen der Lösungsmittel (ev. mit kaltem Luftstrom nachhelfen; Föhn). Die aufgetrennten Lipidklassen werden nun mittels Jodfärbung sichtbar gemacht: Stellen Sie die Platte in eine mit Joddampf gesättigte Glaskammer (Handschuhe tragen!) und warten Sie, bis die Lipide sichtbar werden. Nehmen Sie die Platte heraus und markieren Sie die Flecken mit einem stumpfen Bleistift; belassen Sie dabei die Platte im Abzug (Joddämpfe sind giftig!). Frage 4b: Informieren Sie sich aus der Literatur, auf welchem Prinzip die Färbemethode beruht. Frage 4c: Ordnen Sie die Flecken den entsprechenden Lipidklassen (Standards) zu. Vergleichen Sie die Lipidzusammensetzung der Extrakte aus Reagensgläsern A und B. Interpretieren Sie das Resultat. Aufgabe 5 Versuchen Sie nun aufgrund der gemachten Beobachtungen eine möglichst präzise Angabe über das isolierte Enzym aus Schlangengift zu machen. Welche Reaktion(en) katalysiert es? Gibt es verwandte Enzyme, die auf ähnliche Substrate wirken? Wo kommt das Enzym natürlicherweise sonst noch vor? Wie kann es biologische Membranen zerstören? Seite 6