20.5 Symbiotische Stickstoff-Fixierung

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1 Biotische Stressoren Wechselwirkung von Pflanzen mit anderen Organismen Plus 20.4 Endophyten Obwohl Vertreter der Glomeromycota als Endomykorrhizapilze die häufigsten Endophyten der Samenpflanzen sind, gibt es auch mutualistische Endophyten aus den Gruppen der Ascomyceten und Basidiomyceten. Zwei Beispiele sollen die mögliche Bedeutung solcher Symbiosen belegen: y Der Basidiomycet Piriformospora indica lebt als Endophyt sowohl in Wurzeln von Getreidearten (Reis, Weizen, Gerste) als auch von vielen dikotylen Pflanzen wie z. B. Arabidopsis. Die Infektion erfolgt über die Wurzelhaare, und die Pilzhyphen finden sich in den Zellen der Wurzelrinde. An Gerstenpflanzen führt die Symbiose zu einer deutlich verbesserten Stickstoffversorgung aus dem Wurzelraum und damit zu einer merklichen Steigerung des Wachstums und des Körnerertrags. Darüberhinaus waren die infizierten Pflanzen im Vergleich zu nicht infizierten merklich verbessert in ihrer Abwehr gegenüber Pathogenen wie dem Erreger der Wurzelfäule (Fusarium) und Mehltau (Blumeria graminis). Die Stärkung der inhärenten Abwehrkräfte (Kap ) gegenüber Pathogenen ist offensichtlich das Ergebnis der ständigen unterschwelligen Auseinandersetzung zwischen Wirtspflanze und Endophyt im Sinne einer Eustreßsituation (Box 19.1 S. 774). y Das zweite Beispiel betrifft den Ascomyceten Epichloe festucae, der in den Interzellularräumen der Blätter des landwirtschaftlich stark genutzten Grases Lolium perenne (Raygras, Box 19.8 S. 797) existiert. Sporen bzw. Mycelteile des Pilzes befinden sich auch in den Samen, sodaß sich schon mit der Keimlingsentwicklung die Symbiose einstellt. Bemerkenswerterweise wachsen die Hyphen in strenger Abstimmung mit der Blattentwicklung, und es kommt zu keiner sichtbaren Abwehrreaktion durch das Gras. Im Gegenteil, auch in diesem Fall beobachtet man eine deutliche Wachstumsförderung bei Lolium. Der Haupteffekt der Symbiose mit Epichloe liegt allerdings darin, daß der Pilz toxische Alkaloide produziert (Kap. 12.4), die das Gras vor Fraßschädlingen schützen können. Die streng kontrollierte Ausbreitung des Pilzes in den Blättern der Wirtspflanze beruht auf der Bildung von ROS durch eine NADPH-Oxidase in der Hyphenmembran (Plus 20.6 S. 824). Diese wird unter der Einwirkung pflanzlicher Signale gebildet. Die Anwesenheit der ROS begrenzt offensichtlich das Spitzenwachstum und die Verzweigung der Hyphen. Mutanten des Pilzes mit einer defekten Oxidase verlieren diese Kontrolle, breiten sich ungehindert aus und können die Wirtspflanze abtöten. An diesem Beispiel wird besonders deutlich, daß der mutualistische Charakter einer solchen Beziehung an bestimmte Voraussetzungen geknüpft ist, die die Zwiesprache zwischen den beiden Partnern garantieren Symbiotische Stickstoff-Fixierung Viele Bakterien im Boden haben die Fähigkeit zur Reduktion von molekularem Stickstoff (diazotrophe Bakterien). Zu ihnen gehören die Knöllchenbakterien, die aber nur als Symbionten von Leguminosen Stickstoff fixieren können. Die selektive Erkennung von Rhizobien und ihren Wirtspflanzen beruht auf Signalen (Flavonoide, Nod-Faktoren), die den Infektionsprozeß an der Spitze der Wurzelhaare auslösen. Im Inneren der Wurzelrinde entsteht ein Knöllchenprimordium, das von den Bakterien besiedelt wird. In den reifen Knöllchen sind die N 2 - fixierenden Zellen mit umgewandelten Bakterien (Bakteroide) angefüllt, die von einer Peribakteroid-Membran eingeschlossen sind (Symbiosomen). Große Mengen an Leghämoglobin in den Zellen garantieren die Sauerstoff-Versorgung unter den mikroaeroben Bedingungen. Die Fähigkeit zur Reduktion von molekularem Stickstoff (N 2 ), der ja in der erdnahen Atmosphäre in unbegrenzten Mengen zur Verfügung steht, ist von allergrößter Bedeutung für die Versorgung der Biosphäre mit organischen Stickstoffverbindungen. Eine ganze Reihe von sog. diazotrophen Bakterien haben diese einzigartige Fähigkeit (Tab. 9.2 S. 301), die allen anderen Organismen fehlt. Viele dieser Bakterien sind freilebend, während andere die Fähigkeit zur N 2 -Fixierung nur als Teil einer Symbiose mit Pflanzen erlangen. Zu ihnen gehört die große Gruppe der Knöllchenbakterien (Rhizobiaceen), die in verschiedenen landwirtschaftlich wichtigen Leguminosen als Wirtspflanze leben. Die Biochemie der energieaufwendigen N 2 -Reduktion und die speziellen Erfordernisse einer mikroaeroben (sauerstoffarmen) Umgebung für

2 20.5 Symbiotische Stickstoff-Fixierung 817 das Schlüsselenzym Nitrogenase, wurden in Kap behandelt. Wir wollen zur Erinnerung hier nur die Summenformel der Reaktion noch einmal aufführen: N ATP + 8 H p 2NH 3 +H 2 +16ADP+16P i Nach diesem biologischen Verfahren werden jährlich weltweit etwa 150 Millionen Tonnen N 2 fixiert, jeweils zur Hälfte durch terrestrische Organismen und zur Hälfte durch marine. In diesem Kapitel werden nur die interessanten Aspekte der Besiedlung von Leguminosewurzeln mit Knöllchenbakterien und die damit verbundenen entwicklungsbiologischen Veränderungen an beiden Partnern behandelt. Dabei begegnet uns ein besonders intensiver Signalaustausch (Abb. 20.7), der das Bild von der Rhizosphäre als Datenautobahn unterstreicht. Signale zwischen den Knöllchenbakterien im Boden bzw. zwischen den Bakterien und der Wirtspflanze kontrollieren das Geschehen (Abb und Plus 20.6 S. 824). Genetische Voraussetzung für den Prozeß der N 2 -Fixierung sind eine Reihe zusätzlicher Gene in den Knöllchenbakterien, deren Produkte die komplexe Wechselwirkung mit der Wirtspflanze, die Etablierung der Symbiose und schließlich die N 2 -Fixierung selbst ermöglichen (Box 20.4). Bei vielen Vertretern der Rhizobiaceen liegt der gesamte genetische Apparat auf einem sog. Symplasmid. Bei der Entstehung eines Wurzelknöllchens können wir mehrere Teilprozesse unterscheiden: y Die im Boden freilebenden Rhizobien existieren als Saprophyten und müssen eine gewisse Dichte erreichen, bevor sie kompetent für die Besiedlung sind. Die Volkszählung (Quorum sensing) wird durch chemische Signale zwischen den Bakterien ermöglicht (Plus 20.5). y Die wechselseitige Erkennung zwischen Bakterienstamm und Wirtspflanze beruht auf chemischen Signalen (Flavonoiden) im Wurzelraum der Pflanze und auf der induzierten Bildung von Lipochitooligosacchariden in den Bakterien, die als Nodulationsfaktoren (Nod-Faktor) der Erkennung für die Wirtspflanzen dienen (Abb. 20.8b). Abb Entwicklungsstadien und Signalaustausch bei der Entstehung einer Symbiose mit Rhizobien. Details s. Text.

3 Biotische Stressoren Wechselwirkung von Pflanzen mit anderen Organismen Plus 20.5 Volkszählung (Quorum sensing) bei Knöllchenbakterien Mikrobiologen wissen seit langer Zeit, daß eine Population von Bakterien mehr ist als die Ansammlung der Einzelzellen. Das gilt ebenso für Kulturen einzelliger eukaryotischer Mikroorganismen. Die Zellen in einer solchen Kultur sind Teil eines vielzelligen Ensembles (Kap ). Sie kommunizieren miteinander über die Zelldichte oder die Sauerstoff- und Nährstoffkonzentration. Sie tauschen Plasmide aus, die die Bildung oder den Abbau von toxischen Stoffen oder aber die Erschließung neuer Nährstoffquellen ermöglichen (Kap ). Die ganze Population kann auf ein entsprechendes Signal hin ihr Wachstum oder metabolisches Verhalten ändern. Ein besonders eindrucksvolles Phänomen in dieser Hinsicht ist die Erfassung der Populationsdichte (Quorum sensing). Alle Zellen scheiden bestimmte Stoffe aus, die bei einem bestimmten Schwellenwert als Ausdruck der Zelldichte einen Phasenwechsel auslösen mit mehr oder weniger umfangreichen Veränderungen in den Genexpressionsprogrammen. Bei den freilebenden Knöllchenbakterien muß eine bestimmte Dichte erreicht werden, ehe die Zellen kompetent für die erfolgreiche Invasion ihrer Wirtspflanze sind (Abb und Abb. 20.9). Das Signal für das Quorum sensing sind wie bei vielen anderen Gram-negativen Bakterien N-Acyl-homoserinlactone (AHLs, Abb. 4.9 S. 148). Die AHLs inaktivieren ein Repressorprotein in den Bakterienzellen und ermöglichen damit Genexpressionsprogramme, die der Etablierung der Symbiose dienen. Signale aus dem Abb Signalmoleküle zwischen Pflanzen und Rhizobien. a Luteolin als Vertreter der Flavonoide (Kap ) und der unter b gezeigte Typ eines Nod-Faktors sind die spezifischen Signale für die Besiedlung von Medicago durch Sinorhizobium meliloti. Bei den Nod-Faktoren handelt es sich um Lipochitooligosaccharide mit vier N-Acetylglucosaminresten als Grundbausteine. Die zusätzlichen Substituenten, die die Spezifität ausmachen, sind farbig markiert (Acetylgruppe, rot; Sulfatrest, blau; doppelt ungesättigter Fettsäurerest mit 16 C-Atomen, grün). Trotz prinzipieller Ähnlichkeit sehen für andere Leguminosen und ihre speziellen Rhizobien die Signale etwas anders aus. Das Signalsystem garantiert die hohe Selektivität der Kombinationen zwischen Wirtspflanzen und Rhizobien. Wurzelraum der Wirtspflanze, z. B. Flavonoide (Kap ), verstärken die Umprogrammierung. Die von AHLs stimulierten Gene codieren im wesentlichen für Proteine, die der Infektion und der Überwindung der Abwehrmechanismen durch die Wirtspflanze dienen (Abb. 20.7): y Bildung von ROS-Scavengerenzymen (Abb S. 784), y Bildung einer schleimigen Außenschicht mit Exopolysacchariden, y Bildung hydrolytischer Enzyme, y Bildung von Adhäsionsmolekülen an der Bakterienoberfläche. Die Knöllchenbakterien müssen ihre Wirtspflanzen gewissermaßen zu ihrem Glück einer unbegrenzten Versorgung mit organischen N-Verbindungen zwingen. Aber aus der allgemeinen Sicht der Wechselwirkung zwischen Pflanzen und Mikroorganismen im Wurzelraum ist die Abwehr natürlich verständlich (Kap ). Nur die durch Coevolution angepaßten Arten bzw. Rassen der Knöllchenbakterien können schließlich in eine stabile symbiotische Beziehung eintreten, die einen intensiven Stoffaustausch voraussetzt. Neben den genannten Möglichkeiten zur Schwächung der pflanzlichen Abwehr spielen die Nod-Faktoren in ihrer großen Mannigfaltigkeit (Abb. 20.8b) eine entscheidende Rolle für die hohe Selektivität der Partnerwahl.

4 20.5 Symbiotische Stickstoff-Fixierung 819 Box 20.4 Genbatterien für Symbiose und N 2 -Fixierung Bei den Rhizobien sind etwa 100 Gene an der Wechselwirkung mit den Wirtspflanzen und an der N 2 -Fixierung beteiligt. Sie liegen entweder im Genom (Bradyrhizobium) oder aber auf einem riesigen Plasmid von i 500 kb, dem sog. Symplasmid, (Rhizobium, Sinorhizobium). Die beiden Gengruppen gehören funktionell der präsymbiotischen bzw. der symbiotischen Phase an: Protein Funktion präsymbiotische Phase (Abb. a, b) NodD Aktivator des Nod-Regulons; bindet Flavonoid-Signal NolR Repressor des Nod-Regulons Nod/Nol-Enzyme Biosynthese der Nod-Faktoren; Expression wird kontrolliert durch NodD und NolR symbiotische Phase (Abb. c) FixL/FixJ NifA Nif/Fix-Proteine O 2 -empfindliches Hämoprotein, ist als His-Kinase (H) Teil eines Phosphorelais (Plus 16.2 S. 598) mit FixJ als Phosphat-Empfänger (D) und Transkriptionsfaktor (TF) O 2 -empfindlicher hexamerer TF für die Expression der Nif/Fix-Gene; Expression wird kontrolliert durch FixL/FixJ Enzyme und Cofaktoren der N 2 -Fixierung (Nitrogenase, Cofaktoren); Expression kontrolliert durch NifA

5 Biotische Stressoren Wechselwirkung von Pflanzen mit anderen Organismen y Die Nod-Faktoren lösen in geringsten Mengen (I 10 9 M) die ersten Anpassungen in der Wurzel der Wirtspflanze aus: Nach Reorganisation des Actincytoskeletts in der Spitze der Wurzelhaare verlagert sich die Wachstumszone von der Spitze zur Flanke, sodaß sich das Wurzelhaar in charakteristischer Weise krümmt (Abb. 20.9). Dabei werden Bakterien in den Haken eingeschlossen (Abb. 20.9a c), und nach lokaler Auflösung der Zellwand können die Bakterien eindringen. Es entsteht der sog. Infektionsschlauch, der, vom Cytoplasma abgegrenzt, als eine Art Kanal für die Weiterleitung der Bakterien funktioniert (Abb. 20.9b, c). Die Bakterien können so unter starker Vermehrung in das Knöllchenprimordium in der Rinde gelangen. y Bereits sehr bald nach der Bildung des Infektionsschlauches im Wurzelhaar entstehen zwei Zentren mit teilungsaktiven Zellen (Knöllchenprimordien). Eines davon bildet sich über einem Xylemstrang im Perikambium. Das zweite Primordium entsteht in der Rinde selbst (Abb. 20.9b). Die Signale zur Abstimmung der Prozesse im Wurzelhaar und den Teilungszentren sind nicht klar. Auf jeden Fall spielen AUX, CK und offensichtlich ETH eine entscheidende Rolle. In den Primordien werden die frühen Noduline (ENod, early nodulins) gebildet, die die Morphogenese der Knöllchen bestimmen. y Wenn der Infektionsschlauch die neu gebildeten Rindenzellen erreicht, verzweigt er sich und entläßt die Bakterien (Abb. 20.9c). Die Bakterien werden von der Peribakteroidmembran umgeben, die vom Plasmalemma oder vom ER der Wirtszelle gebildet wird. Die Bakterien vergrößern sich, ihr DNA-Gehalt steigt auf das 4 8-fache an, und sie werden zu sog. Bakteroiden. Die Gesamtheit der Bakteroide, der sie umgebenden Matrix und der Peribakteroid-Membran bezeichnet man als Symbiosomen (Abb ). y Das reife Knöllchen ist ein hochorganisiertes Organ zur N 2 -Fixierung (Abb ). Die Pflanzenzellen sind polyploid (32n) und vollgestopft mit Symbiosomen (etwa Bakteroide g 1 Frischgewicht). Wegen der hohen Konzentration an Leghämoglobin (Box S. 651), das bis zu 40 % der löslichen Proteine ausmacht, sind die Knöllchen rötlich gefärbt. Leghämoglobin gehört zu den späten Nodulinen und garantiert die notwendige Sauerstoff-Versorgung unter den mikroaeroben Bedingungen. Trotz des Sauerstoffmangels in den Bakteroiden werden große Mengen von ATP für die N 2 -Fixierung durch Atmungsvorgänge synthetisiert. Daran ist eine spezielle Cytochromoxidase mit einer sehr hohen Affinität zu O 2 beteiligt. Einige Knöllchen (Erbse, Luzerne, Klee) wachsen an der Spitze mit einer sauerstoffreichen meristematischen Zone weiter (indeterminierte Knöllchen, Abb. 20.9e). Bei anderen Pflanzen (Sojabohne, Gartenbohne) stellen die reifen Knöllchen das Wachstum ein (determinierte Knöllchen). Die Zahl der Knöllchen an einer Wurzel wird durch Signalaustausch zwischen Sproß und Wurzel reguliert, d. h. der energetisch aufwendige Prozeß der N 2 -Fixierung wird den metabolischen Bedürfnissen angepaßt. Am Grund der Knöllchen befindet sich die Alterungszone (Abb. 20.9e). Das Leghämoglobin wird abgebaut, und die Produkte aus der Lyse der Bakteroide werden durch leitbündelartige Stränge abtransportiert. Bei diesem Alterungsprozeß können sich einige der Bakteroide wieder zu normalen, freilebenden Bakterien umformen, sodaß insgesamt nach Absterben der Pflanze und Zerfall der Knöllchen mehr Bakterien in den Boden zurückgelangen als ursprünglich vorhanden waren.

6 20.5 Symbiotische Stickstoff-Fixierung 821 Abb Stadien der Knöllchenentwicklung. a Signalerkennung und Wurzelhaarkrümmung. b Bildung des Infektionsschlauchs aus Membran und Zellwandmaterial der Wirtszelle; Anlage der Knöllchenprimordien im Perikambium bzw. in der Rindenschicht. c, d Infektion durch die Bakterien und Proliferation der Primordien, bis sie zu einer frühen Form des Knöllchens zusammenwachsen (a d nach Buchanan et al. 2000; Taiz und Zeiger 2006). e Funktionelle Organisation eines indeterminierten Knöllchens; Pfeilkopf zeigt auf Stärkekörner; Maßstab 100 mm (aus T. Arcondeguy et al., Genes Dev. 1997; 11: 1194, mit Genehmigung von Cold Spring Harbor Press). Abb Wurzelknöllchen. a Knöllchen an der Wurzel der Soyabohne (Foto: P. Müller). b Schnitt durch eine Wurzelzelle der Sojabohne 20 Tage nach der Infektion mit Bradyrhizobium japonicum. Die Zelle ist vollgestopft mit Symbiosomen, die zum Teil auch mehrere Bakteroide enthalten. Unten nicht-infizierte Zellen (Interstitialzellen). c Detailansicht eines Symbiosoms. M Peribakteroidmembran; PB Polyhydroxybuttersäure-Granula; PP Polyphosphatgranula (Vergr. ca. 3500fach; elektronenmikroskopische Aufnahmen aus Werner u. Mörschel, Planta 1978; 141: 173, mit Genehmigung).