PerfectBlue Tank Electro Blotter / PerfectBlue Tank-Elektroblotter

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1 Instruction Manual / Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank Electro Blotter / PerfectBlue Tank-Elektroblotter Web S & Web M v0314e+d Creating the future together.

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3 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems CONTENTS WARRANTY 2 PACKAGING LIST 2 SAFETY PRECAUTIONS 2 SYSTEM OVERVIEW 3 Technical properties 3 GENERAL INSTRUCTIONS 3 Materials required 3 Assembling the gel sandwich 4 Setting up the Tank 5 Transfer of more than one gel 6 Transfer times and conditions 6 Power Supplies 6 Cleaning 6 RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANSFER BUFFERS 7 Summary of appropriate transfer conditions 7 Transfer buffers 7 Blotting membranes 7 TROUBLESHOOTING 8 TECHNICAL SUPPORT AND ORDERING INFORMATION 10 PerfectBlue Wet Blotting Systems 10 Power Supplies 10 Blotting membranes 10 LITERATURE 11 PEQLAB_v0314_E 1

4 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems WARRANTY PEQLAB guarantees that the wet blotting system you have received has been thoroughly tested and meets its published specification. However, immediately upon arrival, please check carefully that the shipment is complete and has not been damaged in transit. For missing parts or to report any kind of damage, please contact PEQLAB (see 'TECHNICAL SUPPORT AND ORDERING INFORMATION'). Please retain all packaging materials until the delivery has been completely checked since this will speed up the return of goods if required and reduce environmental impact. Any form of returns, replacements or credit notes must be agreed in advance by PEQLAB. For the complete range of PerfectBlue electrophoresis and blotting systems, PEQLAB guarantees a warranty period of 36 months if the products have been used solely according to the instruction manual unless a different warranty has been offered in writing. After the warranty period has expired, PEQLAB can offer repairs. No liability is accepted for loss or damage arising from incorrect use. PEQLAB's liability is limited to the repair or replacement of the unit or refund of the purchase price, at PEQLAB's discretion. PEQLAB is not liable for any consequential damages. PEQLAB reserves the right to alter the technical specifications of the PerfectBlue electrophoresis or blotting systems without prior notice. This will enable us to implement developments as soon as they arise. PACKAGING LIST Unless requested otherwise, the following items are included in shipment for the models Web S and Web M: one buffer tank with plate electrodes and 2 hoses barbs for external cooling one safety lid with attached power cords Web S: 4 color-coded cassettes including 2 fiber pads each Web M: 2 color-coded cassettes including 2 fiber pads each one instruction manual SAFETY PRECAUTIONS Please, read this Instruction Manual carefully before using the blotting system Only use a CE marked DC power supply. Always disconnect the system from the power supply before removing the safety lid. Always disconnect the system from the power supply when it is not in use or before moving it. Running conditions for this unit should not exceed the maximum operating voltage or current. Do not use the system if any part is broken. PEQLAB_v0314_E 2

5 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems SYSTEM OVERVIEW The PerfectBlue Tank electro blotting systems WEB S and M are designed to rapidly and quantitatively transfer nucleic acid or proteins from up to four polyacrylamide gels at once to nitrocellulose, nylon or PVDF membranes. The color-coded cassettes allow for easy assembly of blotting sandwich and errorfree transfer. The robust acrylic construction of the buffer tank and the safety lid withstands daily usage without breakage, warping or leakage. Gold-plated banana plugs together with solid plate electrodes made of platinum-plated titanium (anode) or stainless steel (cathode) are assuring highest electric conductivity and an exceptional homogeneity of the electrical field. As a result transfers of outstanding quality will be achieved. For effective heat removal a water circulation made of alumina ceramic is integrated in the base of the buffer tank allowing for shortest transfer times using high currents. Buffer chambers of PerfectBlue wet blotting systems Web S or Web M offer space for up to 4 or 2 blotting cassettes, respectively, and therefore enable the user to transfer samples from several gels at once. In addition there is space for a magnetic stir bar which should be used to assure uniformity of temperature and ions. Technical properties PerfectBlue Cat. No. Transfer area Buffer volume Current typ. transfer time Web S 52-WEB x 9.5 cm approx ml* ma min Web M 52-WEB x 20 cm approx ml* ma min GENERAL INSTRUCTIONS Materials required Before getting started, the required transfer buffer, blotting papers and blotting membranes should be prepared. Blotting papers membranes will be cut according to the gel size and moistened in transfer buffer. In general 2 layers of blotting paper (3 mm) each will be placed above and below the respective membrane or gel. The number of blotting papers can be increased if the fiber pads became thinner from repeated usage, in order to assure tight fitting of the blotting sandwich inside the blotting cassettes. The required amount of transfer buffer (see 'Technical properties') should be cooled and degassed in order to minimize the formation of air bubbles during transfer. The way of preparing the blotting membrane is dependent on its nature. Please follow the manufacturer's instructions. In some cases an equilibration of the gel in transfer buffer might be necessary. Please follow the instructions of your standard protocol. You will find additional information below 'RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANSFER BUFFER' and 'TECHNICAL SUPPORT & ORDERING INFORMATION'. PEQLAB_v0314_E 3

6 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems Assembling the gel sandwich For tank electro blotting systems Web S and M electrode plates are located inside the side walls of the buffer tank. Electrode plugs and blotting cassettes, in which the blotting sandwich will get mounted, are color-coded to assure proper orientation. For gel sandwich assembly, mounting of blotting cassettes inside the buffer tank, and connection to power supply, please take care that the membrane is located at the side of the gel which is close to the anode (positive electrode, red-colored) if your target molecules are negatively charged. 1. After electrophoresis, remove the gel assembly from the unit and remove the spacers 2. Open the gel cassette by gently rocking a spatula between the plates, forcing separation of the plate from the gel do not insert spatula near the notch of the glass. The gel will normally remain affixed to the bottom plate. Remove the top (notched) plate by slowly lifting it from the side with the inserted spatula and gradually increasing the angle until the plate is completely separated from the gel. 3. If the gel should stick in an isolated spot, a stream of water from a squirt bottle at the spot will aid separation. 4. Remove the gel from the bottom plate. Tip the plate up side down, starting at one edge allow the gel to roll off into the transfer buffer. Alternatively, place the plate with the gel attached, into transfer buffer. 5. Pre-equilibrate the gel in cool transfer buffer for 15 minutes with gentle agitation to remove SDS and salts. This serves to prevent the gel changing size during transfer and to reduce heating effects. If the gel is on the plate, it will become loose during this step. 6. Wearing gloves, cut the membrane to the size of the gel and blotting paper. 7. Mark the membrane to indicate the side that the samples will be on. This is important to indicate sample orientation in the event that any successive probe of the membrane is negative. Either clipping a corner of the membrane or using a ballpoint pen can do this. 8. Wet the membrane according to the manufacturer s recommendations, followed by equilibration in transfer buffer for 15 minutes. 9. Cut four pieces of laboratory grade blotting paper to a size 5mm larger than the gel to be blotted. Soak them in transfer buffer. 10. Soak fiber pads in transfer buffer. If the pads are larger than the gels you routinely use they can be trimmed down with a pair of scissors. 11. Building the gel sandwich is best done in a dish or shallow plastic box. Place the cassette with the black side down. 12. Lay a fiber pad on the black half of the cassette, followed by the soaked filter paper. Both should be soaking wet with transfer buffer. The tray may become filled with buffer as you build the blotting sandwich. PEQLAB_v0314_E 4

7 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems 13. Add a few ml of buffer to the filter papers and gently layer the gel. Beginning at one end of the gel, align the filter papers with the gel edge and slowly lower the other end, driving out any bubbles. Use a clean glass rod wetted in transfer buffer to roll out any trapped bubbles. 14. Carefully align and overlay the transfer membrane onto the gel in one smooth action. Work from the center and let the ends progressively roll down. Do not attempt to re-position the membrane as some transfer may occur on contact. Again, use a clean glass rod wetted in transfer buffer to roll out any trapped bubbles. 15. Add another two pieces of wetted filter paper and complete the sandwich with a fiber pad. Setting up the Tank 1. Cool and degas the appropriate volume of transfer buffer (see 'Technical properties'). 2. Half fill the tank with transfer buffer. 3. Connect the cooling water supply to the tank base hose connectors. Use hose clips to secure the tubing. 4. Add a stir bar to the tank to maintain uniform temperature and conductivity during electrophoretic transfer 5. Insert the cassette into one of the tank slots with the transfer membrane on the anode (positive/red) side. 6. Add transfer buffer until the top of electrode plates are just covered. 7. Place the safety lid on the unit and connect the attached power cords to an appropriate power supply. Start the transfer by defining the operating conditions (see 'RECOMMENDED TRANSFER CON- DITIONS & TRANSFER BUFFERS'). PEQLAB_v0314_E 5

8 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems Transfer of more than one gel Using the PerfectBlue electro blotting system Web S or Web M up to four or two blotting cassettes can get used at once, respectively. However, it has to be noticed that transfer efficiencies might decrease if several blotting cassettes are inserted. In this case, transfer times have to be increased in order to achieve the same transfer efficiencies as if blotting a single gel sandwich. Transfer times and conditions Transfer times must be determined experimentally. There is no formula for determining transfer time since there are too many variables involved to give specific transfer conditions. Initially, choose a buffer system and perform a pilot time course experiment, transferring molecular weight markers from your gel to the membrane of your choice. It is better to start with low current or voltage settings, monitoring the temperature as the run proceeds. If the temperature is controlled and transfer is successful you can try higher settings and decreased transfer times for subsequent runs. The following formula is describing the relation between current and transfer time: Current (ma) x Transfer time (h) = Transfer efficiency (mah) If transfer conditions should get optimized it is useful to stain the gel as well as the membrane using a general staining method (e. g. Coomassie blue or silver staining of protein gels and Ponceau red for proteins on membranes) and to compare the results with an identical gel which has not been blotted. For an initial definition of transfer settings see 'RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANS- FER BUFFER' also. Power Supplies Blotting requires a power supply that operates at a fairly high current setting and low voltage (often below 10 V). If the power supply used is not appropriate it may blow a fuse, shut itself off, display a no load or short load message or even have a short circuit. Please contact your Power Supply's manufacturer or if it is unclear if your Power Supply matches the requirements. You will find a list of PEQLAB's Power Supplies below 'TECHNICAL SUPPORT & ORDERING INFORMATION'. Cleaning The buffer tank, plate electrodes, blotting cassettes and fibre pads should be rinsed under warm running water after each use. Use a mild detergent to get rid of any debris. Rinse with distilled water afterwards. Each part should air dry completely before storage. Do not use ethanol or other organic solvents to clean acrylic products, because organic solvents cause acrylic to 'craze' or crack! PEQLAB_v0314_E 6

9 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems RECOMMENDED TRANSFER CONDITIONS & TRANSFER BUFFERS Summary of appropriate transfer conditions PerfectBlue Web S PerfectBlue Web M over night 1 h over night 1 h Towbin Buffer 25 to 40 V 40 to 80 ma 50 to 100 V 200 to 400 ma 25 to 40 V 80 to 160 ma 50 to 60 V 200 to 1250 ma Bjerrum Buffer 25 to 40 V 40 to 80 ma 50 to 100 V 200 to 400 ma 25 to 40 V 80 to 160 ma 50 to 60 V 200 to 1250 ma Dunn Buffer 10 V 40 to 80 ma 40 to 80 V 200 to 500 ma 10 V 80 to 160 ma 50 to 60 V 200 to 1300 ma Please determine optimal conditions experimentally for your specific application starting from these recommendations (see 'Transfer times and conditions'). Transfer buffers Towbin Buffer (Towbin et al., 1979) The most commonly used buffer for protein blotting from polyacrylamide gels is Towbin buffer. In order to increase transfer efficiency of proteins from the gel 0.05 to 0.1% SDS might be added. However, this might lower binding capacity of the membrane. The buffer should be degassed prior to the addition of SDS and cooled to 4 C. 25 mm Tris-Base, 192 mm Glycine, 5-20 % (v/v) Methanol, ph 8.3 Bjerrum-Puffer (Bjerrum & Schafer-Nielsen, 1986) 48 mm Tris-Base, 39 mm Glycine, 5-20 % Methanol, ph 9.2 Dunn-Puffer (Dunn, 1986) 10 mm NaHCO 3, 3 mm NaCO 3, 20 % MeOH, ph 9.9 Blotting membranes Nitrocellulose and PVDF (Polyvinylidene difloride) can be used for proteins. Charged Nylon Membranes can be used for nucleic acids. The choice depends upon the user s preference and sometimes the detection method to be used afterwards. You will find information upon PEQLAB's blotting membranes below 'TECHNICAL SUPPORT & ORDERING INFORMATION'. PEQLAB_v0314_E 7

10 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems TROUBLESHOOTING Problem Cause Solution Transfer efficiency is poor Smeared or swirled transfer and missing bands Current too low Transfer time too short Power supply is inappropriate for transfer Transfer sandwich was assembled in the wrong order or mounted wrongly oriented inside the buffer tank The ph of the transfer buffer is too close to the isoelectric point of the protein Too much methanol in the transfer buffer High percentage gels restrict transfer Air bubbles inside the fiber pads or between the different layers of the blotting sandwich Gel and membrane moved relative to each other prior to or during transfer Electrophoretic conditions were incorrect or not ideal Increase the current in the range given below 'Summary of appropriate transfer conditions'. Increase transfer time Many power supplies will shut off or blow a fuse when run at the conditions required for electro blotting like low voltage (often less than 10 V) and high current. Use the instruction manual of your power supply to determine whether it is appropriate or not. Appropriate Power Supplies from PEQLAB are listed below 'TECHNICAL SUPPORT & ORDERING INFORMA- TION'. Placing the membrane on the wrong side of the gel is the most common reason for 'empty' membranes. Usually the membrane should be closest to the anode. Follow the instructions carefully when assembling the transfer sandwich. Try a more acidic or basic transfer buffer. Reducing methanol can help elute proteins from the gel, but can reduce binding to nitrocellulose membranes. Higher percentage acrylamide or cross linker can restrict elution of proteins. Use the lowest percentage acrylamide possible to separate your proteins. Air bubbles will disrupt the electrical field and interfere with transfer. Avoid the presence of air bubbles inside the blotting sandwich. Take care that gel and membrane do not move after getting in contact to each other. The number of blotting papers can be increased if the fiber pads became thinner from repeated usage, in order to assure tight fitting of the blotting sandwich inside the blotting cassettes. Running conditions, sample preparation, percentage acrylamide, and many other variables can affect the migration and resolution of proteins. Please review your electrophoresis conditions chosen for the experiment prior to blotting. PEQLAB_v0314_E 8

11 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems Problem Cause Solution Brown coloration of membrane or cracking of gel after transfer Transferring at too high a current/temperature Membrane was not thoroughly wetted. Maybe the current was too high. Please refer to the running conditions given below 'Summary of appropriate transfer conditions'. Use the cooling option offered by the PerfectBlue Wet Blotting systems. Check for correct buffer composition. Always pre-wet the membrane according to the manufacturer s instructions. White spots indicate dry areas of the membrane. Nitrocellulose membranes Insufficient binding of proteins to the membrane PVDF membranes Smeared or swirled transfer and missing bands Over-transfer through the membrane Not enough methanol in transfer buffer SDS is preventing binding Membrane was dried out before it was added to the transfer sandwich Alcohol was not used to prewet the membrane Use 0.2 μm pore size nitrocellulose instead of 0.45 μm, or use PVDF with a higher binding capacity. Nitrocellulose binds proteins best when 20 % methanol is used in the transfer buffer. This is especially important for small proteins (<20 kda). Eliminate SDS in the transfer buffer. Membrane should be completely gray and slightly translucent when added to the sandwich. If it has dried out, rewet in methanol and equilibrate in transfer buffer. PVDF is hydrophobic and requires a short soak in methanol prior to transfer. PEQLAB_v0314_E 9

12 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems TECHNICAL SUPPORT AND ORDERING INFORMATION For technical questions and more detailed information on PEQLAB s products please visit to find the respective contact person. PerfectBlue Wet Blotting Systems Article Description Bestell-Nr. Web S complete system for gels up to 8.5 x 9.5 cm 52-WEB-10 Web M complete system for gels up to 18 x 20 cm 52-WEB-20 Blotting cassettes for Web S, 1 cassette incl. 2 fiber pads 52-WEB-SC for Web M, 1 cassette incl. 2 fiber pads 52-WEB-MC Fibre pads for Web S, 4 pads 10 x 12.5 cm 52-WEB-SF for Web M, 4 pads 18 x 24.5 cm 52-WEB-MF Power Supplies Especially models EV261, EV202 und EV231 are recommended for electro blotting. Do not hesitate to contact us for advice on which Power Supply is most suitable for your application. Item Ports max. Voltage (V) max. Current (ma) Power (W) Cat. No. EV EV222 1) E E V 2) EV EV245 1) EV EV231 1) EV EV265 1) E E V 2) EV EV202 1) EV EV261 1) EV EV215 1) EV EV232 1) EV EV233 1) EV EV262 1) 1) Not available for customers in the US. 2) For a 110 V US version please replace '230V' with '110V' in the ordering number. Blotting membranes 1) Item Pore size Amount Cat. No. Nitrocellulose membrane 0.20 μm 0.30 x 3.0 m Nylon membrane 0.45 μm 0.30 x 3.0 m PVDF membrane 0.20 μm 0.30 x 3.0 m PVDF membrane 0.20 μm 0.26 x 3.3 m ) Not available for customers in the US. PEQLAB_v0314_E 10

13 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems LITERATURE Ausubel, F.M. et al, (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 10. Vol.2, Green Publishing Associates Inc. and John Wiley and Sons, Inc. Bjerrum, O.J. and Schafer-Nielsen, C. (1986) in: Dunn, J.J. (ed.) Electrophoresis 86 VCH Weinheim, pp These authors compare results using different transfer buffers (Towbin buffer vs. the three buffer system). Dunn, S.D. (1986). Effects of the modification of transfer buffer composition and the renaturation of proteins in gels on the recognition of proteins on Western Blots by monoclonal antibodies, Anal. Biochem. 157, Sambrook, J., Fritsch, E.F. Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Towbin, J., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoresis transfer of proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 76, PEQLAB_v0314_E 11

14 Instruction Manual PerfectBlue Wet Blotting Systems NOTES PEQLAB_v0314_E 12

15 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter INHALT GARANTIE 14 LIEFERUMFANG 14 SICHERHEITSHINWEISE 14 SYSTEMÜBERBLICK 15 Technische Merkmale 15 ALLGEMEINE BEDIENUNGSHINWEISE 15 Benötigtes Material 15 Aufbau des Gelsandwiches 16 Einbau in Puffertank 17 Transfer mehrerer Gele 17 Transferzeiten und -Bedingungen 17 Power Supplies 18 Reinigung 18 EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER 19 Zusammenfassung geeigneter Transferbedingungen 19 Transferpuffer 19 Blotting-Membran 19 TROUBLESHOOTING 20 TECHNISCHER SERVICE UND BESTELLINFORMATIONEN 22 PerfectBlue Tank-Elektroblotter 22 Power Supplies 22 Blotting-Membranen 22 LITERATUR 23 PEQLAB_v0314_D 13

16 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter GARANTIE PEQLAB garantiert, dass das ausgelieferte System genauestens geprüft wurde und den geltenden Anforderungen entspricht. Bitte überprüfen Sie die Lieferung dennoch umgehend nach Erhalt auf Vollständigkeit und eventuelle Transportschäden. Sollte die Lieferung beschädigt oder fehlerhaft sein, wenden Sie sich bitte umgehend an den Technischen Service von PEQLAB oder Ihren PEQLAB-Außendienstmitarbeiter (siehe 'TECHNI- SCHER SERVICE & BESTELLINFORMATIONEN'). Durch die Aufbewahrung des Verpackungsmaterials bis zur vollständigen Prüfung der Lieferung wird die Umwelt geschont und eine evtl. Rückholung beschleunigt. Alle Rücksendungen, Austauschlieferungen und Gutschriften müssen zuvor von PEQLAB freigegeben werden. Auf sämtliche PerfectBlue Elektrophorese- und Blottingsysteme gewährt PEQLAB 36 Monate Garantie, sofern die Systeme ausschließlich der Bedienungsanleitung entsprechend verwendet wurden und keine anderslautende Vereinbarung besteht. Ansprüche auf Ersatz oder Reparatur, die aus einer fehlerhaften Verwendung entstanden sind, werden nicht erfüllt. Die PEQLAB GmbH verpflichtet sich zur Reparatur oder dem Ersatz des Gerätes bzw. der Rückerstattung des Kaufpreises nach ihren Bedingungen. PEQ- LAB haftet nicht für Folgeschäden, die aus der Verwendung des Systems entstanden sind. Nach Ablauf der Garantiezeit können defekte PerfectBlue Elelektrophorese- oder Blotting-Systeme durch PEQLAB kostengünstig repariert werden. Um Neuentwicklungen zeitnah einführen zu können, behält es sich PEQLAB vor, technische Details ohne Vorankündigung zu ändern. LIEFERUMFANG Sofern nicht anders vereinbart bzw. auf dem Lieferschein angegeben, enthält der Lieferumfang der Modelle Web S und Web M folgende Komponenten: eine Puffer-Tank mit Plattenelektroden 2 Wasseranschlüssen für externe Kühlung einen Sicherheitsdeckel mit fest angeschlossenen Stromkabeln Web S: 4 farbcodierte Kassetten mit jeweils 2 Fasermatten Web M: 2 farbcodierte Kassetten mit jeweils 2 Fasermatten eine Bedienungsanleitung SICHERHEITSHINWEISE Bitte lesen Sie diese Bedienungsanleitung sorgfältig durch, bevor Sie das System in Betrieb nehmen. Verwenden Sie zur Stromversorgung eine CE-konforme Gleichstrom-Spannungsquelle. Trennen Sie das System von der Stromversorgung, bevor Sie den Sicherheitsdeckel entfernen. Trennen Sie das System bei Nichtbenutzung stets von der Stromversorgung. Die für das System definierte maximale Stromstärke und Spannung darf nicht überschritten werden. Sollten Stromkabel oder andere Teile beschädigt sein, darf das System nicht verwendet werden. PEQLAB_v0314_D 14

17 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter SYSTEMÜBERBLICK Die PerfectBlue Tank-Elektroblotter WEB S und M ermöglichen den schnellen und quantitativen Transfer von Molekülen aus Polyacrylamidgelen auf verschiedenste Blotting-Membranen wie Nitrozellulose, Nylon- oder PVDF-Membranen. Das spezielle Design der farbcodierten Blotting-Kassetten erlaubt den einfachen Zusammenbau des Gelsandwichs und ein verwechslungsfreies Einsetzen in den Puffer-Tank. Die Konstruktion des Puffertanks und des Sicherheitsdeckels aus robustem, 6 mm starkem Acrylglas gewährleistet größte Zuverlässigkeit und eine lange Lebensdauer. Vergoldete Anschlussstecker und hochwertige Plattenelektroden aus platinumhüllten Titan (Anode) und rostfreiem Edelstahl (Kathode) führen zu verlustfreien elektrischen Kontakten und einer außerordentlich guten Homogenität des elektrischen Feldes über die gesamte Transferfläche. Das in die Tankbasis integrierte Kühlmittelzirkulationssystem aus sehr gut Wärme ableitendem Aluminium-Ceram ermöglicht ein effektives Kühlen, wodurch die Transferzeiten durch Erhöhen der Stromstärke deutlich verkürzt werden können. Die Puffertanks der PerfectBlue Tank-Blotter Web S und Web M bieten Raum für bis zu 4 bzw. 2 Blotting-Kassetten und ermöglichen somit das gleichzeitige Blotten mehrerer Gele. Um einheitlichere Temperatur- bzw. ph-verhältnisse zu erzielen, ist innerhalb des Puffertanks außerdem genügend Platz für einen Rührfisch vorhanden. Technische Merkmale PerfectBlue Bestell-Nr. Transferfläche Puffervolumen Stromstärke typ. Transferzeit Web S 52-WEB x 9.5 cm ca ml* ma min Web M 52-WEB x 20 cm ca ml* ma min ALLGEMEINE BEDIENUNGSHINWEISE Benötigtes Material Vor dem Beginn sollten die für den Transfer benötigten Puffer, Filterpapiere und die Transfermembran vorbereitet werden. Filterpapiere und Transfermembran werden auf Gelgröße zugeschnitten und in Transferpuffer äquilibriert/getränkt. Im Allgemeinen werden jeweils 2 Schichten Filterpapier (3 mm) über und unter der Membran bzw. dem Gel gestapelt. Die Zahl der Filterpapiere kann erhöht werden, um ein festes Einspannen des Gelsandwiches in die Blotting-Kassette auch dann noch zu gewährleisten, wenn die Fasermatten altersbedingt dünner geworden sind. Die benötigte Menge Transferpuffer (siehe 'Technische Merkmale') sollte direkt vor seiner Verwendung gekühlt und entgast werden, um die Bildung von Gasbläschen während des Transfers zu minimieren. Die Vorbereitung der Transfermembran ist abhängig von der verwendeten Art der Membran. Halten Sie sich hierbei an die Anweisungen des Herstellers. In einigen Fällen wird empfohlen, auch das Gel vor dem Blotten in Transferpuffer zu äquilibrieren. Folgen Sie dabei den Anweisungen Ihres Standardprotokolls. Weitere Angaben finden Sie unter 'EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUF- FER' und unter 'TECHNISCHER SERVICE & BESTELLINFORMATIONEN'. PEQLAB_v0314_D 15

18 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter Aufbau des Gelsandwiches Bei den Tankblottern Web S und M Tank-Blotter sitzen die Elektrodenplatten in den Seitenwänden des Puffertanks. Die Elektroden sowie die Blotting-Kassetten, in welche der Gelsandwich eingespannt wird, sind zum verwechslungssicheren Arbeiten farbkodiert. Achten Sie bei Zusammenbau des Gelsandwich, beim Einschieben der Blotting-Kassette und beim Anschluss des Blotters an die Spannungsquelle darauf, dass sich die Membran auf der Anodenseite (positive Elektrode, rot markiert) befindet, sofern Ihr Zielmolekül - wie im Allgemeinen üblich - negativ geladen ist. 1. Äquilibrieren Sie Ihr Gel für 15 Minuten in Transferpuffer unter leichtem Schütteln. Dies verhindert das Schrumpfen des Gels sowie Überhitzung während des Blottens. 2. Schneiden Sie unter Verwendung von Handschuhen eine Transfermembran und 4 Filterpapiere auf ein Maß zu, das an allen Seiten einige Millimeter über die Ausmaße des Gels hinaus geht. 3. Die Membran sollte auf einer Seite markiert werden, um später die Oberfläche mit den Proben wiederfinden zu können. Diese Kontrolle ist auch wichtig, um die Orientierung der Proben anzuzeigen. Die Markierung kann entweder durch Anschneiden einer Ecke oder durch Kugelschreiberzeichen erfolgen. 4. Benetzen Sie die Membran laut Herstellerangaben und äquilibrieren Sie diese für 15 min in Transferpuffer. 5. Tränken Sie die Fasermatten in Transferpuffer, pressen Sie dabei evtl. Luftblasen vollständig aus den Fasermatten heraus. 6. Der Gelsandwich kann am einfachsten in einer kleinen Schale oder Wanne zusammengesetzt werden, die Transferpuffer enthält, damit beim Zusammenbau keine Luftblasen wischen die einzelnen Lagen geraten. Platzieren Sie die Kassette mit der schwarzen Seite nach unten. 7. Legen Sie eine Fasermatte auf die schwarze Seite der Kassette, darauf zwei getränkte Filterpapiere. 8. Platzieren Sie das Gel luftblasenfrei im Zentrum der Filterpapiere. Mit einem in Transferpuffer angefeuchteten Glasstab oder einer Pipette können Luftblasen aus dem Gel 'herausgerollt' werden. 9. Legen Sie nun vorsichtig die äquilibrierte Blotting-Membran auf das Gel. Man kann die Membran von der Mitte aus auf dem Gel positionieren, und dann vorsichtig die Enden stufenweise auf das Gel abrollen. Dabei dürfen keine Luftblasen zwischen Gel und Membran eingeschlossen werden. Die Membran sollte nicht mehr verrutschen, wenn sie einmal Kontakt zum Gel hatte. 10. Die Membran wird nun mit den restlichen beiden Filterpapieren und der zweiten Fasermatte abgedeckt. Die Blotting-Kassette kann nun geschlossen werden. PEQLAB_v0314_D 16

19 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter Einbau in Puffertank 1. Füllen Sie den Tank zur Hälfte mit Transferpuffer. 2. Setzen Sie nun die Kassette entsprechend der Farbcodierung, auf alle Fälle aber mit der Membran zur Anode (positiv, rot) in eine der vorgesehene Schienen des Puffertanks ein. 3. Befüllen Sie den Puffertank nun bis zur oberen Kante der Elektrodenplatten mit Transferpuffer. 4. Verbinden Sie eine geeignete externe Kühleinheit (Thermostat-Umwälzpumpe) mit den Kühlanschlüssen des Puffertanks und sichern Sie die Schlauchverbindung durch Klammern ab. Der Innen- bzw. Außendurchmesser der Kühlanschlüsse beträgt 6 bzw. 9 mm. 5. Es wird empfohlen, während des Transfers einen Rührfisch im Puffertank zu bewegen, um eine gleichmäßige Temperatur- und Ionenverteilung im Tank zu gewährleisten. 6. Der Deckel mit den angeschlossenen Stromkabeln kann nun aufgesetzt und an den Power Supply angeschlossen werden. 7. Definieren Sie die Stromstärke bzw. Voltzahl (siehe EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER) und starten Sie den Blot-Vorgang. Transfer mehrerer Gele Im PerfectBlue Elektroblotter Web S können gleichzeitig bis zu vier Blotting-Kassetten, im E- lektroblotter Web M gleichzeitig bis zu 2 Blotting-Kassetten eingesetzt werden. Dabei ist zu beachten, dass sich die Transfereffizienz beim gleichzeitigen Blotten mehrerer Gele verringert und die Transferzeit evtl. erhöht werden muss, um das gleiche Transferergebnis wie beim Blotten nur eines Geles zu erzielen. Transferzeiten und -Bedingungen Transferzeiten müssen i. d. R. experimentell bestimmt werden, da sie von vielen Variablen abhängig sind. So spielen beispielsweise die Porengröße des Gels, Pufferzusammensetzung und ph-wert, Molekulargewichtsbereich und Ladung der Zielmoleküle, Temperaturbedingungen und die Art der Blotting- Membran eine Rolle. Zu Beginn der Etablierung eines Protokolls, sollten Sie ein Puffersystem auswählen und einen Pilotversuch zur Transfereffizienz starten, indem Sie einen Größenmarker vom Gel auf eine Membran Ihrer Wahl blotten. Um Transfereffizienzen zu optimieren, empfiehlt es sich, sowohl das Gel als auch die Membran im Anschluss einer allgemeinen Färbemethode zu unterziehen (für Proteine z. B. Coomassie- oder Silber-Färbung des Gels und Ponceau-Rot-Färbung der Membran) und mit einem i- dentischen, nicht-geblotteten Gel zu vergleichen. Anfangs sollten Sie niedrige Stromstärken bzw. Voltzahlen wählen und die Temperaturentwicklung während des Laufs beobachten. Bleibt die Temperatur konstant und ist der Transfer erfolgreich, kann die Stromstärke erhöht und die Transferzeit entsprechend verringert werden. Der Zusammenhang zwischen Stromstärke und Transferzeit ergibt sich aus der Formel: Stromstärke (ma) x Transferzeit (h) = Transferleistung (Milliampèrestunden) Unter 'EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER' finden Sie Angaben, anhand derer erste Transferbedingungen definiert werden können. PEQLAB_v0314_D 17

20 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter Power Supplies Für das Elektroblotten werden Power Supplies benötigt, die hohe Stromstärken und niedrige Voltzahlen liefern können. Einige Power Supplies haben Probleme, sehr niedrige Voltzahlen aufrecht zu halten. Lesen Sie in der Bedienungsanleitung nach, ob der Power Supply bei Werten unter 10 V arbeiten kann, da diese beim Elektroblotten häufig auftreten. Kontaktieren Sie den Hersteller Ihres Power Supplies, wenn Sie Fragen zu den Anwendungs- und Einstellmöglichkeiten Ihres Gerätes haben. Eine Auflistung der PEQLAB erhältlichen Power Supplies finden Sie unter 'TECHNISCHER SERVICE & BESTELLINFOR- MATIONEN'. Reinigung Puffertank mit Elektrodenplatten, Blotting-Kassetten und Fasermatten müssen nach jeder Benutzung gründlich gereinigt werden, um Salzrückstande zu entfernen. Verwenden Sie dazu bitte destilliertes Wasser oder ein mildes Reinigungsmittel. Lassen sie das System anschließend in offenem Zustand vollständig an der Luft trocknen. Zur Reinigung von Acrylglas dürfen weder Ethanol noch sonstige organische Lösungsmittel verwendet werden, da sonst Risse und Sprünge im Material entstehen können! PEQLAB_v0314_D 18

21 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter EMPFOHLENE TRANSFERBEDINGUNGEN & TRANSFERPUFFER Zusammenfassung geeigneter Transferbedingungen PerfectBlue Web S PerfectBlue Web M über Nacht 1 Stunde über Nacht 1 Stunde Towbin Puffer 25 bis 40 V 40 bis 80 ma 50 bis 100 V 200 bis 400 ma 25 bis 40 V 80 bis 160 ma 50 bis 60 V 200 bis 1250 ma Bjerrum Puffer 25 bis 40 V 40 bis 80 ma 50 bis 100 V 200 bis 400 ma 25 bis 40 V 80 bis 160 ma 50 bis 60 V 200 bis 1250 ma Dunn Puffer 10 V 40 bis 80 ma 40 bis 80 V 200 bis 500 ma 10 V 80 bis 160 ma 50 bis 60 V 200 bis 1300 ma Ausgehend von diesen Richtwerten sollten die jeweils optimalen Transferbedingungen für einzelne Applikation ermittelt werden (siehe ' Transferzeiten und -Bedingungen'). Transferpuffer Towbin Puffer (Towbin et al., 1979) Dieser häufig verwendete Puffer für den Proteintransfers aus Polyacrylamidgelen in Tankblottern kann mit oder ohne 0.05 bis 0.1% SDS angesetzt werden. Der Puffer sollte immer auf 4 C vorgekühlt und entgast werden, wobei das Entgasen vor einer evtl. Zugabe von SDS erfolgen sollte. 25 mm Tris, 192 mm Glycin, 5-20 % (v/v) Methanol, ph 8.3 Bjerrum-Puffer (Bjerrum & Schafer-Nielsen, 1986) 48 mm Tris, 39 mm Glycin, 5-20 % Methanol, ph 9.2 Dunn-Puffer (Dunn, 1986) 10 mm NaHCO 3, 3 mm NaCO 3, 20 % MeOH, ph 9.9 Blotting-Membran Für den Transfer von Proteinen können Nitrozellulose oder PVDF-Membranen verwendet werden. Nylonmembranen sind für Nukleinsäure-Transfers geeignet. Bei der Wahl der Blotting-Membran sollten außerdem die Erfordernisse anschließender Folgeanwendungen berücksichtigt werden. Angaben zu den von PEQLAB angeboten Blotting-Membranen finden Sie unter 'TECHNISCHER SERVICE UND BE- STELLINFORMATIONEN'. PEQLAB_v0314_D 19

22 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter TROUBLESHOOTING Problem Ursache Lösung geringe Transfereffizienz Braunfärbung der Membran oder Reißen des Gels nach dem Transfer Stromstärke ist zu niedrig Transferzeit zu kurz Der verwendete Power Supply ist für das Elektro-Blotting ungeeignet Transfersandwich wurde in falscher Abfolge zusammengesetzt bzw. falsch orientiert in Pufferkammer eingesetzt Der ph-wert des Transferpuffers liegt zu nahe am isoelektrischen Punkt des Proteins Zuviel Methanol im Transferpuffer Hochprozentige Gele verhindern einen Transfer der Moleküle Luftblasen in Fasermatten bzw. zwischen den einzelnen Lagen des Gelsandwich Überhöhte Wärmeentwicklung Membran war nicht vollständig angefeuchtet Erhöhen Sie die Stromstärke in dem unter 'Zusammenfassung geeigneter Transferbedingungen' angegeben Bereich. Verlängern Sie die Transferzeit. Viele Power Supplies sind für die Bedingungen beim Elektro-Blotting nicht ausgelegt und schalten sich ab. Es treten niedrige Spannungen (oft unter 10 V) und hohe Stromstärken auf. Prüfen Sie in der Anleitung Ihres Power Supplies, ob dieser für solche Bedingungen geeignet ist. Geeignete Power Supplies finden Sie unter 'TECHNISCHER SERVICE UND BESTELLINFORMATI- ONEN'. Häufigste Ursache für leere Membranen ist, dass die Membran nicht auf der Anodenseite des Gels platziert wurde. Halten Sie sich beim Zusammenbau des Gelsandwiches genau an die Anweisung. Verringern oder erhöhen Sie den ph-wert des Transfer-Puffers entsprechend. Reduzieren der Methanolmenge unterstützt die Elution der Proteine aus dem Gel, kann jedoch deren Bindung an Nitrozellulosemembranen verschlechtern. Höherprozentiges Acrylamid- oder Crosslinker können die Elution der Proteine aus den Gelen verhindern. Verwenden Sie für die Auftrennung der Proteine ein möglichst niedrig-konzentriertes Gel. Luftblasen unterbrechen das elektrische Feld, weshalb der Transfer an entsprechenden Stellen stark beeinträchtigt ist. Achten Sie beim Zusammenbau des Gelsandwich auf das Entfernen von Luftblasen. Evtl. wurde eine zu hohe Stromstärke gewählt (siehe 'Zusammenfassung geeigneter Transferbedingungen'). Machen Sie von der Möglichkeit Gebrauch, Ihre PerfectBlue Tankblotter zu kühlen. Die Membran muss immer den Herstellerangaben entsprechend äquilibriert und angefeuchtet werden. Weiße Flecken deuten auf trockene Stellen hin. PEQLAB_v0314_D 20

23 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter Problem Ursache Lösung Verschmierter oder verwirbelter Transfer sowie fehlende Banden Luftblasen verhindern vollständigen Kontakt zwischen Gel und Membran Gel und Membran sind vor oder während des Blottens zueinander verrutscht. Die elektrophoretischen Bedingungen waren nicht ideal Luftblasen zwischen Gel und Membran können mit einer Pipette vorsichtig herausgerollt werden, bevor die Filterpapiere obenauf gelegt werden. Dort wo sich Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran befinden, findet kein Transfer statt. Achten Sie bei Zusammenbau und Handhabung des Blotting-Sandwich darauf, dass die Membran und das Gel nicht verrutschen. Erhöhen Sie die Zahl der Filterpapiere falls die Fasermatten altersbedingt dünner geworden sind und der Gelsandwich nicht mehr fest in der Blotting-Kassette sitzt. Laufbedingungen, Probenvorbereitung, passende Acrylamidkonzentration des Gels und viele andere Variablen können die Laufeigenschaften und Auftrennungen der Moleküle beeinflussen. Überdenken Sie noch einmal alle Faktoren auch des dem Blot vorangegangen Experiments. Nitrozellulosemembranen Ungenügende Bindung der Proteine an die Membran PVDF-Membranen Verschmierter oder verwirbelter Transfer sowie fehlende Banden Protein wandert durch die Membran hindurch Zu wenig Methanol im Transferpuffer SDS verringert die Bindung Membran war vor dem Stapeln in den Gelsandwich bereits ausgetrocknet Membran wurde nicht in Methanol angefeuchtet Verwenden Sie Nitrozellulose mit einer Porengröße von 0.2 μm statt 0.45 μm oder verwenden Sie PVDF mit höherer Bindekapazität. Nitrozellulose hat die besten Bindeeigenschaften, wenn 20 % Methanol im Transferpuffer enthalten sind. Speziell für kleinere Proteine (<20 kda) ist die Verbesserung der Bindungseigenschaft durch Zugabe von Methanol von Bedeutung. Verwenden Sie Transferpuffer ohne SDS. Die Membran sollte komplett grau und leicht durchscheinend sein, wenn sie auf die Filterpapiere gelegt wird. Sollte sie bereits ausgetrocknet sein, muss sie mit Methanol wieder angefeuchtet und in Transferpuffer äquilibriert werden. PVDF ist hydrophob und erfordert ein kurzes Äquilibrieren in Methanol vor dem Transfer. PEQLAB_v0314_D 21

24 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter TECHNISCHER SERVICE UND BESTELLINFORMATIONEN Bei technischen Fragen kontaktieren Sie uns bitte unter +49 (0) oder per an Ausführliche Informationen zu unseren Produkten finden Sie in unserem aktuellen Produktkatalog, den wir Ihnen auf Wunsch gerne zusenden oder unter PerfectBlue Tank-Elektroblotter Artikel Beschreibung Bestell-Nr. Web S vollständiges System für Gele bis 8.5 x 9.5 cm 52-WEB-10 Web M vollständiges System für Gele bis 18 x 20 cm 52-WEB-20 Blotting-Kassetten für Web S, 1 Kassette inkl. 2 Fasermatten 52-WEB-SC für Web M, 1 Kassette inkl. 2 Fasermatten 52-WEB-MC Fasermatten für Web S, 4 Matten 10 x 12.5 cm 52-WEB-SF für Web M, 4 Matten 18 x 24.5 cm 52-WEB-MF Power Supplies Für das Blotten von Proteinen sind insbesondere die Modelle EV261, EV202, E250 und EV231 geeignet. Bei Bedarf beraten wir Sie gerne ausführlich, welcher Power Supply für Ihre Anwendung geeignet ist. Artikel Anschlusspaare Max. Spannung (V) Stromstärke (ma) Leistung (W) Bestell-Nr. EV EV222 1) E E V 2) EV EV245 1) EV EV231 1) EV EV265 1) E E V 2) EV EV202 1) EV EV261 1) EV EV215 1) EV EV232 1) EV EV233 1) EV EV262 1) 1) Nicht verfügbar für Kunden in den USA. 2) Für eine 110V US-Variante ersetzen Sie bitte 230V mit 110V in der Bestell-Nummer. Blotting-Membranen 1) Artikel Porendurchmesser Menge Bestell-Nr. Nitrozellulose-Membran 0.20 μm 0.30 x 3.0 m Rolle Nylon-Membran 0.45 μm 0.30 x 3.0 m Rolle PVDF-Membran 0.20 μm 0.30 x 3.0 m Rolle PVDF-Membran 0.20 μm 0.26 x 3.3 m Rolle ) Nicht verfügbar für Kunden in den USA. PEQLAB_v0314_D 22

25 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter LITERATUR Ausubel, F.M. et al, (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 10. Vol.2, Green Publishing Associates Inc. and John Wiley and Sons, Inc. Bjerrum, O.J. and Schafer-Nielsen, C. (1986) in: Dunn, J.J. (ed.) Electrophoresis 86 VCH Weinheim, pp Die Autoren vergleichen Ergebnisse bei der Verwendung unterschiedlicher Puffersysteme (Towbin Puffer vs. 3-Puffer-System). Dunn, S.D. (1986). Effects of the modification of transfer buffer composition and the renaturation of proteins in gels on the recognition of proteins on Western Blots by monoclonal antibodies, Anal. Biochem. 157, Sambrook, J., Fritsch, E.F. Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Towbin, J., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoresis transfer of proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 76, PEQLAB_v0314_D 23

26 Bedienungsanleitung PerfectBlue Tank-Elektroblotter NOTIZEN PEQLAB_v0314_D 24

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28 D AT UK USA PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Freecall (D): , PEQLAB Biotechnologie GmbH, 6404 Polling, Tel: +43 (0) , PEQLAB Ltd., Southampton SO31 7ZN, Freephone (UK): , PEQLAB LLC, Wilmington, DE 19810, Toll-Free (US): , Creating the future together.