Züchterische Aspekte. Erstellung und Verwendung gentechnisch veränderter Tiere
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- Liese Burgstaller
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1 Züchterische Aspekte bei der Erstellung und Verwendung gentechnisch veränderter Tiere Reinhart Kluge Potsdam/Spangenberg
2 Inhalt: - Allgemeine Zuchtziele - Definitionen und Zielsetzungen - Typen gentechnisch veränderter Tiere - Zuchtverfahren - Nomenklatur - Genetisches Monitoring
3 Allgemeine Ziele bei der Erstellung und Zucht von Tiermodellen für die biomedizinische Forschung Etablierung und Erhalt spezifischer erblicher Eigenschaften (Genvarianten) in bestimmten Tierarten, Rassen oder Stämmen Standardisierung (Kontrolle) der Zielmerkmale und genetischen Einflüsse in Tierversuchen
4 Zielmerkmal(e) Phänotyp = Genotyp + Umwelt + Interaktionen
5 Klassische Zuchtkonzepte Maximale Homozygotie Wiederholbare Heterozygotie Inzucht Hybridzucht Auszucht Heterozygotie in Grenzen variierend
6 Verfügbarkeit der Zuchtstandards im engeren Sinne: -Maus -Ratte -Hamster -(Zebrafisch) -(Minischwein)
7 Aktuelle Probleme bei der Anwendung von Inzuchtstämmen: Verwendung eines Inzuchtstammes pro Projekt Limitierung der Aussage und Verallgemeinerung Substammvielfalt Informationsmängel bei Tierbestellung Keine Zufallsstichprobe bei Bestellung Keine systematische Stichprobe bei Bestellung
8 Probleme bei Inzuchten: Substammvielfalt Wichtige C57BL/6 Substämme C57BL/6J Ursprungsstamm, etabliert am Jackson Lab. C57BL/6N Separiert in F32 von B6/J; Multiple genetische Unterschiede zum Ursprungsstamm C57BL/6JOlaHsd Mutation am Locus für -synuclein (Wotjak, 2003) Weitere genetische Unterschiede zum Ursprungsstamm
9 Definition gentechnisch veränderter Tiere: Experimentell übertragenes Erbmaterial; dadurch generierte Mutanten mit stabiler Integration des veränderten Erbgutes (Transgen) in der Keimbahn der Tiere
10 Erstellung von kongenen bzw. gentechnisch veränderten Inzuchtstämmen: Zielsetzung: - Gezielter Alleltransfer auf einen definierten genetischen Hintergrund: gain of function loss of function - Analyse der Allelfunktion
11 Erstellung gentechnisch veränderter Tiere Nicht homologe Rekombination Homologe Rekombination Vorkerninjektion virale Vektoren Transfektion Embryonale Stammzellen Homologe Rekombination: (Targeted Genome Editing) TALEN ZFN CRISPR/Cas Konditionale Expression (gewebsspezifisch, zeitabhängig) z.b. Cre/loxP System
12 Prinzip der Knockout Erstellung mit Hilfe von ES-Zellen Herkunft: z.b. 129S3 Fellfarbe: agouti, white bellied Herkunft: z.b. C57BL/6 Fellfarbe: schwarz Chimäre Fellfarbe:agouti + schwarz
13 Klassisches Rückkreuzungssystem zur Erzeugung kongener bzw transgener Stämme F0 Chimäre (nicht definierte genetische Anteile der Ausgangslinien) F1 = N1 N2 F2 Nicht definierter Hintergrund einer frühen F2 N3... N10 N10F2 Wildtyp Genetisch definierter Hintergrund Hetero- bzw. hemizygot Homozygot transgen
14 Effekte des genetischen Hintergrundes auf Interleukin-2 (Il2) Knockouts (Linder, 2001) Stamm Genet. Hintergrund Phänotyp B6;129-Il2tm Mixtur von C57BL/6 und 129P2/OlaHsd B6.129-Il2tm C57BL/6 kongen hämolytische Anämie, Tod im Alter 3 6 Monate progressive IBD, abhängig vom Hygienestatus C3.129P2-Il2tm C3H/HeJ kongen hämolytische Anämie Tod im Alter von 7 Wochen C.129P2-ll2tm BALB/c kongen hämolytische Anämie Tod im Alter von 7 Wochen 50% Todesrate im Alter 4 9 Wochen, Splenomegalie, schwere Anämie, progressive IBD
15 Maßnahmen zur Zuchtbeschleunigung des Rückkreuzungsverfahrens Markerunterstützte Selektion: Speed Congenics Verfahrensweise: Auswahl von Zuchtremonten (Männchen) mit möglichst hohem Anteil empfängerspezifischer Allele durch genomweite Kontrolle von DNA-Markern (SNP; MIT; STR) Besonders effektiv in frühen Rückkreuzungsgenerationen (N2, N3) Vorteil: Bis zu 5 Rückkreuzungsgenerationen können eingespart werden; d.h., bereits in N5 kann mit diesem Verfahren ein sauberer genetischer Hintergrund erreicht werden
16 Empfehlung: Verwendung von Stammzellen des Zielstammes (z.b. B6) Cave: Substamm! Vorteil: Genetisch sauberer Background von F1 an Keine Rückkreuzungen nötig
17 Strain ES Cell Line Appearance 129P2/OlaHsd E14TG2a; HM-1(Hprtb-m1) pink-eved, light-bellied chinchilla 129P3/Jems mems32 pink-eved, light-bellied chinchilla 129X1/SvJ RW-4, PJ1-5 pink-eved, light-bellied, light chinchilla or albino 129X1 x 129S1 R1(+Kitl-SIJ) light-bellied agouti 129S1/Sv-+P+Tyr-c W9.5(+Kitl-SIJ) light-bellied agouti
18 Zucht konditionaler Nullmutanten bei Mäusen Gefloxte Linie x Cre Linie zur Erzeugung der KO Tiere P: F1: F1 Verpaarung: N2: B6-flox/flox x B6-flox/+/Tg(Cre) B6-flox/flox B6-Tg(Cre) B6-flox/+ x B6-flox/flox/Tg(Cre) B6-flox/+/Tg(Cre) B6-flox/+ (KO Tiere) B6-flox/+/Tg(Cre) B6-flox/flox (Kontrolltiere)
19 Zucht von Doppelmutanten Ziel: Etablierung zweier homozygoter mutanter Loci in einem Tierstamm Ohne chromosomale Kopplung der Zielallele Mit chromosomaler Kopplung der Zielallele In beiden Fällen mindestens zwei Zuchtgenerationen mit einer hohen Zahl an Zuchtpaaren
20 Zucht von Doppelmutanten Ziel: Etablierung zweier homozygoter mutanter Loci in einem Tierstamm Ohne chromosomale Kopplung der Zielallele: Erwartungswert von mut1/mut1 x mut2/mut2 = 1/16 (6,25%) Mit chromosomaler Kopplung der Zielallele: Rekombination erforderlich! Wahrscheinlichkeit des gewünschten Genotyps vom chromosomalen Abstand der Loci und damit von der Rekombinationsrate P abhängig
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22 Nomenklatur von Versuchstieren Herkunft der Stammnamen: -Institutionen: Wistar Institute (WIST, W) Naval Medical Research Institute -Personen: Sprague Dawley (SPRD, SD) Lewis (LEW) Long Evans (LE) -Fellfarben: Dark Agouti (DA) Brown Norway (BN)
23 Nomenklatur bei Mäusen und Ratten Auszucht: Aktueller Züchter RjHan:NMRI Herkunftszüchter Stammname (3 5 GROßBUCHSTABEN)
24 Nomenklatur bei Mäusen und Ratten Inzucht: Aktueller Züchter BALB/cHanRj Stammname (3 5 GROßBUCHSTABEN) Herkunftszüchter
25 Offizielle Abkürzungen von Stammnamen AKR C57BL/6 BALB/c C57BL/10 DBA/1 C57L DBA/2 C57BR/cd C3H STS AK B6 C B10 D1 L D2 BR C3 S
26 Nomenklatur von F1-Hybriden Examples: D2B6F1 B6D2F1 Offspring of a DBA/2 mother and C57BL6/J father. Offspring of the reciprocal cross
27 Nomenklatur: Targeted Mutation (Knock out): B6.129P2-Cftrtm1Unc Die erste gerichtete Mutation (tm1) im cystic fibrosis transmembrane conductance regulator homolog der University of North Carolina, unter Verwendung von 129P2 ES Zellen, vollständig rückgekreuzt auf C57BL/6. B6;129 : B6,Cg : unvollständige Rückkreuzung auf B6 der Donor ist nicht ingezüchtet
28 Nomenklatur: Doppel Knock out: B6.129S7-Icamtm1BaySelptm1Bay Die ersten gerichteten Mutationen im interzellulären Adhäsionsmolekül-1und dem P-Selektin-Gen von Dr. Arthur Beaudet, Baylor College of Medicine, unter Verwendung von 129S7 ES Zelllinien, rückgekreuzt auf C57BL/6 und durch Kreuzung in einem Stamm kombiniert.
29 Nomenklatur: Konditioneller Knock out (generiert mit Cre-lox) B6.129P2-Mecp2tm1.1Bird -Mecp2: Methyl CpG binding protein 2 loxp sites flankieren Exone 3 und 4 -tm1.1: Cre vermittelte Rekombination, del. Exons 3 und 4 -Bird: Laborcode Dr. Adrian Bird, Edinburgh
30 Nomenklatur: Targeted Mutation: (Knock in) B6.129S-En1tm1(Otx2)Wrst -En1: ausgeschaltetes Gen engrailed 1 -Otx2: orthodenticle homolog 2 (eingefügtes Gen) -Wrst: Laborcode Dr. Wolfgang Wurst
31 Nomenklatur: Transgener Stamm durch Mikroinjektion: C57BL/6J-Tg(CD8Ge)23Jwg CD8 Klon aus dem humanen Genom Nach Vorkerninjektion in B6 Mäuse aus dem Jackson Labor 23. Maus aus einer Serie von Mikroinjektionen, etabliert von Jon W. Gordon
32 Genetisches Monitoring Ziele: - Genetische Beschreibung von Labortierstämmen (genetisches Profil) - Prüfung von Stämmen bzw. Einzeltieren auf Authentizität - Prüfung von Allelen an einzelnen Loci auf Identität und Status - Erfassung von Allelfrequenzen - Populationsgenetische Beschreibung komplexer Merkmale (h²)
33 Genetisches Monitoring Merkmale DNA Polymorphismen Proteinpolymorphismen Immungenetische Varianten Cytogenetische Polymorphismen Fellfarben Komplexe Merkmale (Reproduktionsdaten, Verhalten, pathophysiologische Eigenschaften)
34 Informationen zu Zucht und Nomenklatur: dels.nas.edu/ilar
35 Vielen Dank! Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
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37 Interaktionen - Intragene Wechselwirkungen - Intergene Wechselwirkungen - Genotyp/Umwelt-Wechselwirkungen
38 AKR-Substammunterschiede (Acton et al., 1973) Substamm AKR/FuRdA Leukämierate 92% AKR/Fu 36% AKR/F 20%
39 Genetisches Monitoring - Zuchtleistungsdaten Kolonieindex eines Stammes: Durchschnittliche Zahl abgesetzter Jungtiere pro Zuchtweibchen und Woche
40 Merkmalsgruppen Monogen oder oligogen bedingte (qualitative) Merkmale: nur ein Gen (oder wenige Gene) ist (sind) an der Ausprägung des Phänotyps beteiligt Die Umwelt spielt keine bzw. nur eine geringe Rolle Beispiele: Fellfarben, Einzelgen-Mutationen Polygen bedingte (quantitative) Merkmale: Viele Gene sind an der Ausprägung des Phänotyps beteiligt, Die Umwelt spielt eine mehr oder weniger große Rolle Beispiele: Körpergewicht, Fettansatz, Körperlänge, Blutwerte
41 Beispiel: Genetisches Monitoring anhand von Mikrosattelitenmarkern Vergleich der Stämme B6 und BALB/c und ihrer Hybriden
42 Empfehlungen: Züchter: Anwendung korrekter und definierter Zuchtmethoden Umfassendes genetisches Monitoring Genetische Drift minimieren Bereitstellung von Zucht- und Stamminformationen Nutzer: Verwendung definierter Modelle Genetische Drift minimieren Stichprobenproblematik (Shift, Verteilung) beachten
43 Wichtige Fellfarbgene der Maus Genort Chromosom Allele und Fellfarben Agouti (A) 2 A agouti (wildfarben) a nicht-agouti Braun (B) 4 B schwarz b braun Albino (C) 7 C Farbausbildung c keine Farbe Dilution (D) 9 D volle Farbausprägung d Farbverdünnung Pink-eyed Dilution (P) 7 P normale Farbausbildung p Farbverdünnung in Auge und Fell Extension (E) E normale Farbverteilung Farbverteilung 8 e unvollständige
44 Fellfarbgenotypen der Mausstämme NMRI und C57BL/6 und ihrer F1-Kreuzung Stämme\Genorte A B C D E NMRI: Aa, BB, cc, DD, EE Fellfarbe: albino B6: aa, BB, CC, DD, EE Fellfarbe: schwarz F1: Aa, BB, Cc, DD, EE Fellfarbe: agouti aa, BB, Cc, DD, EEFellfarbe: schwarz
45 Erblichkeitskoeffizient h²: = Korrelation zwischen der genetischen Varianz eines Merkmals und seiner Gesamtvarianz Schwankungsbreite (theoretisch) zwischen 0 % (kein genetischer Einfluss) und 100% (monogene Vererbung, kein Umwelteinfluss) Berechnungsmöglichkeiten: Grundsätzlich: Ausmaß der Ähnlichkeit zwischen verwandten Individuen -Vollgeschwistergruppenvergleich -Vergleich verschiedener Inzuchtstämme -Eltern-Nachkommenvergleich
46 Schematischer Aufbau von Inzuchten bei kommerziellen Züchtern NC Selbsterhaltung durch bxs Paarung und Zuchttiere für PEC PEC Liefert Zuchttiere für MC1 und Versuchstiere, Erhalt durch bxs Paarung MC1 Liefert Zuchttiere für MC2 und Versuchstiere bxs Paarung nicht mehr zwingend erforderlich MC2 Liefert Zuchttiere für MC3 und Versuchstiere MC3 Liefert Versuchstiere NC Nucleuskolonie PEC Pedigrierte Expansionskolonie MC Multiplikationskolonie
47 Nomenklatur von F2-Hybriden, Rückkreuzungen D2B6F2 B6(D2AKRF1) offspring of a D2B6F1 intercross. offspring of a (DBA/2 x AKR/J)F1 male backcrossed to a C57BL/6J female
48 Genetisches Monitoring: Dokumentation Stamm: Zuchtdurchgang/Generation: von Zuchtleistungsdaten Anzahl Käfige/Paare/Blöcke: Zuchtzeitraum: Gesamtwurfzahl: Verteilung der Wurfzahlen: Wurfzahl/Zuchtweibchen: Geborene Junge: Jungtiere/Wurf: Aufgezogene Junge: Aufgez. Jungtiere/Wurf: Absolute Verluste: Relative Verluste: Zwischenwurfzeiten: Verteilung der Zwischenwurfzeiten:
49 Fellfarben schwarz agouti albino
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