Studying Invisible Excited Protein States in Slow Exchange with a Major State Conformation

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Julian Siegel
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1 Studying Invisible Excited Protein States in Slow Exchange with a Major State Conformation JACS 2012 Pramodh Vallurupalli, Guillaume Bouvignies, and Lewis E. Kay MR-Seminar Nina Kubatova

2 Inhaltverzeichnis 1. Einführung 2. Grundlagen 2.1. Austauschprozesse 2.2. CPMG-Experiment 2.3. CPMG- vs. CEST-Experiment N-CEST-Pulssequenz 2.5. Eliminierung der 1H-Entkopplungsartifakten 3. Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP11 4. Zusammenfassung 5. Literatur

3 Einführung 3 Proteine: Haupt- und Nebenkonformationen Kinetik und Thermodynamik der Austauschprozessen Ziel: Detektion der Konformationen mit kurzer Lebensdauer und geringer Population Methode: - CPMG Relaxation-Dispersion-Experiment Grenzen: Austauschrate zwischen 200 s -1 und 2000 s -1 und fraktionelle Population der Nebenkonformation Minimum 0,5% - Magnetisierungsaustauschbasierte Experimente Austauschrate weniger als 100 s -1 CEST-basierte Experimente

4 Austauschprozesse 4 A k AB k AB B langsamer Austausch: k AB < Δω intermediär Austausch: k AB Δω schneller Austausch: k AB > Δω schneller Austausch: Abbildung 1: schneller Austausch. Die Abbildung ist aus Gordon S. Rule and T. Kevin Hitchens. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy; Springer, übernommen.

5 Austauschprozesse 5 A k AB k AB B langsamer Austausch: k AB < Δω intermediär Austausch: k AB Δω schneller Austausch: k AB > Δω langsamer Austausch: Abbildung 2: langsamer Austausch. Die Abbildung ist aus Gordon S. Rule and T. Kevin Hitchens. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy; Springer, übernommen.

6 CPMG-Experiment 6 Abbildung 3: CPMG-Experiment. Die Abbildung ist aus Gordon S. Rule and T. Kevin Hitchens. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy; Springer, übernommen.

7 CPMG-Experiment 7 langsamer Austausch τ cp vs T 2 schneller Austausch τ cp < 1 ms Heizprobleme Abbildung 4: CPMG-Experiment. Die Abbildung ist aus Gordon S. Rule and T. Kevin Hitchens. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy; Springer, übernommen.

8 CPMG vs CEST G k GE E k EG 8 Abbildung 5: Vergleich von CPMG- und CEST-Experimenten. Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

9 15 N-CEST-Pulssequenz 9 Gradient-coherence-selected, enhanced-sensitivity-based pulse scheme refocused INEPT Ω N Back-INEPT 1 H-Entkopplung : ν 1 < 1 J HN Artefakte Abbildung 6: 15 N-CEST-Pulssequenz. Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

10 Eliminierung der 1 H-Entkopplungsartifakten 10 HSQC-Spektrum von Protein L (63 AS) Abbildung 7: HSQC-Spektrum von Protein L (63 AS). Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

11 Eliminierung der 1 H-Entkopplungsartifakten 11 WALTZ x 240 y 90 x 90 x 180 y 270 x Abbildung 8: Eliminierung der 1 H-Entkopplungsartifakten. Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

12 Validierung der Methode 12 Austauschsystem: Protein - Abp1p SH3 Domäne, Ligand - Ark1p Peptid Abp1p Regulierung von Zytoskelett bei Pilzen, Fliegen und Saugetieren N-Terminus ADF-H Domäne Prolin-Region (PRR) C-Terminus SH3 Domäne Protein-Protein-Wechselwirkungen L: 5-10% PL unsichtbar Abp1p SH3 Domäne Abbildung 9: x-ray structure von Abp1p SH3 Domäne. Die Abbildung ist aus Vallurupalli et al übernommen.

13 Validierung der Methode 13 HSQC-Spektrum von Protein-Ligand-System Protein: Abp1p SH3 Domäne Ligand: Ark1p Peptid Abp1p SH3 Domäne Abp1p SH3 Domäne Abbildung 9: x-ray structure von Abp1p SH3 Domäne. Die Abbildung ist aus Vallurupalli et al übernommen. Abbildung 10: HSQC-Spektrum Abp1p SH3 - Ark1p System. Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

14 Validierung der Methode 14 AS 15 AS 34 52,6 Hz 52,6 Hz 26,6 Hz 26,6 Hz 12,8 Hz 12,8 Hz Abbildung 11: Intensitätsprofile der Aminosäure von Abp1p SH3 Domäne. Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

15 Validierung der Methode 15 Abbildung 12: Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP11 16 71 AS α-helix (H1): AS 14-28 Loop I: AS 29-35 α-helix (H2): AS 36-44 Loop II: AS 45-47 3 10 -Helix (H3): AS 48-50 Loop III: AS 51-54 α-helix

16 Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP AS α-helix (H1): AS Loop I: AS α-helix (H2): AS Loop II: AS Helix (H3): AS Loop III: AS α-helix (H4): AS U μs I ms N A39G Mutation k ex Abbildung 13: Angeregte Zustand und Grundzustand von FF Domäne. Die Abbildung ist aus Hashim M. Al-Hashimi et al übernommen. CPMG-D: versagt CEST: 37 AS

17 Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP11 17 Abbildung 14: Links: HSQC-Spektrum von A39G Mutante. Rechts: : Intensitätsprofile der Aminosäure von A39G Mutante. Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

18 Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP11 18 Abbildung 15: Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

19 Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP11 19 Erwartet: gefaltet vs. ungefaltet flexibler R 2 gefaltet > R 2 ungefaltet two-state exchange vs. tree-state exchange Abbildung 16: Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

20 Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP N-CPMG-Relaxations-Dispersion-Experiment 11,7 T 14,0 T 18,8 T Abbildung 17: 15 N-CPMG-Relaxations-Dispersion-Experiment. Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

21 Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP11 21 CPMG vs. CEST k ex p E CPMG-D: 101 ± 18 s -1 0,8 ± 0,1 % CEST: 51,6 ± 1 s -1 1,65 ± 0,02 % Abbildung 18: Die Abbildung ist aus Vallurupalli and Bouvignies et al übernommen.

22 Zusammenfassung 22 CPMG-D CEST k es s -1 < 200 s -1 p E > 0,5% beliebig gut für große Proteine (T1, T2) Validierung der CEST-Methode an Abp1p SH3 - Ark1 System Faltung der A39G Mutante von der FF Domäne HYPA/FBP11: Bestimmung von k ex, p E und R 2 two-state exchange vs. tree-state exchange CPMG vs. CEST

23 Literatur Vallurupalli, P.; Bouvignies G.; Kay, L. E. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, Vallurupalli, P.; Hansen, D. F.; Kay, L. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008, 105, Vallurupalli, P.; Hansen, D. F.; Stollar, E.; Meirovitch, E.; Kay, L. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007, 104, Bouvignies, G.; Hansen, D. F.; Vallurupalli, P.; Kay, L. E. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, Jemth, P.; Day, R.; Gianni, S.; Khan, F.; Allen, M.; Daggett, V.; Fersht, A. R. J. Mol. Biol. 2005, 350, Korzhnev, D. M.; Religa, T. L.; Banachewicz, W.; Fersht, A. R.; Kay, L. E. Science 2010, 329, Jemth, P.; Day, R.; Gianni, S.; Khan, F.; Allen, M.; Daggett, V.; Fersht, A. R. J. Mol. Biol. 2005, 350, Korzhnev, D. M.; Vernon, R. M.; Religa, T. L.; Hansen, A. L.; Baker, D.; Fersht, A. R.; Kay, L. E. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, Fawzi, N. L.; Ying, J.; Ghirlando, R.; Torchia, D. A.; Clore, G. M. Nature 2011, 480, Farrow, N. A.; Muhandiram, R.; Singer, A. U.; Pascal, S. M.; Kay, C. M.; Gish, G.; Shoelson, S. E.; Pawson, T.; Forman-Kay, J. D.; Kay, L. E. Biochemistry 1994, 33, Rule G. S. and Hitchens T. K. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy; Springer, 2006.

24 Danke für die Aufmerksamkeit

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