Das Wachstumsverhalten von Spiralganglienneuriten auf alloplastischen Materialien

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1 Aus der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und Kopf- und Halschirurgie am St. Elisabeth-Hospital Bochum -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. S. Dazert Das Wachstumsverhalten von Spiralganglienneuriten auf alloplastischen Materialien Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Stefan Hansen aus Lübeck 2006

2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. S. Dazert Korreferent: Priv.-Doz. Dr. med. R. Keerl Tag der Mündlichen Prüfung:

3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Anatomie und Funktion des peripheren Hörapparates Formen der Schwerhörigkeit Therapieansätze bei sensorineuraler Schwerhörigkeit Hörgeräteversorgung Cochlea-Implantat und Hirnstamm-Implantat Probleme und Verbesserungsmöglichkeiten der Cochlea-Implantat-Versorgung Alloplastische Materialien Neurotrophe Faktoren Ziel der Arbeit 12 2 Material und Methoden 2.1 Beschichtung der Zellkulturschalen und Kulturmedium Anatomische Mikropräparation Organotypische Spiralganglien-Zellkultur Fixieren und Färben der Spiralganglienneuriten Materialeigenschaften Lichtmikroskopie Vermessung der Spiralganglienneuriten Testverfahren und Statistik Rasterelektronenmikroskopie 19

4 3 Ergebnisse 3.1 Allgemeines Wachstumsverhalten Anzahl der Tiere und Explantate Histomorphometrische Auswertung Längenwachstum der Spiralganglienneuriten Anzahl der auswachsenden Spiralganglienneuriten Rasterelektronenmikroskopische Auswertung Materialoberflächen Wachstumsverhalten der Spiralganglienneuriten 30 4 Diskussion 4.1 Wachstumsverhalten neuronaler Zellen auf Fremdmaterialien Einfluss der Oberflächenstruktur Einfluss von Adhäsionsmolekülen Einfluss nicht-neuronaler Zellen Klinische Bedeutung der vorliegenden Ergebnisse und Ausblick 42 5 Zusammenfassung 45 6 Literaturverzeichnis 47

5 1 Einleitung 1.1 Anatomie und Funktion des peripheren Hörapparates Das äußere Ohr besteht aus der Ohrmuschel und dem äußeren Gehörgang. Es fängt den Schall auf und leitet ihn an das Trommelfell. Diese feine Membran bildet die Grenze zum luftgefüllten Mittelohr. Die ankommenden Schallwellen versetzen das Trommelfell in Schwingungen, welche dann über die gelenkig verbundene Gehörknöchelchenkette (Hammer, Amboß und Steigbügel) auf das flüssigkeitsgefüllte Innenohr (Cochlea) am ovalen Fenster übertragen wird (Abb. 1). Die Gehörknöchelchen fungieren dabei als Impedanzwandler durch eine Übertragung des Schalls von einem Medium mit niedrigem Wellenwiderstand (Luft) zu einem mit hohem Wellenwiderstand (Flüssigkeit). Gehörknöchelchenkette N. vestibulocochlearis Cochlea Ohrmuschel Abb. 1: Übersicht des peripheren Hörorgans mit äußerem Ohr, Mittelohr und Innenohr. (nach F. Netter, The (Ciba) collection of medical illustrations, 1978) 1

6 Die Cochlea besteht aus einer knöchernen Längsachse, dem Modiolus, und zweieinhalb korkenzieherartigen Windungen des Canalis spiralis cochleae, die gegen den Uhrzeigersinn nach lateral um den Modiolus herum zur Schneckenkuppel, Cupula cochleae, laufen. Innerhalb des knöchernen Canalis spiralis cochleae befinden sich drei tubuläre Kompartimente, die Scala vestibuli und Scala tympani, welche beide mit Perilymphe gefüllt sind, sowie die Scala media (Ductus cochlearis), die Endolymphe enthält. Perilymphe ist eine extrazelluläre Flüssigkeit mit einem hohen Na + - und einem niedrigen K + -Gehalt, die dem Liquor ähnelt, im Gegensatz zu der intrazellulären Endolymphe mit einer niedrigen Na + - und einer hohen K + -Konzentration. Die perilymphatischen Scalae kommunizieren über das Helicotrema an der Schneckenspitze, während der Ductus cochlearis am Apex der Schneckenspitze blind endet. Die Form des Ductus cochlearis erinnert in seinem Querschnitt an ein Dreieck, dessen Begrenzungen die Basilarmembran mit der Lamina spiralis osseae, die Reissnermembran und die laterale Duktuswand bilden. Die Basilarmembran trennt den Ductus cochlearis von der Scala tympani. Auf ihr befinden sich von außen nach innen der Sulcus spiralis externus mit den Boettcher- und Claudiuszellen, das Cortische Organ sowie der Sulcus spiralis internus mit den inneren Sulcuszellen (Abb. 2). Das Cortische Organ besteht aus den Grenzzellen, den inneren Phalangenzellen, einer Reihe innerer Haarzellen, den inneren und äußeren Pfeilerzellen, die den Cortischen Tunnel aufbauen, den Deiterszellen, die als Stützzellen für die drei Reihen äußerer Haarzellen dienen, den Nuelräumen und den Hensenszellen. Das Cortische Organ wird von der Tektorialmembran überspannt, die vom Limbus spiralis medial des Cortischen Organs auf der Basilarmembran entspringt. Die äußeren Haarzellen besitzen an ihrer apikalen Membran Reihen von Stereozilien, die mit ihren Enden an der Unterseite der Tektorialmembran anheften. Die Schwingungen der Membran am ovalen Fenster führen zu einer wellenförmigen Volumenverschiebung der Perilymphe. Die Steife der Basilarmembran nimmt von dem ovalen Fenster zum Helicotrema ab, so dass Fortpflanzungsgeschwindigkeit und Wellenlänge abnehmen, während die Amplitude zunehmend größer wird. Es entsteht ein für jede Frequenz spezifisches Amplitudenmaximum dieser sogenannten Wanderwelle, welches sich an einem bestimmten Ort der Basilarmembran abbildet (Tonotopie). 2

7 Die Schwingungen des Endolymphschlauches verursachen eine Verschiebung der Tektorialmembran gegenüber der Basilarmembran. Diese Relativbewegungen führen wegen des direkten Kontakts der Haarzellstereozilien der äußeren Haarzellen mit der Tektorialmembran zu einer Abscherung der Zilien. Die folgende Depolarisation stellt den adäquaten Reiz für die Haarzellen dar und löst deren elektrische Erregung aus (mechanoelektrische Transduktion). Dabei kommt den drei Reihen äußerer Haarzellen die Aufgabe der Signalverstärkung durch eine Auslenkung der Tektorialmembran zu. Auch leise bis mittlere Töne führen so zu einer Stimulierung der inneren Haarzellen, die das eigentliche sensorische Signal produzieren. Medial des Cortischen Organs erstrecken sich in einem knöchernen Kanal, dem Rosenthalkanal, die bipolaren Spiralganglienzellen. Man unterscheidet zumindest zwei Typen von Spiralganglienzellen. Typ I-Ganglienzellen (95 %) erreichen mit ihren peripheren dendritischen Neuriten die inneren Haarzellen. Dabei bilden sie Bündel von myelinisierten Fasern, die eine innere Haarzelle kontaktieren. Jede Typ II-Ganglienzelle (5 %) hingegen ist über unmyelinisierte Dendriten mit äußeren Haarzellen verbunden. Die Axone der bipolaren Spiralganglienzellen leiten als Nervus cochlearis die akustischen Informationen zum Nucleus cochlearis weiter. Von hier aus gelangen die Informationen zu den zentralen auditorischen Kerngebieten. Neben dieser afferenten Innervation des Cortischen Organs existiert auch eine efferente Innervation, deren endgültige Bedeutung jedoch noch nicht abschließend aufgeklärt ist. 3

8 Abb. 2: Schematische Abbildung eines Querschnittes durch den Ductus cochlearis. IHZ = innere Haarzellen, ÄHZ = äußere Haarzellen, DZ = Deiterszellen, HZ = Hensenzellen, BZ=Boetcherzellen, CZ = Claudiuszellen, IPZ = innere Pfeilerzellen, ÄPZ = äußere Pfeilerzellen, CT = Cortischer Tunnel, TR = Tunnelradiärfasern, IS = innerer Sulcus, L= Limbus spiralis, IZ = Interdentalzellen, TM = Tektorialmembran, SGZ = Spiralganglienzellen, RM = Reissnermembran, SV = Stria vascularis, PS = Prominentia spiralis, LS = Ligamentum spirale, LB = Lamina basilaris (nach Schuknecht, 1993) 4

9 1.2 Formen der Schwerhörigkeit Es existieren verschiedene Formen der Schwerhörigkeit. Neben den durch Veränderungen des Schallleitungsapparates hervorgerufenen Schallleitungsschwerhörigkeiten, welche in vielen Fällen durch eine chirurgische Therapie behandelbar sind, gibt es die sogenannten Schallempfindungsschwerhörigkeiten. Schallleitungsschwerhörigkeiten können durch Veränderungen des äußeren Ohres oder des Mittelohres hervorgerufen werden. Führend sind hierbei die Funktionsstörungen der Gehörknöchelchenkette. Dabei kommt es häufig zu einer Fixierung der Kette mit nachfolgender Herabsetzung der Schwingungsfähigkeit derselben. Die Schallempfindungsschwerhörigkeiten sind kausal-therapeutisch nur schwer zugängliche Hörstörungen und betreffen den sensorischen Abschnitt der Hörbahn sowie weiter zentral gelegene neuronale Strukturen. Ein Großteil dieser auch als sensorineuralen bezeichneten Hörstörungen betrifft das Cortische Organ des Innenohres, das die inneren und äußeren Haarzellen beherbergt. Die Haarzellen reagieren sehr empfindlich auf verschiedene Einflüsse wie Durchblutungsstörungen, Lärm, Medikamente, Alterung, oder sie können durch genetische Defekte fehlgebildet sein [5, 36, 46]. Da sich die Haarzellen der Cochlea im Säugetierohr nach derzeitigem Wissensstand unter physiologischen Bedingungen nicht regenerieren können, führt eine Haarzellschädigung zu einem in Abhängigkeit vom Ausmaß der Schädigung irreversiblen Hörverlust des betroffenen Ohres. Sekundär kommt es zu einer Degeneration der Spiralganglienneuriten, welche die akustischen Signale zu höheren neuronalen Zentren weiterleiten [56]. 1.3 Therapieansätze bei sensorineuraler Schwerhörigkeit Hörgeräteversorgung Eine geeignete und etablierte Behandlung der mittel- bis hochgradigen cochleären Hörminderung stellt die Versorgung betroffener Patienten mit konventionellen 5

10 Hörgeräten dar. Unterschieden werden grundsätzlich Luftleitungs- und Knochenleitungshörgeräte. Erstere können hinter dem (HdO-Gerät) oder im Ohr (io-geräte) getragen werden. Für geeignete Fälle stehen inzwischen auch implantierbare Hörgeräte zur Verfügung. Bei den konventionellen und implantierbaren Hörgeräten handelt es sich um sogenannte Amplifier-Implantate, die bei nur teilweise geschädigten Haarzellen die cochleäre Verstärkerleistung ersetzen. Die Schallverstärkung ist in diesen Fällen bei genügender Restfunktion des Innenohres ausreichend. Bei höchstgradigen Schwerhörigkeiten und cochleärer Taubheit sind jedoch auch diese Systeme nicht mehr ausreichend, so dass die Funktion der inneren und äußeren Haarzellen ersetzt werden muss. Dies geschieht mit Hilfe einer in die Hörschnecke eingeführten Elektrode, dem sogenannten Cochlea-Implantat Cochlea-Implantat und Hirnstamm-Implantat Das Cochlea-Implantat (CI) kann als künstliche Hörschnecke angesehen werden und besteht aus extra- und intrakorporal getragenen Anteilen, die im Zusammenspiel dem versorgten Patienten eine Schallwahrnehmung und damit ein Sprachverständnis vermitteln [8, 12, 39, 47]. Der Schall wird über ein Mikrophon an einen Sprachprozessor weitergeleitet, der die akustischen Signale in elektronische Impulse umwandelt und an eine extrakorporale Spule weiterleitet. Ein elektronischer Empfänger wird im Os temporale des Patienten implantiert, der die elektronischen Impulse transkutan aufnehmen kann. Von hier aus gelangen die Impulse zu einer Stimulationselektrode (CI-Elektrode), die - eingeführt in die Scala tympani der Cochlea - den Nucleus cochlearis und das Ganglion spirale unter Umgehung des defekten Haarzellapparates des Cortischen Organs stimuliert. Anders als ein Hörgerät, welches weitgehend eine Schallverstärkung bewirkt und somit auf die Weiterleitung und Umwandlung des Schalls im Ohr angewiesen ist, wird durch das CI der Schall transduziert und direkt der weiteren neuronalen Verarbeitung zugänglich gemacht. Mit den wachsenden Kenntnissen über die neuronale Sprachverarbeitung sowie Verbesserung der Technik und Verkleinerung der CI-Geräte finden diese 6

11 insbesondere seit den 80er Jahren zunehmend Verbreitung bei der Behandlung von Patienten mit ausgeprägter Innenohrschwerhörigkeit und cochleärer Taubheit [9, 32, 39]. Aber auch schon taubgeborene Kinder profitieren von der Implantation im frühen Kindesalter [39]. Hierdurch werden Sprachverständnis und Spracherwerb möglich. Liegt die Ursache der Schwerhörigkeit im Bereich des Hörnervs, so besteht die Möglichkeit, ein sogenanntes Hirnstamm-Implantat (engl. auch ABI, Auditory Brainstem Implant) einzusetzen. Dieses gibt die Impulse direkt an den Nucleus cochlearis weiter Probleme und Verbesserungsmöglichkeiten der Cochlea-Implantat- Versorgung Von den Haarzellen ausgeschüttete parakrin wirkende neurotrophe Faktoren wie auch durch Signaltransduktion des Schalls entstehende elektrische Reize gelten als Stimulatoren der auswachsenden Neuriten der Spiralganglien [26, 42]. Auch die Zahl der überlebenden Spiralganglien korreliert negativ mit der Dauer des Hörverlustes und auch der Dauer der Taubheit [43]. Der Wegfall dieser Faktoren bei Haarzelluntergängen ist vermutlich ein Faktor der sekundären Degeneration der Spiralganglienneuriten und schließlich auch der Spiralganglien selbst [56]. So ist eine hochgradige sensorineurale Schwerhörigkeit definiert als Hörverlust ab 60 db typischerweise mit einem Untergang der peripheren Fortsätze der Spiralganglien assoziiert [43, 50, 57, 67, 68]. Mit zunehmender Dauer des Hörverlustes bei Erwachsenen wie auch bei Kindern verschlechtert sich das erreichbare Sprachverständnis für die Patienten nach einer CI-Implantation, weshalb eine frühzeitige Implantation sinnvoll ist [12]. Die damit verbundene lange Tragedauer von Kindheit an erfordert eine besonders gute Biokompatibilität der CI-Materialien. Ein weiterer Aspekt, der im Interesse der aktuellen Forschung steht, ist eine Verringerung des Abstandes zwischen Elektrode und neuralem Gewebe. Die Distanz der Scala tympani parallel zur Basilarmembran beträgt beim erwachsenen Menschen etwa 1,5 mm [30, 70], wobei der Durchmesser einer CI-Elektrode je nach Modell an der Spitze ca. 0,4 mm und an der Basis ca. 0,8 mm beträgt. 7

12 Histologische Studien haben gezeigt, dass die in der Scala tympani implantierte CI-Elektrode meist entlang der äußeren Wand der Scala tympani unterhalb des Ligamentum spirale zum Liegen kommt [25, 27, 61]. Dadurch entsteht zwischen der CI-Elektrode und den Spiralganglien bzw. deren Neuriten ein Abstand von mehr als 1 mm. CI-Elektroden, die mit einem sogenannten Positionierer kombiniert sind, führen zu einer räumlich engeren Ankopplung der Elektrode an die jeweilige Spiralganglien-Population. Die Elektrode wird dabei während der Insertion mit einem drahtähnlichen Positionierer dicht an den Modiolus und damit auch an die Spiralganglien gebracht [25, 33, 37, 64]. Dieser Vorteil wird jedoch von der schwierigeren chirurgischen Handhabung begleitet. Zudem kommt es bei dieser Manipulation zu einer stärkeren Traumatisierung des sensorischen Epithels, der Spiralganglien und der weiteren angrenzenden Strukturen [64]. Die Komplikation einer Meningitis ist zusätzlich erhöht [16, 48]. Weiterhin existiert ein CI-Modell, bei dem nach dem Einführen der Elektrode in die Cochlea ein innerhalb der Elektrode liegender Stift herausgezogen wird. Daraufhin wird eine dem Modiolus zugewandte mechanische Spannung wirksam, so dass sich die Elektrode um den Modiolus windet [65]. Die Distanz zwischen der CI-Elektrode und den Nervenzellen bringt einige physikalische Nachteile mit sich. So stimuliert die Elektrode bei der Übertragung ihrer Impulse eine verhältnismäßig große Population von Spiralganglien. Natürlicherweise wird bei etwa 15 Nervenfasern pro innerer Haarzelle in der zweiten Windung und nur 3-4 Nervenfasern an Basis und Apex der Cochlea [57] ein ganz spezifischer, tonotoper Bereich angeregt. Im Gegensatz dazu kann eine CI-Elektrode mit bis zu 22 Einzelelektroden innerhalb des Silikonträgers nur sehr weit gefasste, sich z.t. überschneidende Bereiche stimulieren [34]. In anderen Versuchen konnten elektrische Stimulationen unmyelinisierter Neuriten und damit fortgeleitete Aktionspotentiale erzeugt werden. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass es in vitro möglich ist, Potentiale von Neuriten einzelner Nervenzellen abzuleiten, wobei jede einzelne Nervenzelle individuell stimuliert wurde [38]. Durch die Induktion eines zielgerichteten Auswachsens der Spiralganglienneuriten an die CI-Elektrode wäre somit eine selektive Stimulation von kleinen Spiralganglien-Populationen möglich. Eine Annäherung der Elektroden an die Spiralganglien leitet die Signale an eine kleine definierte Population von Spiralganglien weiter, was für die Diskriminierung des Hörens 8

13 eine wichtige Rolle spielt. Eine niedrigere Hörschwelle sowie angenehmeres Hörempfinden korrelieren positiv mit einer geringeren Distanz zwischen Elektrode und Neuronen. Zusätzlich verringert sich der Stromverbrauch des CI. [34, 53]. Ein Ziel zur Verbesserung des CI-Elekrodendesigns ist demnach eine möglichst atraumatische Distanzüberbrückung innerhalb der Scala tympani. 1.4 Alloplastische Materialien Um eine direkte Anbindung einer CI-Elektrode an die Spiralganglienneuriten der Cochlea zu erreichen, sind neben dem Einsatz von neurotrophen Wachstumsfaktoren auch die Materialien, die bei der Verarbeitung der Elektrode verwendet werden, von Bedeutung. Eine Vielzahl verschiedener Materialien wird in unterschiedlichen Bereichen der Medizin bereits seit den frühen 1950er Jahren im menschlichen Körper eingesetzt. Als Biomaterial gilt dabei jedweder Stoff, der kein Medikament ist, oder eine Kombination von Stoffen, natürlichen oder synthetischen Ursprungs, die für unbestimmte Zeit als Ganzes oder Teil eines Systems Gewebe, Organe oder Funktionen unterstützt, verstärkt oder ersetzt [45]. Je nach Funktion und Einsatzgebiet werden unterschiedliche Materialien verwendet. Eine gemeinsame Voraussetzung für die Implantation dieser Fremdmaterialien ist jedoch die sogenannte Biokompatibilität, welche die Reaktionen des umgebenden Gewebes erfasst, sowie mechanische, physikalische und chemische Veränderungen der Materialeigenschaften im jeweiligen Organsystem und die durch Degradierung entstehenden lokalen und systemischen Effekte. Weitere Anforderungen an Implantate umfassen für den jeweiligen Verwendungszweck geeignete mechanische und funktionelle Eigenschaften wie beispielsweise Elastizität, Formbarkeit, Härtegrad oder elektrische Leitfähigkeit [44]. Im Bereich der knochenverankerten Implantate sind bereits etablierte invitro-modelle beschrieben [69]. Zu den am besten untersuchten Materialien gehören Titan und seine Verbindungen, für welches zahlreiche auf Bindegewebs- und Knochenzellen basierende Kultursysteme existieren [31, 49]. In der Otologie hat Titan bereits in der Mittelohrchirurgie zur Rekonstruktion der Gehörknöchelchenkette und bei der Stapeschirurgie Einzug erhalten. An Kaninchen konnte die gute Biokompatibilität 9

14 für das Mittelohr nachgewiesen werden [51, 52]. Inzwischen haben sich Titanprothesen bei Rekonstruktionen des Schallleitungsapparates weitgehend etabliert, da sie neben ihrer guten Biokompatibilität viele weitere Vorraussetzungen für einen geeigneten Einsatz in der Ohrchirurgie erfüllen, wie beispielsweise individuelle Anpassung, geringes Gewicht und Stabilität. Weitere Werkstoffe aus der Gruppe der Metalle, die in der Implantologie eingesetzt werden, sind Gold und Edelstahl. Das Elektrodenmaterial des CI besteht zumeist aus Platin oder Iridium und ist in einen Silikonträger eingefasst. Das medizinisch eingesetzte Silikon ist eine Polymer des Dimethylpolysiloxan, welches ebenfalls in vielen Bereichen der Medizin nicht nur als Elektrodenträgermaterial eingesetzt wird, sondern beispielsweise auch als Leitstruktur bei der Regeneration von Nervenfasern [18, 71]. Die große Elastizität und Verformbarkeit, sowie die isolatorischen und nichtmetallischen Eigenschaften sind die Voraussetzungen als Trägermaterial der CI- Elektrode. 1.5 Neurotrophe Faktoren Wachstumsfaktoren sind multifunktionelle Proteine, die in verschiedenen Geweben Wachstum, Reifung und Reparationsprozesse regulieren [6, 29]. Zu ihnen gehören verschiedene Gruppen, wie etwa die Neurotrophin-Familie, die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-(FGF)-Familie oder die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (Insulin-like growth factors, IGFs). Viele Faktoren aus diesen Familien haben einzeln oder in Kombination entscheidende Bedeutung für das auditorische System. In verschiedene Studien konnte gezeigt werden, dass Wachstumsfaktoren wie Neurotrophin-3 (NT-3), Fibroblastenwachstumsfaktor-1 (FGF-1) oder Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) das Auswachsen und Überleben von Spiralganglienneuriten erhöhen [19, 26, 31, 41, 42]. Einem für Spiralganglien geeignetem Nährmedium hinzugefügtes NT-3 führt in vitro zu signifikant erhöhter Neuritenaussprossung und gesteigertem Längenwachstum von Spiralganglienneuriten bei neugeborenen Ratten [1, 42]. Substanzen der extrazellulären Matrix stellen neben Wachstumsfaktoren weitere Moleküle dar, die insbesondere im embryonalen Nervengewebe für ein korrektes 10

15 Aussprossen von Neuriten verantwortlich sind. Das zielgerichtete Auswachsen von Spiralganglienneuriten beruht vermutlich auf dem Zusammenspiel mehrerer Faktoren, bei dem auch Adhäsionsmoleküle wie Laminin ihren Anteil haben, ebenso wie Faktoren und Rezeptoren, die eine Repulsion der Neuriten bzw. ihrer Wachstumskegel bewirken wie beispielsweise Cadherine oder Ephrine [2, 3, 11]. In jüngerer Zeit mehren sich die experimentellen Ansätze, neurotrophe Wachstumsfaktoren klinisch-therapeutisch einzusetzen. Mögliche Applikationswege sind eine adenovirale Transfektion, eine direkte Gewebeapplikation oder eine Beschichtung von intracochleären Implantaten [20, 58]. Unter dem Aspekt der gezielten Neuritenstimulation von Spiralganglien bieten diese Techniken weitere Verbesserungsmöglichkeiten der Effizienz von CI- Systemen. 11

16 1.6 Ziel der Arbeit Der Einfluss verschiedener Materialien auf das Wachstumsverhalten der Neuriten hat entscheidende Bedeutung für das Design zukünftiger CI-Elektroden, da durch eine ausgewählte Materialkomposition die zuvor genannte Annäherung der Spiralganglienneuriten optimiert werden kann. Die Biokompatibilität der erwähnten Materialien in Bezug auf Spiralganglien der Cochlea ist bisher nicht beschrieben worden, ebenso wenig wie die biologische Verträglichkeit von Spiralganglien mit dem Elektrodenmaterial aus Platin. In dieser Arbeit wurden anhand von Spiralganglien-Zellkulturen die Biokompatibilitäten von Titan, Gold, Edelstahl, Platin und Silikon untersucht. Hierfür wurde ein Zellkultursystem von Spiralganglien aus der Cochlea von Ratten angewendet. Dieses ist, wie bereits erwähnt, ein etabliertes Untersuchungsmodell für zahlreiche Fragestellungen in Hinblick auf Entwicklung, Wachstum und Schädigungsmuster des ersten Neurons der Hörbahn beim Säugetier [55, 66]. Das Wachstumsverhalten der Neuriten bzw. das Überleben der Spiralganglien gibt Aufschluss über die erzeugten Wachstumsbedingungen oder direkte schädigende Einflüsse festgelegter Zellkulturbedingungen. In der vorliegenden Arbeit wurde dem Kulturmedium der Wachstumsfaktor Neurotrophin-3 hinzugefügt und eine Beschichtung der alloplastischen Materialien mit Laminin und Poly-D-Lysin vorgenommen. Neben der Überlebensrate der Spiralganglien auf den unterschiedlichen Materialien wurde auch die direkte quantitative Wirkung auf die Neuritenaussprossung metrisch bestimmt. Weiterhin wurde anhand von rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der kultivierten Spiralganglien auf den Materialien eine detailliertere Analyse der Anheftung der Neuriten auf den verschiedenen Oberflächen sowie deren Interaktion mit nicht-neuronalen Zellen durchgeführt. 12

17 2 Material und Methoden 2.1 Beschichtung der Zellkulturschalen und Kulturmedium Alle Oberflächen wurden vor dem Einsetzen der Spiralganglien-Explantate mit zwei verschiedenen Adhäsionsmolekülen beschichtet. Diese dienten der besseren Anheftung der Spiralganglien-Explantate auf den jeweiligen Oberflächen. Hierfür wurden das synthetische Poly-D-Lysin (BD Bioscience, USA) in einer Konzentration von 10 mg/ml in Dulbecco s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) (GibcoBRL, Schottland) und das extrazelluläre Matrixprotein Laminin (BD Bioscience, USA) in einer Konzentration von 1 mg/ml in D-PBS verwendet. Die Vertiefungen der Kulturplatten wurden zunächst mit je 150 µl Poly-D-Lysin gefüllt und anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach sorgfältigem Spülen mit der zehnfachen Menge D-PBS wurde die Kulturplatte mit 150 µl Laminin beschichtet und für eine weitere Stunde bei 37 C, einer Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2 -Atmosphäre inkubiert. Die Kulturplatten wurden wiederum mit D-PBS gespült und daraufhin mit Spiralganglien-Medium beschichtet. Dieses bestand aus DMEM (Dulbecco s modified Eagles medium), 25 mm Hepes-Puffer, 1 µl/ml N2-Supplement, 10 µg/ml Insulin, 6,15 g/l Glucose (30 % Glucose in D-PBS [Dulbecco`s phosphatgepufferte Kochsalzlösung]) sowie 30 U/ml Penicillin (Penicillin Grünenthal 1 Mega in D-PBS). Diesem Medium wurde anschließend Neurotrophin-3 als humaner rekombinanter Wachstumsfaktor (RBI, USA) in einer Konzentration von 25 ng/ml hinzugefügt. Bis zum Einsetzen der Spiralganglien-Explantate wurden die so vorbereiteten Zellkulturschalen bei 37 C, einer Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2 aufbewahrt. 2.2 Anatomische Mikropräparation Die Mikropräparation der Cochlea erfolgte nach den Beschreibungen von Van De Water und Ruben [66] und Sobkowicz et al. [55]. Es wurden Ratten vom Typ Sprague-Dawley (Charles River, Sulzfeld) im Alter von fünf Tagen (P5) 13

18 verwendet. Um Spiralganglien-Explantate für die organotypischen Zellkultur zu erhalten, musste eine sterile Explantationstechnik gewährleistet sein und eine Kontamination des Zielgewebes verhindert werden. Daher wurden die Haut über dem Operationsgebiet sowie die benötigten Instrumente zur Präparation mit Alkohol sterilisiert. Zur Cochleapräparation wurden neue Instrumente benutzt. Nach Anästhesie mit intraperitonealer Gabe von 0,4 ml pro 100 g Körpergewicht eines Gemisches aus Ketamin 12,5 mg/ml, Rompin 1,26 mg/ml und Acepromezin 0,25 mg/ml erfolgte die Dekapitation des Tieres. Die Haut über dem Schädelknochen wurde entfernt und mit Ansatz im Foramen magnum der Schädel in longitudinaler Richtung entlang der Mittellinie in zwei Hälften gespalten. Das Hirngewebe wurde extrahiert und die Schädelhälften zur Weiterverarbeitung in eine Petrischale mit D-PBS gelegt. Von hieran erfolgte die Präparation unter Zuhilfenahme eines Operationsmikroskops (OPMI 1, Zeiss, Oberkochen). Als Landmarke innerhalb der Schädelhälfte diente der Sinus petrosus inferior, ein U-förmiges Venensystem, welches das Felsenbein begrenzt. Mit der Spitze einer Pinzettenbranche ließ sich von hier das Felsenbein vorsichtig vom umgebenden Schädel isolieren. Nach Entfernung der noch nicht vollständig verknöcherten Kapsel stellte sich die gesamte Cochlea dar. In eine neue Petrischale übertragen, wurden nun von außen nach innen die Stria vascularis und die Haarzellschicht mit der Spitze einer feinen Pinzette vorsichtig in Richtung Schneckenspitze abgezogen, wobei die Spiralganglienschicht mitsamt dem Modiolus übrig blieb. Nachdem die Spiralganglienschicht in gleicher Weise mit einer feinen Pinzette vom Modiolus separiert worden war, erfolgte das Schneiden des Explantats in gleich große Stücke von etwa µm mit Hilfe eines Skalpells in einer mit D-PBS gefüllten Petrischale. 2.3 Organotypische Spiralganglien-Zellkultur Nach der Aufteilung der Spiralganglien-Explantate wurden diese in die Zellkulturschale übertragen. Hierfür wurde jedes Stückchen zwischen den Branchen einer feinen Pinzette in einem Tropfen D-PBS in die Vertiefung der vorbereiteten Zellkulturschale gelegt. Dabei war darauf zu achten, dass das 14

19 Explantat möglichst zentral innerhalb der Vertiefung lag, da hier der Flüssigkeitsspiegel des Mediums die optimale Höhe hatte. Bei den Kontrolluntersuchungen der Explantate ohne Fremdmaterialien wurde daher jede Vertiefung mit 75 µl Kulturmedium gefüllt. Die Kulturschalen mit Gold, Titan und Edelstahlplättchen benötigten 45 µl Kulturmedium, jene mit Silikon vorbereiteten Kulturschalen 30 µl Medium. Nach Einsetzen des Explantats auf die beschriebene Weise streifte nun der Flüssigkeitsmeniskus gerade den oberen Rand des Explantats. So wurde das Aufschwimmen der Probe verhindert, gleichzeitig war sie jedoch ausreichend mit Medium versorgt. Alle Proben wurden für 72 Stunden im Brutschrank bei 37 C, 5 % CO 2 und 95 % Luftfeuchtigkeit aufbewahrt. 2.4 Fixieren und Färben der Spiralganglienneuriten Nach der Inkubation der Spiralganglien-Zellkulturen für 72 Stunden wurde das Medium vorsichtig abgesaugt. Mit 150 µl eines Gemisches aus Aceton (100 %) und Methanol (100 %) im Verhältnis 1:1 wurden die Explantate in der Kulturschale für etwa fünf Minuten fixiert. Das Fixans wurde wiederum abgesaugt und die Kulturschalen zweimal mit je 300 µl D-PBS gespült. Vor der anschließenden Neurofilamentmarkierung und Färbung konnten die so fixierten Spiralganglien-Explantate bei 4 C in 300 µl D-PBS in der Zellkulturschale aufbewahrt werden. Die Neurofilamentmarkierung erfolgte mit dem Vectastain Elite ABC-Kit, Maus IgG (Vektor Laboratories, Kanada). Der Puffer wurde zunächst abgesaugt und die Spiralganglien-Explantate für eine Stunde bei 37 C in 150 µl des monoklonalen Antikörper RT 97 inkubiert, welcher für das 200 kda Neurofilamentprotein in den Spiralganglien-Neuronen spezifisch ist. RT 97 wurde in dem Verhältnis 1:500 in Normalserum verwendet. Nach Spülen mit D-PBS erfolgte die Inkubation mit einen zweiten biotinylierten Antikörper in Normalserum im Verhältnis 1:2000 für dreißig Minuten bei Raumtemperatur. Es erfolgte wiederum eine Spülung mit D- PBS, wonach 150 µl Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (ABC-Komplex) 15

20 hinzugefügt wurde. Mit diesem wurden die Proben ebenfalls für dreißig Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte die Färbung mit 150 µl Diaminobenzidin (DAB KIT, Vector Laboratories, Kanada) für etwa zehn Minuten. Daraufhin konnten die Proben in 300 µl D-PBS bei 4 C bis zur Auswertung und länger problemlos aufbewahrt werden. 2.5 Materialeigenschaften Um das Verhalten der Spiralganglien auf Fremdmaterialien zu untersuchen, wurden Plättchen von 9 mm Durchmesser und 0,1 mm Dicke verwendet (Heinz Kurz Medizintechnik, Dusslingen). Es wurden Titanplättchen (ASTM F67 Gr.1) entsprechend den kommerziellen Mittelohrimplantaten sowie Goldplättchen (Au 99,99 %) entsprechend den K- Pistons und Edelstahlplättchen (316L, medical grade) (Heinz Kurz Medizintechnik, Dusslingen) getestet. Platin (99,95 %) entsprechend dem Elektrodenmaterial einer CI-Elektrode (MedEl, Österreich) wurde als Folie auf den Boden einer Standardzellkulturschale mit 48 Vertiefungen und Flachboden aus Plastik (Polystyren) (Falcon, USA) aufgebracht. Die Plättchen wurden einzeln in ebensolche Zellkulturschalen gelegt. Um vergleichbare Untersuchungsbedingungen zu erhalten, wurde Silikon (Poly- Dimethylsiloxan) als elastischer Kit (Sylgard 184 ; Troller-Kunststoffe AG, Schweiz) verwendet, ein aus zwei Komponenten bestehendes Silikonelastomer. Nach Mischen des Basismaterials (Base) mit einem Vernetzungsreagenz (Curing Agent) im Verhältnis 10:1 wurden 0,5 ml in jede Vertiefung der Kulturplatte gefüllt und mit Hilfe einer Vakuumpumpe entgast, bis die Flüssigkeit frei von Luftblasen war. Anschließend wurde die gesamte Platte für vier Stunden mit UV- Licht (384 nm) sterilisiert. Als Kontrolle diente der Boden der Standardkulturplatte aus Plastik (Polystyren). 16

21 2.6 Lichtmikroskopie Die Auswertung der Spiralganglienneuriten auf den alloplastischen Materialien sowie der Kontrolle erfolgte zunächst lichtmikroskopisch. Hierfür wurde der Puffer aus den Kulturschalen vollständig abgesaugt, um Vergrößerungseffekte und optische Verzerrungen durch Lichtbrechung am Flüssigkeitsmeniskus zu vermeiden. Mit einer mit dem Lichtmikroskop kombinierten Fotokamera (Wild M 400 Fotomikroskop, Heerbrugg, Leica Camera AG, Solms) wurde jedes Explantat mit einem Kunstlichtfilm aufgenommen. Die Beleuchtung musste hierfür so eingestellt werden, dass möglichst wenig Reflexion der metallischen Oberflächen die Bildqualität beeinträchtigte. Die Kontrollen in den Kulturschalen sowie die Explantate auf Silikon ließen sich am besten mit einer Durchlichtquelle fotografieren. Die Bilder dienten unter anderem der anschließenden computergestützten Auswertung der Spiralganglienneuriten in bezug auf ihre erreichte Länge und Anzahl. 2.7 Vermessung der Spiralganglienneuriten Für die quantitative Auswertung der Spiralganglien-Zellkulturen wurde ein spezielles Vermessungsprogramm verwendet. Ziel war die metrische Erfassung des Wachstumsverhaltens der Spiralganglienneuriten. Hierfür wurde das lichtmikroskopische Foto einer jeden Probe durch Einlesen mit einem computergestützten Scanner digitalisiert. Mit einer Software auf der Basis von Borland Delphi (Borland Software Corporation, USA) konnten die Bilder eingelesen und die einzelnen Neuriten vermessen werden, indem diese in ihrem Verlauf in beliebig viele Vektoren zerlegt und die einzelnen Beträge der Vektoren im Sinne eines Polygons addiert wurden [40] (Abb. 3). Hierfür verfolgte und markierte man mit der Computermaus jeden einzelnen Neuriten eines Explantats am digitalisierten Foto am Computerbildschirm. Die Software ermittelt hieraus die Gesamtlänge des markierten Neuriten. Bei Aufspreizung im Verlauf eines Neuriten in Kollaterale wurde jeweils nur der Hauptstamm berücksichtigt. Neben der Länge wurde so auch die Anzahl der aussprossenden Neuriten je Explantat am lichtmikroskopischen Bild erfasst. 17

22 Abb. 3: Längenmessung von Neuriten aus einem Spiralganglien-Explantat mit Hilfe einer Software an einem digitalisierten lichtmikroskopischen Bild (nach Mlynski et al., 2002) 18

23 2.8 Testverfahren und Statistik Die statistische Auswertung erfolgte durch Mittelwertvergleich über einfache Varianzanalyse (ANOVA) mit Hilfe des Statistiksoftwareprogramms SPSS (Version 11.0) (SPSS Inc., USA). Die ermittelten Werte wurden in den jeweiligen Materialgruppen unterschieden. Von den Neuritenlängen sowie von der Anzahl der Neuriten in den verschiedenen Materialgruppen wurden die arithmetischen Mittelwerte und deren Standardfehler berechnet und untereinander auf statistische Signifikanz (p) getestet. Diese Gruppen wurden zunächst auf Homogenität der Varianz geprüft (Levene-Test). War weiterhin die Signifikanz zwischen den Gruppen gegeben, so kam ein Post Hoc-Test zum Mehrfachvergleich der Gruppen untereinander zur Anwendung (Least Significance Differences). Bei den Werten der Anzahl der Neuriten war die Homogenität der Varianzen nicht gegeben, so dass hier für die weitere Berechnung der Unterschiedsschwelle der Tamhane-T2- Test verwendet wurde. Es gelten vereinbarungsgemäß Werte von p <.05 als signifikant und p <.001 als hochsignifikant. 2.9 Rasterelektronenmikroskopie Zur Vorbereitung der rasterelektronenmikroskopischen Fotografie wurden die fixierten und lichtmikroskopisch ausgewerteten Spiralganglien-Explantate mitsamt ihrer jeweils bewachsenen Oberfläche zur Dehydrierung in eine aufsteigende Alkoholreihe gelegt. Für jeweils dreißig Minuten kamen die Proben in ein aufsteigendes Ethanolbad (50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 % und 100 %). Daraufhin verblieben die Proben bis zur Weiterverarbeitung in Aceton (100 %). Für die Vorbereitung der Spiralganglien-Explantate, die als Kontrolle dienten und somit am Boden der Kulturplatte angewachsen waren, musste der Boden der Vertiefung der Zellkulturschale vorsichtig aus der Kulturplatte herausgesägt werden. Diese Kontrollproben auf Plastik wurden ebenfalls der aufsteigenden Alkoholreihe zugeführt, jedoch nicht in Aceton eingelegt. Nun folgte die maschinelle kritische Punkt-Trocknung (CPD 030 BAL-TEC, Lichtenstein) für die Fremdmaterialproben Titan, Gold, Edelstahl und Silikon. Die Kontrollen auf Plastik wurden zur Trocknung in Hexamethyldisilazane (Sigma-Aldrich, USA) 19

24 und Ethanol (100 %) im Verhältnis 1:1 für dreißig Minuten, für weitere sechzig Minuten in reinem Hexamethyldisilazane eingelegt und für weitere zwölf Stunden luftgetrocknet. Alle Proben wurden nun in einem Beschichtungsgerät (sputter coater) (SCD 005 BAL-TEC, Lichtenstein) mit einer Gold-Palladium-Schicht überzogen und schließlich mit einer Beschleunigungsspannung von 15 kv bei unterschiedlichen Vergrößerungen gerastert und mit einer Mikroskopkamera fotografiert (DSM 962, Zeiss, Solms). 3 Ergebnisse 3.1 Allgemeines Wachstumsverhalten Die mikroskopische Auswertung zeigte, dass ein Auswachsen und Überleben von Neuriten der Spiralganglien-Explantate unter den gewählten Bedingungen auf allen Oberflächen möglich war. Die Neuriten wuchsen überwiegend radiär aus den Explantaten heraus. Dabei ergab sich zumeist eine relative Polarität, nach der eine Neuritenaussprossung nicht von dem gesamten Umfang, sondern bevorzugt von einer Hälfte des Explantats zu beobachten war. Dieses Muster der Aussprossung wurde bereits in anderen Untersuchungen beobachtet [19]. Meist waren die Neuriten nahe am Explantat als Bündel oder Faszikel erkennbar, die sich im weiteren Verlauf voneinander trennten. Dabei war die Wachstumsrichtung nicht immer gerade, vielmehr kam es häufig zu unregelmäßigen Verläufen und auch zu Überkreuzungen von mehreren Neuriten. Gelegentlich wuchsen diese aufeinander zu, um sich nach kurzer Distanz wieder in die entgegengesetzte Richtung auszubreiten. Grundsätzlich gab es keine lichtmikroskopischen Unterschiede im Wachstumsmuster auf den verschiedenen Oberflächen. Eine leichte Abweichung betraf die Häufigkeit von Neuritenabzweigungen, da diese insbesondere auf der Titanoberfläche häufiger und in geringerer Distanz zum Zellkörper im Explantat auftraten als auf den anderen Oberflächen. Die verschiedenen Materialien zeigten um die Explantate unterschiedliche Verteilungen nicht-neuronaler Zellen, bei denen es sich morphologisch um 20

25 Fibroblasten sowie weiteren lichtmikroskopisch nicht näher bestimmbaren Zellen handelte. Während die Zellen auf den Titanoberflächen relativ spärlich verteilt waren, fand sich eine sehr dichte Bedeckung der Oberflächen mit diesen Zellen auf allen anderen Materialien, insbesondere auf Silikon. Die nicht-neuronalen Zellen erstrecken sich dabei bis über Neuritenendigungen hinaus (Abb. 4). 21

26 Abb. 4: Typisches Neuritenwachstum aus einem Spiralganglien-Explantat auf einer Kontrolloberfläche aus Plastik. Es bildeten sich Aufzweigungen (schwarze Pfeile), Neuriten zeigten Überkreuzungen (roter Pfeil) und regelmäßige Verdickungen (weiße Pfeile), die elektronenmikroskopisch nicht-neuronalen Zellen entsprachen (s.u.). 22

27 3.2 Anzahl der Tiere und Explantate Es wurde eine Gesamtanzahl von 157 Explantaten ausgewertet. Davon dienten 35 Explantate als Kontrolle (22,3 %), 38 (24,2 %) wurden auf Silikon kultiviert, 20 (12,7 %) Explantate auf Titan, 13 (8,3 %) auf der Goldoberfläche, 24 (15,3 %) auf Edelstahl und 27 (17,2 %) auf Platin. 3.3 Histomorphometrische Auswertung Längenwachstum der Spiralganglienneuriten Die verschiedenen Materialen beeinflussten das Längenwachstum der Spiralganglienneuriten z.t. hochsignifikant. Auf den Kontrolloberflächen aus Plastik der Zellkulturschale erreichten die Neuriten eine durchschnittliche Länge von 479 +/-19 µm. Das längste Neuritenwachstum wurde auf der Titanoberfläche gemessen. Die mittlere Länge betrug bei dieser Neuritenpopulation 662 +/-26 µm und war damit hochsignifikant größer als auf der Kontrolloberfläche, Silikon (283 +/-18 µm), Gold (218 +/-21 µm) sowie Platin (492 +/-24 µm) (p jeweils <.001). Nur auf Edelstahl wurde eine ähnlich große Neuritenlänge gemessen (620 +/-32 µm). Im Vergleich zu Edelstahl bestand auf Titan kein signifikanter Unterschied im durchschnittlichen Längenwachstum (p >.24). Das geringste Längenwachstum zeigte sich auf den Oberflächen Silikon und Gold, welche beide ein hochsignifikant kürzeres Längenwachstum aufwiesen als auf der Kontrolloberfläche sowie den Materialien Titan, Edelstahl und Platin. Zwischen der Gold- und der Silikonoberfläche war kein signifikanter Unterschied messbar (p >.09). Das Wachstum auf der Platinoberfläche zeigte keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrolle auf Plastik (p >.67) (Tab. 1, Abb. 5a und 6). 23

28 3.3.2 Anzahl der auswachsenden Spiralganglienneuriten Auch bei der Anzahl der aus jedem Explantat auswachsenden Neuriten kam es teilweise zu signifikanten Unterschieden zwischen den verschiedenen Materialien. Auf der Kontrolloberfläche wuchsen durchschnittlich 36 +/-3 Neuriten aus einem Explantat aus. Die Unterschiedsschwelle im Vergleich zu der Titanoberfläche (31 +/-3 Neuriten) war hier jedoch nicht signifikant (p >.99). Auf Edelstahl wurden immerhin 25 +/-3 Neuriten je Explantat gezählt. Dieser Wert war ebenfalls im Vergleich zu der Kontrolle statistisch nicht signifikant (p >.22). Gold, welches das geringste Wachstum mit durchschnittlich nur 3 Neuriten je Explantat hervorbrachte, zeigte eine hochsignifikant geringere Anzahl von auswachsenden Neuriten als sämtliche andere Materialien (p <.001). Zwischen der Titanoberfläche und der Edelstahloberfläche war der Unterschied bei der Anzahl der Neuriten nicht signifikant (p >.98). Ansonsten zeigte sich jedoch auf Titan ein signifikant häufigeres Auswachsen von Neuriten gegenüber Platin mit 16 +/-2 Neuriten (p <.004) sowie Silikon (13 +/-1 Neuriten) und Gold (3 Neuriten) (p jeweils <.001). Es ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl der Neuriten auf der Platinoberfläche (16 +/-2 Neuriten) und der Silikonoberfläche (13 +/-1 Neuriten) (p >.83) (Tab. 1, Abb. 5b und 6). 24

29 Neuritenlänge [µm] 800 p > ** ** 600 Plastik a ** ** Silikon Gold ungereinigt Titan ungereinigt Edelstahl Platin 0 Kontrolle Silikon Gold Titan Edelstahl Platin Neuritenanzahl [n] p > Plastik Silikon Gold ungereinigt ** ** Titan ungereinigt Edelstahl Platin b 5 0 ** Kontrolle Silikon Gold Titan Edelstahl Platin Abb. 5a und b: Dargestellt sind die Mittelwerte der gemessenen Neuritenlängen (a) und der Anzahl der ausgewachsenen Neuriten (b) auf den verschiedenen Materialien Silikon, Gold, Titan, Edelstahl, Platin sowie der Kontrolle auf Plastik. ** markiert ein Signifikanzniveau von p <.001 und bezieht sich jeweils auf die Kontrolle. Separat angegeben ist die Unterschiedsschwelle zwischen Titan und Edelstahl. Hier zeigten sich sowohl bei dem Längenwachstum (a) als auch bei der Neuritenanzahl (b) keine signifikanten Unterschiede. 25

30 Tab. 1: Metrische Auswertung des Neuritenwachstums Die Tabelle zeigt sämtliche Mittelwerte und die Standardfehler in Klammern dahinter für die Neuritenlängen und die Anzahl der Neuriten bei jedem getesteten Material. Weiterhin ist die Anzahl der ausgewerteten Explantate für das jeweilige Material angegeben (n). Materialoberfläche Neuritenlänge in µm (Standardfehler) Neuritenanzahl (Standardfehler) Plastik (n = 35) 479 (19) 36 (3) Silikon (n = 38) 283 (18) 13 (1) Gold (n = 13) 218 (21) 3 (0,3) Titan (n = 20) 662 (26) 31 (3) Edelstahl (n = 24) 620 (32) 25 (3) Platin (n = 27) 492 (24) 16 (2) total (N = 157) 26

31 a b Abb. 6a, b: Spiralganglien-Explantate auf den verschiedenen untersuchten Materialoberflächen; (a) Kontrolle (Plastik), (b) Silikon. Auf der Silikonoberfläche sprossen signifikant weniger und kürzere Neuriten aus dem Explantat aus im Vergleich zur Kontrolle auf Plastik. Der Balken entspricht 500 µm. 27

32 c d Abb. 6c, d: Spiralganglien-Explantate auf den verschiedenen untersuchten Materialoberflächen; (c) Titan, (d) Gold. Auf der Titanoberfläche zeigt sich im Vergleich zu allen anderen Materialien ein vermehrtes und verlängertes Neuritenwachstum, auf der Goldoberfläche dagegen ein deutlich eingeschränktes Wachstum. Der Balken entspricht 500 µm. 28

33 e f Abb. 6e, f: Spiralganglien-Explantate auf den verschiedenen untersuchten Materialoberflächen; (e) Edelstahl, (f) Platin. Das Wachstumsverhalten der Neuriten auf der Edelstahloberfläche ist im Vergleich zu Titan etwas reduziert, allerdings ohne signifikanten Unterschied. Auf Platin zeigt sich ein mittelmäßiges Neuritenwachstum. Der Balken entspricht 500 µm. 29

34 3.4 Rasterelektronenmikroskopische Auswertung Die durchgeführten Untersuchungen mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) erlaubten eine detaillierter Betrachtungsweise der auswachsenden Neuriten, der Oberflächenstruktur des Materials sowie des Wachstums und der Morphologie der nicht-neuronalen Zellen. Zudem war es möglich die detaillierte Morphologie einzelner Neuriten sowie deren Ausbildung von Faszikeln, Kontaktpunkte von Neuriten zu nicht-neuronalen Zellen sowie zu den verschiedenen Materialoberfläche zu analysieren Materialoberflächen Die Kontrolloberfläche aus Plastik war im Vergleich zu allen anderen Oberflächen sehr glatt und zeigte keine auffällige Strukturierung. Titan besaß eine relativ glatte und ebene Oberflächenstruktur mit andeutungsweise longitudinal ausgerichteten Vertiefungen und einzelnen kleinen Kerben. Das Muster von der verwendeten Goldoberfläche erschien rautenförmig von Rillen durchzogen, war dabei jedoch insgesamt glatter als die übrigen metallischen Oberflächen. Die Oberfläche von dem verwendeten Edelstahl war von zahlreichen gerade ausgerichteten Rillen durchzogen, die sich an vielen Stellen überkreuzten. Dieses Relief war insgesamt tiefer in die Oberfläche eingelassen als bei Titan und Gold. Von den Platinoberfläche wurden keine REM-Bilder angefertigt, da die Folien sich nicht ohne Zerstörung der Explantate aus den Kulturschalen entnehmen ließen Wachstumsverhalten der Spiralganglienneuriten Im Allgemeinen wuchsen die Neuriten ab einer Distanz von ca. 200 µm vom Explantat einzeln aus. Nach initialer Faszikelbildung zeigte sich hier typischerweise eine Tendenz zur Defaszikulation. Hier kam es wie schon lichtmikroskopisch beobachtet häufig zu Überkreuzungen. Nach weiteren µm nahm die Häufigkeit von Aufzweigungen der Neuriten zu, so dass ein Y- 30

35 förmiges Wachstumsmuster entstand. Am beständigsten war dieses Phänomen auf Titan zu erkennen, weniger häufig auf Silikon. Ab einer 3000fachen Vergrößerung kamen die Anheftungsmechanismen entlang der Neuriten zur Darstellung, wie die sog. Filopodia, die als feine Fortsätze seitlich aus dem Neuriten heraus in unbestimmten Abständen an die Oberfläche anknüpften (Abb. 7a). Insgesamt zeigten die Neuriten eine Dicke von ca. 1,5 µm, die Filopodiae dagegen waren um ein vielfaches dünner. 31

36 a 2µm Abb. 7a: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme zweier Spiralganglienneuriten auf einer Titanoberfläche in 10000facher Vergrößerung. Ein dünnes Filopodium heftet sich vom oberen Neuriten ausgehend an die Oberfläche. Unterhalb des Neuriten verläuft eine breitbasige, flächige Struktur. 32

37 5µm b 10µm c Abb. 7b, c: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Spiralganglienneuriten auf einer Goldoberfläche in 2000facher Vergrößerung (b) und einer Titanoberfläche in 5000facher Vergrößerung (c). Ausläufer nichtneuronaler Zellen wie Gliazellen und Fibroblasten könnten für die Anheftung des Neuriten auf den Oberflächen verantwortlich sein. 33

38 Nicht eindeutig klassifizierbar waren die unterhalb der Neuriten häufig über die gesamte Länge entlang gebildeten flächigen Strukturen, die den direkten Kontakt der Neuriten mit der Oberfläche unterbanden. Ob diese lamellenartigen Anhänge aber von umgebenden Zellen ausgingen, war nicht eindeutig erkennbar (Abb. 7b und c). Es zeigten sich mehrere morphologisch unterschiedliche Zellpopulationen, die auf allen Materialien die auswachsenden Neuriten begleiteten. Mit einem ubiquitären Verteilungsmuster fanden sich Zellen mit einem größeren runden bis längsovalen Zellkörper von bis zu 20 µm Länge, die zahlreiche lange Fortsätze aufwiesen (Abb. 7d). Diese Fortsätze, welche eine Länge von bis zu 30 µm erreichten nahmen Kontakte zu gleichartigen Zellen und den Neuriten auf (Abb. 7e). Morphologisch entsprachen diese Zellen am ehesten Astrogliazellen. Eine immunhistochemische Typisierung wurde nicht durchgeführt. Eine weitere morphologisch unterschiedliche Zellpopulation zeigte einen kleineren, knapp 10 µm großen runden Zellkörper. Ihre wenigen und kurzen (10-15 µm) Fortsätze traten ausschließlich an die Neuriten heran (Abb. 7b und c). Ob es sich hierbei um markscheidenbildende Oligodendrozyten handelte, konnte aufgrund fehlender immunhistochemischer Untersuchungen nicht verifiziert werden. Es fanden sich zudem Zellen, die mit ihrem Zellkörper in direktem Kontakt mit Neuriten standen. Diese Zellen waren flach mit einem Durchmesser von etwa 10 µm und wiesen langgezogene, breitbasige Ausläufer auf, die für Fibroblasten typisch sind (Abb. 7f). Sie zeigten sich in unregelmäßigen Abständen entlang der Neuriten. 34

39 10µm d 50µm e Abb. 7d, e: 2000fache Vergrößerung eines Neuriten und umgebender nichtneuronaler Zellen auf einer Goldoberfläche (d). Die weißen Pfeile deuten auf eng an den Neuriten anliegende Zellen, die glialen Ursprungs sein könnten. Beide Zellen sind einen Zellausläufer miteinander verbunden (Pfeilspitze). Abb. 7e (500fache Vergrößerung) zeigt die Verteilung von nicht-neuronalen Zellen auf einer Goldoberfläche. Die Zellfortsätze erreichen eine Länge von bis zu 30 µm. 35

40 10µm f 5µm g Abb. 7f, g: Ausläufer eines Spiralganglienneuriten mit einem Wachstumskegel (schwarzer Pfeil) auf einer Kontrolloberfläche in 2000facher Vergrößerung (f) und 5000facher Vergrößerung (g). Der dem Neuriten dicht anliegende Zellkörper entspricht am ehesten einem Fibroblasten (F). 36

41 An den peripheren Enden der Neuriten ließen sich sogenannte Wachstumskegel ausmachen. Diese waren in ihrer Morphologie unabhängig vom getesteten Material. Sie präsentierten mehrere typische feinen Ausläufer, die sich um den Wachstumskegel herum ausbreiteten (Abb. 7f und g). Die genannten Strukturen und Zellen ließen sich auf allen Materialen ohne erkennbare Unterschiede beobachten. Dagegen differierte das Verhältnis der Neuriten zu den oben genannten umgebenden Zellen auf den unterschiedlichen Materialien deutlich. Die Ausbreitung der Neuriten auf Plastik, Silikon, Gold und Edelstahl vom Explantat war eng verbunden mit der Ausbreitung der begleitenden Zellen auf dem Material. Einzig auf der Titanoberfläche konnte ein deutliches, bis zu mehreren hundert µm weites, über diese Grenze der beschriebenen Zellen hinausgehendes Neuritenauswachsen beobachtet werden (Abb. 7h). Ob es sich bei den auswachsenden Neuriten um Dendriten oder Axone handelte, konnte anhand der REM-Bilder der gewonnenen Explantaten nicht ermittelt werden. Neben den Details der verschiedenen alloplastischen Oberflächen zeigten die REM-Bilder die Beziehung der Neuriten zu den Feinheiten dieser Materialcharakteristika. Allerdings erschienen die Unebenheiten sowie charakteristischen Strukturen der verwendeten Materialien das Auswachsen der Neuriten nicht zu beeinflussen, da diese über die Strukturen hinwegwuchsen, ohne ihre Wachstumsrichtung an vorgegebene Rillen oder Erhebungen anzupassen. 37

42 h 500µm Abb. 7h: 80fache Vergrößerung eines ganzen Spiralganglien-Explantates auf einer Titanoberfläche. Die schwarzen Punkte in der Umgebung des Explantates entsprechen den nicht-neuronalen Zellen. Die Neuriten wachsen deutlich über einen gedachten Hof dieser Zellen hinaus (gestrichelte Linie). 38