Thema Gentechnologie. Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik. Vorlesung #
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- Samuel Morgenstern
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1 Thema Gentechnologie Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik Vorlesung #
2 Klassische DNA-vermittelte Transformation von Säugern
3 Herstellung einer transgenen Maus
4 Gentechnologie an höheren Organismen ist komplizierter als bei Bakterien wegen der Vielzelligkeit solcher Organismen Die fremde DNA muss in die Chromosomen der Keimzellen gelangen. Eine gängige Methode ist die Mikroinjektion der DNA in den Zellkern einer befruchteten Eizelle
5
6 Quelle:
7 Ein besonderes Verfahren zur Herstellung transgener Mäuse ist die Verwendung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen: gentechnisch veränderte embryonale Stammzellen ( schwarze Zellen in der Abb.) werden in einen frühen Embryo (Blastozyste) injiziert. Die ES- Zellen nehmen an der Entwicklung teil. Es entsteht ein chimäre Maus (erkennbar am gescheckten Fell). Auch die Keimzellen dieser Maus stammen z. T. von den transgenen ES-Zellen ab. Durch Kreuzung entstehen Mäuse, die von den transgenen ES-Zellen abstammen (schwarze Maus).
8 Injektion von embryonalen Stammzellen in eine Maus Blastozyste
9 Maus-Chimären aus embryonalen Stammzellen- Transplantaten
10 Ein besonderes Verfahren ist die Herstellung von so genannten knock out (k.o.)-mäusen: In einer ES-Zelle wird durch homologe Rekombination ein intaktes Gen durch ein defektes ersetzt. Aus den gentechnisch veränderten ES-Zellen werden Mäuse regeneriert mit dem defekten Gen (siehe vorherige Folie) defektes Gen
11 Der Knock-out kann auch konditional sein, d. h. unter bestimmten Bedingungen, nach Belieben induziert werden, indem eine intakte Genkopie von zwei Rekombinationssequenzen (z. B. lox-p-sequenzen) flankiert in die Maus Eingebaut wird. Durch Einkreuzen eines Rekombinase-Gens wird die Genkopie aus dem Chromosom heraus geworfen und damit funktionsunfähig
12 CRISPER-Cas-System der erworbenen Bakterienimmunität Nature Methods 10, (2013)
13 CRISPER-Cas-System der erworbenen Bakterienimmunität Nature Methods 10, (2013)
14 Nature Methods 10, (2013)
15 Nature Methods 10, (2013)
16 Nature Methods 10, (2013)
17 a) The basic S. pyogenes Cas9-sgRNA RNA-guided nuclease complex for eukaryotic genome engineering. Target recognition and cleavage require protospacer sequence complementary to the spacer and presence of the appropriate NGG PAM sequence at the 3 of the protospacer. (b) Cas9 enables programmable localization of dsdna, RNA and proteins. Proteins can be targeted to any dsdna sequence by simply fusing them to Cas9nuclease-null, and additional RNA can be tethered to sgrna termini without compromising Cas9 binding. Attaching RNA binding sites can in turn recruit RNA-binding proteins or directly recruit other RNAs via sequence hybridization. Finally, Cas9 can theoretically bring together any two dsdna regions by employing sgrna-cas9 'staples' that bind to the targeted loci and to one another. Consequently, Cas9 can in principle bring together any fusion proteins, any natural or fusion RNAs and/or any dsdna locus to any other dsdna sequence of interest. (c) The diverse potential applications of Cas9 range from targeted genome editing (via simplex and multiplex double-strand breaks and nicks) to targeted genome regulation (via tethering of epigenetic effector domains to either the Cas9 or sgrna, and via competition with endogenous DNA binding factors) and possibly programmable genome reorganization and visualization. Cas9 might also be engineered to function as an RNA-guided recombinase, and via RNA tethers could serve as a scaffold for the assembly of multiprotein and nucleic acid complexes.
18 Gentherapie mit Hilfe von Stammzellen
19 Bedeutung embryonaler Stammzellen
20 Was sind (embryonale) Stammzellen? Wozu brauchen wir sie? totipotent oder pluripotent?
21 Was ist Totipotenz, was ist Pluripotenz? Totipotenz: die Zellen sind in der Lage sich in alle in einem Organismus jemals vorhandene Zellen zu differenzieren (z. B. auch in Trophoblastenzellen) daraus folgt: aus solchen Zellen kann sich ein Mensch entwickeln Pluripotenz: die Zellen können sich noch in sehr viele verschiedene Zellen differenzieren, aber nicht mehr in alle ( z. B. nicht mehr in Trophoblasten-Zellen)
22 Totipotente Zellen können sich in Zellen aller drei Keimblätter entwickeln Ektoderm Endoderm Mesoderm
23 Ein Organismus entwickelt sich aus einer einzigen Zelle: der befruchteten Eizelle Eizelle Zweizellstadium Achtzellstadium
24 Es gibt verschiedene Arten von Stammzellen: embryonale Stammzellen (ES-Zellen) embryonale (fetale) Keim -Stammzellen (EG-Zellen, von embryonic germ cells ) adulte Stammzellen z. B. hämatopoetische Stammzellen aus Knochenmark
25 Die verschiedenen Stammzellen werden nach ihrer Herkunft benannt ES-Zellen werden aus frühen Embryonen gewonnen EG-Zellen werden aus primordialen Keimzellen aus Foeten isoliert Adulte Stammzellen werden aus verschiedenen Organen (Knochenmark, Gehirn, Blut, Leber, Retina etc) gewonnen
26
27 Die verschiedenen Stammzellen unterscheiden sich in ihren Eigenschaften ES-Zellen und EG-Zellen sind pluripotent (differenzieren zu Zellen aller drei Keimblätter) und bilden sog. embryonic bodies in Kultur ES-Zellen wachsen besser (>500 Verdopplungen) in Zellkultur als EG- Zellen (max. 80 Verdoppl.) ES-Zellen bilden Teratome, EG-Zellen keine T. Adulte Stammzellen sind nicht pluripotent, die Plastitzität der Zellen ist noch nicht abschließend geklärt
28 ES-Zellen werden aus frühen Embryonen im Blastocysten-stadium gewonnen Gewinnung von Stammzellen
29 Entnahme embryonaler Stammzellen
30 Entwicklung eines menschlichen Embryos:
31 Verfügbare ES-Zelllinien Zur Zeit gibt es zwischen mehr als 60 humane ES- Zelllinien; aus der National Stem Cell Bank (USA) können zurzeit 279 verschiedene ES-Linien bezogen werden; NIH hes Cell Registry finden sich 400 Zelllinien davon 121 in der Prüfung 5) (Stand ent.htm
32 Stammzellgesetz
33 Gewinnung von ES-Zellen : Herkunft der Embryonen die menschlichen Embryonen stammen aus IVF- Behandlungen und sind überzählig und werden gespendet weltweit werden derzeit mehr als überzählige Embryonen tiefgekühlt gelagert
34 Gewinnung von Stammzellen: ES-Zellen
35 Die früheste Differenzierung der embryonalen Stammzellen: Erste Differenzierung in Trophoektoderm und primitives Endoderm wird durch differenzielle Oct4- Genexpression erreicht (aus Pesce and Schöler)
36 Etablierung einer Stammzelllinie: Wie viele Eizellen werden für eine Stammzelllinie benötigt? Bei der Etablierung der ersten menschlichen ES- Zelllinien (Thomson et al. 1998) wurden 36 Embryonen eingesetzt, 20 entwickelten sich bis zur Blastocyste, davon wurden 14 Embryoblasten isoliert und kultiviert, daraus konnten erfolgreich 5 Zelllinien etabliert werden (jede Zelllinie jeweils nur von einem Embryo)
37 Müssen Embryonen speziell für die Stammzellerzeugung gezüchtet werden? Die ersten humanen ES-Zelllinien (Thomson et al. 1998) stammen sowohl aus eingefrorenen als auch aus frischen Embryonen. Die Autoren erwähnen keine auffälligen Unterschiede zwischen eingefrorenen und frischen Embryonen
38 Kann man ES-Zellen im Reagenzglas zu Organen heranzüchten? Kultivierte Mensch-ES-Zellen konnten zur Differenzierung in mehr als 10 verschiedene Zell-/Gewebetypen angeregt werden: z.b. Herzmuskelzellen, Gehirnzellen, Knochen- und Knorpelzellen, Nierenzellen, Leber, Pankreas, Ganglienzellen, glatte Muskelzellen, Darmepithel u. a.. Fraglich ist, ob sich daraus Keimzellen entwickeln können. Das scheint nach neuesten Erkenntnissen aber möglich zu sein! Kultivierte Maus-ES-Zellen konnten zur Differenzierung in mehr als 34 verschiedene Gewebe/Zellen angeregt werden
39 Ist schon bewiesen, dass ES-Zelltransplantationen Erkrankungen heilen können? In Tierversuchen, eindeutig ja: Beispiele Autoimmunerkrankungen(Maus), Diabetes (Maus), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS, deg Motoneuronen, Ratte) Parkinson (Mensch, fetale Stammzellen -ohne Doppelblind-Studie-) Herzinfarkt (Maus, Ratte, mit adulten Stammzellen)
40 Gentechnische Modifikation zur Verhinderung der Abstoßungsreaktion
41 Künstliche Embryonale Stammzellen (ips) aus Fibroblasten durch Aktivierung der Gene Oct4, Sox2, cmyc und Klf4. Ca. 1 von 1000 Zellen entwickelt ES-Cell Phänotyp.Takahashi, K., and Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: , Marius Wernig(1*), Alexander Meissner(1*), Ruth Foreman(1,2*), Tobias Brambrink(1*), Manching Ku(3*), Konrad Hochedlinger(1^), Bradley E. Bernstein(3,4,5) & Rudolf Jaenisch(1,2), Nature Juni 2007
42 Herstellung künstlicher ES-Zellen
43 Chimäre Maus mit künstlichen ES-Zell-Arealen
44 Aus: In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state Marius Wernig, Alexander Meissner, Ruth Foreman, Tobias Brambrink, Manching Ku, Konrad Hochedlinger, Bradley E. Bernstein & Rudolf Jaenisch Nature 448, (19 July 2007)
45 1. de Peppo, G. M., I. Marcos-Campos, D. J. Kahler, D. Alsalman, L. Shang, G. Vunjak- Novakovic, and D. Marolt Engineering bone tissue substitutes from human induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences (May). 2. Marolt, D., I. M. Campos, S. Bhumiratana, A. Koren, P. Petridis, G. Zhang, P. F. Spitalnik, W. L. Grayson, and G. Vunjak-Novakovic Engineering bone tissue from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 109(22):
46 Therapeutisches Klonen?
47 Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer Masahito Tachibana et al. Cell,153, 1-11, 15 May (June6) 2013
48 Großbritannien erlaubt Herstellung von Mensch-Tier-Embryonen (Spiegel on line, ) Die Debatte war kontrovers, aber am Ende stand eine deutliche Mehrheit: Das britische Unterhaus hat der Herstellung von Embryonen aus menschlichem Erbgut und Eizellen von Tieren für die Stammzellenforschung zugestimmt. Kritiker befürchten jetzt eine "Frankenstein-Wissenschaft". London - Das britische Unterhaus stritt heftig, Premierminister Gordon Brown warb für die Stammzellenforschung, und am Ende konnte er zufrieden sein: In Großbritannien können Embryonen aus menschlichem Erbgut und Eizellen von Tieren für die Forschung geschaffen werden. Das Unterhaus in London stimmte am Montagabend mit 336 zu 176 Stimmen gegen einen Antrag, generell die Produktion von solchen Chimären zu verbieten. Damit unterstreicht Großbritannien seinen Ruf als eines der weltweit liberalsten Länder in der Stammzellenforschung. Ebenfalls wurde im Unterhaus ein Antrag zum Verbot der Produktion sogenannter "Helferoder Rettergeschwister" mit Mehrheit abgelehnt. Dabei geht es um die künstliche Erzeugung von Embryonen, die einem lebenden Kind genetisch weitgehend entsprechen und ihm bei Krankheiten Zellen oder genetisches Material für die Behandlung liefern sollen.
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