Thema 12: RNA Structure Prediction

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1 Thema 12: RNA Structure Prediction Vortrag gehalten von Tobias Sander am Einleitung 1.1 Vorwort Seit der Strukturaufklärung der DNA im Jahre 1953 durch Watson und Crick sind fast 60 Jahre vergangen und weitere Entdeckungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie haben das Wissen in Bezug auf Funktion und Vorkommen der Nukleinsäuren von Grund auf erweitert. Ein Forschungsbereich der Molekularbiologie, der seinen Kinderschuhen entwachsen ist und in den letzten Jahren interdisziplinär auch andere Forschungsgebiete wie die Bioinformatik erobert hat, ist die Erforschung der verschiedenen Ribonukleinsäuren. Unterschiedliche RNA-Moleküle besitzen unterschiedliche Funktionen. So werden z.b. mit Hilfe von mrna's genetische Informationen als Kopien der DNA durch die Zellkernmembran zu den Ribosomen transportiert. trna's werden als Hilfsmoleküle bei der Proteinbiosynthese verwendet, rrna's beteiligen sich am Aufbau der Ribosomen und mirna's steuern die Genregulation und Expression[1]. Ein weiteres Forschungsgebiet der Molekularbiologie und Bioinformatik bezieht sich auf die Vorhersage der Faltung von RNA, der auch diese Ausarbeitung gewidmet ist. Im folgenden Abschnitt wird auf den biologischen Hintergrund der RNA Structure Prediction eingegangen. Im Hauptteil werden die dafür verwendeten Modelle und Algorithmen vorgestellt und erläutert und anschlieÿend, in der Zusammenfassung, die Ergebnisse komprimiert dargestellt. 1.2 Biologischer Hintergrund Wie der Titel RNA Structure Prediction schon andeutet, handelt es sich bei diesem Seminar um die Sekundärstrukturvorhersage von RNA-Molekülen. RNA-Moleküle können im Gegensatz zu DNA-Molekülen eine aktive, katalytische Rolle als Enzym im Organismus übernehmen[2], wohingegen DNA-Moleküle passiv als Informationsspeicher im Organismus vorhanden sind. Deshalb spielt die Faltung der RNA in unterschiedliche Konformationen für das Leben eine entscheidende Rolle. Zum Beispiel ist die Faltung in eine Kleeblattstruktur (engl. cloverleaf-structure) typisch für trna, die als Zwischenstufe bedeutsam für den Ablauf der Translation innerhalb der Ribosomen ist. Die Faltung der Einzelstrang-RNA (engl. single-stranded RNA) wird maÿgeblich durch die Basenpaarungen Adenin-Uracil (A-U) und Cytosin-Guanin (C-G) beeinusst. Daher stellen Basenpaarungen die Grundlage der Sekundärstruktur der RNA dar. Die Paare werden durch Wasserstobrückenbindungen zusammengehalten und es entstehen stabile Formen, die sich Watson-Crick-Paare (engl. Watson-Crick-Pairs) nennen. Aufgrund der Faltung der Einzelstrang-DNA in eine dreidimensionale Konformation (Tertiärstruktur), ergeben sich, ähnlich wie bei den Proteinen, Domänen mit charakteristischen strukturellen Elementen (siehe Abbildung 1). Diese Domänen bilden gegebenfalls aktive Zentren, die enzymatische Funktionen ermöglichen. 1

2 Abbildung 1: Schematische Darstellungen von Substrukturen. 2 Algorithmen der RNA Structure Prediction 2.1 Mathematische Denitionen Um dem Leser ein besseres Verständnis der Problematik zu vermitteln, werden zu Beginn einige Denitionen über vorkommende Strukturen und Substrukturen eingeführt: Denition 1 Eine RNA-Sequenz S[1... n] stellt eine Folge von Basen dar, wobei S[k] {U, A, C, G}. Denition 2 Eine Struktur R = {(i, j) 1 i < j n und (i, j)watson-crick-paar} ist eine mathematische Darstellung von Basenpaaren, und für alle (i, j), (i, j ) R gelte i = i j = j. Des Weiteren gelte für die Distanz zweier Basen (i, j) R : j i 2. (i, j) wird als Watson-Crick-Paar bezeichnet, wenn folgende Eigenschaft erfüllt ist: (i, j) {(U, A), (A, U), (C, G), (G, C)}. Denition 3 R* ist eine pseudoknotenfreie Struktur, wenn folgende Eigenschaft erfüllt ist: Es existieren keine Paare (i, j), (k, l) R für die gilt: i < k < j < l. Denition 4 Ein Basenpaar (i, j) R ist ein abschlieÿendes Basenpaar, d.h ein Basenpaar mit Distanz d = max{j i} für alle (i, j) R. (i, j ) ist ein inneres Basenpaar, wenn i < i < j < j und (i, j ) R. Denition 5 Es werden fünf mögliche Substrukturen in einer RNA-Sekundärstruktur wie folgt deniert: (mit loop bezeichnen wir eine Substruktur) Ein loop mit (i, j) R und einem {(i, j ) = (i + 1, j 1)} R wird als stem oder stacked pair bezeichnet. Ein loop mit (i, j) R und (i, j ) / R wird als hairpin loop bezeichnet. Ein loop mit (i, j) R und einem (i, j ) R mit ((i i) + (j j )) > 2 wird als interior loop bezeichnet. Ein interior loop wird als bulge loop bezeichnet, falls j = j 1 oder i = i + 1. Ein loop mit inneren Basenpaaren [(i 1, j 1 )... (i k, j k )] R und (i, j) R wird als k-multiloop bezeichnet. 2

3 Abbildung 2: Einfache schematische Darstellung eines Pseudoknotens. 2.2 Pseudoknoten Werden bei der Vorhersage der RNA-Sekundärstruktur anspruchsvollere Motive wie Pseudoknoten, die in der Natur eine bedeutende Rolle spielen, zugelassen, so verkomplizieren sie die Aufgabe der algorithmischen Vorhersage deutlich. Daher werden Pseudoknoten erst bei der Berechnung einer Tertiärstruktur mit einbezogen. Im vorherigen Abschnitt wurde in Denition 3 die pseudoknotenfreie Struktur R eingeführt. Durch Umkehrung dieser Denition erhält man die pseudoknotenbehaftete Struktur R + (Abbildung 2). R besteht aus verschachtelten und nebeneinander liegenden Elementen, besitzt aber keine überlappenden Strukturen, wie sie in R + zu nden sind. Wenn man Strukturen wie R + bei der Vorhersage vernachlässigt, so ist es möglich, mit Hilfe der in Abschnitt 2.3 vorgestellten Modelle, das Problem der Sekundärstrukturvorhersage in polynomieller Zeit O(n d ) zu lösen. 2.3 Modelle und Algorithmen der RNA Structure Prediction Es werden zwei Modelle und deren Algorithmen zur Sekundärstrukturvorhersage beschrieben. Um eine optimale Lösung zu nden, wird bei beiden Algorithmen dynamische Programmierung als globale Optimierungsstrategie verwendet Maximierung der Basenpaare Ziel des Modells ist es, eine Struktur R über eine gegebene RNA-Sequenz S zu berechnen, die die Anzahl der möglichen Basenpaare innerhalb der Struktur maximiert Charakterisierung der optimalen Teilstruktur Die Charakterisierung der optimalen Teilstruktur stellt den ersten Schritt der dynamischen Programmierung und damit den ersten Schritt der Lösung des Problems dar. Sei β(1, n) die maximale Anzahl von Basenpaaren einer Basenfolge S[1... n]. Ausgehend von einer optimalen Teillösung für eine zuvor berechnete, kleinere Teilstruktur, versucht man nun, die optimale Teillösung β(i, j) für die Teilstruktur S[i... j] zu berechnen. Dabei wird bewusst das Bellman-Prinzip angewendet, das besagt, dass sich eine optimale Lösung aus optimalen Teillösungen zusammensetzen lässt Rekursive Lösung und Bellman-Prinzip Zur Berechnung von β(i, j) wird pro Berechnungsschritt das Maximum aus Einem von vier Fällen ausgewählt und in einer Tabelle gespeichert (top-down-ansatz + Memoisierung). Die vier unterschiedlichen Fälle ergeben sich zu: 3

4 1. Es wird eine ungepaarte Base i zur bereits berechneten optimalen Teilstruktur S[i j] hinzugefügt. Dadurch ergibt sich β(i, j) = β(i + 1, j). Dies entspricht einem vertikalen Schritt von unten nach oben in der Wertetabelle. Am Wert von β ändert sich dabei nichts. 2. Es wird eine ungepaarte Base j zur bereits berechneten optimalen Teilstruktur S[i... j 1] hinzugefügt. Dadurch ergibt sich β(i, j) = β(i, j 1). Dies entspricht einem horizontalen Schritt von links nach rechts in der Wertetabelle. Wie in Fall 1 ändert sich auch hier nichts am Wert von β. 3. Es wird ein Basenpaar (i, j) zur bereits berechneten optimalen Teilstruktur S[i j 1] hinzugefügt. Dadurch ergibt sich β(i, j) = β(i + 1, j 1) + δ(i, j). Dies entspricht einem inklinierten Schritt von links-unten nach rechts-oben in der Wertetabelle. δ wird in diesem Fall als Score bezeichnet. Falls das Basenpaar (i, j) einem Watson-Crick-Paar entspricht und konstante Werte betrachtet werden, so erhält δ den Wert +1. Falls nicht, erhält δ den Wert 0, und der Wert von β ändert sich nicht. Des Weiteren besteht an dieser Stelle die Möglichkeit, den Algorithmus zu verfeinern, indem man die jeweilige freie Energie der Bindungspaare betrachtet und für den Score verwendet (siehe Abschnitt 2.3.2). 4. Es werden zwei optimale Teilstrukturen S 1 [i... k] und S 2 [k+1... j] zu einer grösseren optimalen Teilstruktur S[i... j] zusammengefasst. Dadurch ergibt sich β(i, j) = max k,i<k<j {β(i, k) + β(k + 1, j)}. Dieser Schritt muss für alle k Teilstrukturen (i < k < j) durchgeführt werden, damit man sicher gehen kann, dass jede mögliche Bifurkation berücksichtigt worden ist Zusammenfassung Der zuvor beschriebene Algorithmus wurde 1978 von Nussinov entdeckt. Zuerst ndet eine Initialisierung statt. Man setzt β(i, i) = 0 für alle i = 1... n und β(i, i 1) = 0 für alle i = 2... n. Das bedeutet, dass jede Substruktur S[i, i] der Länge 1 und jede Substruktur S[i, i 1] der Länge 0 maximal 0 Basenpaare enthält. Danach wird die Wertetabelle (Matrix) entsprechend dem Algorithmus diagonal ausgefüllt. Der Wert an der Stelle (1, n) liefert das Ergebnis. Anschlieÿend wird durch ein Traceback die optimale Sekundärstruktur ermittelt. Da die Tabelle symmetrisch ist, wird entweder nur der obere Teil oder der untere Teil ausgefüllt. Der Algorithmus berechnet Werte in der oberen Hälfte der Tabelle (n n - Matrix), wofür er O(n 2 ) Schritte benötigt. Die Berechung der Werte der Fälle 1 bis 3 erfordert jeweils nur konstanten Aufwand, wohingegen bei Fall 4 bis zu n verschiedene Möglichkeiten für den Parameter k betrachtet werden müssen. Das ergibt einen zeitlichen Aufwand von O(n) und daher beläuft sich die maximale Laufzeit des Algorithmus auf O(n 3 ). Nussinov's Algorithmus berücksichtigt nicht den Einuss von Substrukturen auf die Sekundärstruktur und da in der Natur nicht unbedingt RNA-Strukturen 4

5 mit maximaler Basenpaarung vorkommen[3], wird der native Algorithmus in der Praxis zur Strukturvorhersage nicht eingesetzt. Man verwendet stattdessen ein Modell, das auch thermodynamische Bedingungen der Faltungen mit einbezieht. Dieses Modell wird im folgenden Abschnitt erläutert Minimierung der freien Energie Ziel des Modells ist es, eine Struktur R über eine gegebene RNA-Sequenz S zu berechnen, die die freie Energie innerhalb der Struktur R minimiert. Der Ausdruck freie Energie bezieht sich hier auf das Potential des Moleküls, durch Bindungen weitere Energie freizusetzen[4]. Wie in Schritt 3 in Abschnitt schon angedeutet, kann der Algorithmus von Nussinov verfeinert werden, indem man anstelle eines konstanten Scores die jeweilige freie Energie des Bindungspaares verwendet. Die freie Energie ist in diesem Fall negativ, was zu einer Minimierung der globalen freien Energie innerhalb der betrachteten Struktur führt. Die in den Abschnitten und beschriebenen Lösungsansätze der dynamischen Programmierung behalten auch bei diesem Modell ihre Gültigkeit Substrukturen und Energiefunktionen Da sich unterschiedliche Substrukturen (siehe Abbildung 1) unterschiedlich auf die globale Verteilung der freien Energie innerhalb der Sekundärstruktur auswirken, ist es für den folgenden Algorithmus von Bedeutung, die Substrukturen formal (siehe Denition 5) zu denieren. Als vielversprechende Möglichkeit bietet sich dafür die Betrachtung von loops und deren abschlieÿende Basenpaare (engl. closing base pairs, siehe Denition 4) an. Allgemein lässt sich sagen, dass sich stems oder stacked pairs stabilisierend auf die Struktur des Moleküls auswirken, loops hingegen destabilisierend. Um jeder Substruktur einen entsprechenden Energiebetrag zuordnen zu können, werden folgende Energiefunktionen eingeführt: es(i, j, i + 1, j 1) stellt die negative Energie eines stems (stacked pair) dar. eh(i, j) stellt die positive Energie eines hairpin-loops dar. el(i, j, i, j ) stellt die positive Energie eines interior- oder bulge-loops dar. em(i, i 1, j 1,..., i k, j k, j) stellt die positive Energie eines k-multiloops dar. Alle Energiefunktionen hängen somit vom abschliessenden Basenpaar (i, j) R und dem/den inneren Basenpaar/en (i k, j k ) R ab Der Algorithmus von Zuker Die Idee des nun folgenden Algorithmus besteht darin, die freien Energien der einzelnen Substrukturen E R i,j für alle (i, j) R zu betrachten und aus der Summe dieser Energien die gesamte freie Energie der RNA-Struktur E ges (R) zu berechnen. Es werden für die Basisrekursion drei weitere Funktionen benötigt, die an aktueller Position die aktuelle freie Energie der Substrukur bestimmen. Um aufeinander folgende Strukturen zu berücksichtigen, wird die Funktion ɛ(i) eingeführt, die die minimale freie Energie der Substruktur S[1... i] berechnet. Entweder wird eine ungepaarte Base i zur bestmöglichen kleineren Substruktur S[1... i 1] durch ɛ(i) = ɛ(i 1) hinzugefügt, oder die freie Energie der Bifurkation der bestmöglichen kleineren Substrukturen S[1... k 1] und S[k... i] durch 5

6 ɛ(i) = min 1 k i {ɛ(k 1) + π(k, i)} addiert. Die Funktion π(i, j) berechnet rekursiv die minimale freie Energie der Substruktur S[i... j]. Entsprechend der unterschiedlichen Substrukturen und Energiefunktionen wird pro Berechnungsschritt das Minimum aus vier unterschiedlichen Fällen ausgewählt, wobei (i, j) R immer das aktuelle, die Substruktur S[i... j] abschlieÿende Basenpaar darstellt: 1. (i, j) schliesst einen stem ab. Es wird die stabilisierende Energie es(i, j, i + 1, j 1) und die minimale freie Energie der kleineren Substruktur S[i+1... j+1] hinzugefügt. Dadurch ergibt sich π(i, j) = es(i, j, i + 1, j 1) + π(i + 1, j 1). 2. (i, j) schliesst einen hairpin-loop ab. Es wird die destabilisierende Energie eh(i, j) hinzugefügt. Dadurch ergibt sich π(i, j) = eh(i, j). 3. (i, j) schliesst ein bulge- oder interior-loop ab. Es wird die destabilisierende Energie el(i, j, i, j ) und die minimale freie Energie der kleineren Substruktur S[i... j ] hinzugefügt. Dadurch ergibt sich π(i, j) = min {el(i, j, i<i <j <j i, j ) + π(i, j )}. 4. (i, j) schliesst ein multiloop ab. Das multiloop wird in zwei kleinere Subsequenzen S[i k 1] und S[k... j 1] unterteilt und ein gap-penalty a hinzugefügt. Dadurch ergibt sich π(i, j) = min {µ(i + 1, k 1) + µ(k, j 1) + a}. i+1<k j 1 Um eine multiloop-substruktur mit minimaler freier Energie zu nden, wird im vierten Fall die Funktion µ verwendet. Diese Funktion spaltet S[i... j] daher rekursiv bis zum inneren Basenpaar auf, indem entweder ein Basenshift µ(i, j) = µ(i + 1, j) + c (analog am anderen Ende der Substruktur µ(i, j) = µ(i, j 1)+c) durchgeführt oder eine Bifurcation min i<k j {µ(i, k 1) + µ(k, j)} hinzugefügt wird. Sollte ein inneres Basenpaar gefunden werden, das eine multiloop-struktur mit minimaler freier Energie abschlieÿt, so ergibt sich µ(i, j) = π(i, j) + b. Gap-penalty c wird für die Addition einer ungepaarten Base hinzugefügt, b entspricht der freien Energie des abschlieÿenden Basenpaares. Auch hier wird pro rekursivem Aufruf jeweils das Minimum ausgewählt Zusammenfassung Der zuvor beschriebene Algorithmus wurde 1981 von Zuker veröentlicht. Wie bei Nussinov ndet zuerst eine Initialisierung π(i, i 1) = π(i, i) =, µ(i, i) = und ɛ(0) = 0 statt. Anschlieÿend werden, entsprechend der dargestellten Funktionen, ein Array und zwei Matrizen ausgefüllt. Nachdem alle Einträge berechnet wurden, enthält ɛ die minimale freie Energie der RNA-Struktur S[1... n]. Das Ausfüllen der Matrizen verläuft wie bei Nussinov diagonal und abschlieÿend wird die optimale Sekundärstruktur durch ein Traceback ermittelt. Um eine exponentielle Laufzeit zu vermeiden, wird ebenfalls ein top-down-ansatz für die Implementierung gewählt. Daher können die Matrizen der Funktionen π und µ sowie das Array ɛ in O(n 2 ) berechnet werden. Da allerdings pro Eintrag (Matrizen und Array) über O(n) Möglichkeiten optimiert werden muss, beläuft sich die Laufzeit des Algorithmus von Zuker zur RNA-Sekundärstrukturvorhersage auf O(n 3 ). 6

7 3 Zusammenfassung und Ausblick In dieser Ausarbeitung wurden zwei Methoden und Algorithmen zur RNA Sekundärstrukturvorhersage vorgestellt und erläutert. Nussinov's Methode beschäftigt sich mit der Maximierung der Basenpaare, um eine optimale Sekundärstruktur zu ermitteln. Im Gegensatz dazu versucht Zuker, mit Hilfe eines thermodynamischen Ansatzes, die freie Energie innerhalb eines RNA-Moleküls zu minimieren und dadurch eine optimale Sekundärstruktur zu bestimmen. Durch Verwendung des thermodynamischen Ansatzes ist die Methode von Zucker deutlich exakter und realitätsnaher als die Methode von Nussinov. Die webbasierte Anwendung mfold implementiert eine Variante des Algorithmus von Zuker mit vielen Einstellungsmöglichkeiten und ist kostenlos im Internet verfügbar[5]. Alles in allem ist die Strukturvorhersage von Biomolekülen (RNA und Proteine) eine junge Wissenschaft, und wird auch weiterhin Generationen von Wissenschaftlern zum Nachdenken anregen. 7

8 Literatur [1] Wikipedia, Ribonukleinsäure, Wikipedia - die freie Enzyklopädie, akutalisiert am , zugegrien am [2] V. Sperschneider: Bioinformatics Problem Solving Paradigms, Springer-Verlag, 2008, Abschnitt 1.7 [3] Wikipedia, Nussinov-Algorithmus, Wikipedia - die freie Enzyklopädie, akutalisiert am , zugegrien am [4] H.-J. Böckenhauer, D. Bongartz: Algorithmische Grundlagen der Bioinformarmatik Modelle, Methoden und Komplexität, Teubner-Verlag, 2003, Abschnitt 12.1 [5] Zuker and Turner, RNA folding form, The Rensselaer bioinformatics web server, aktualisiert am , zugegrien am